维生素A测定法

1 附录 VII J 维生素 A 测定法 本法是用紫外-可见分光光度法（附录 IV A）或高效液相色谱法（附录 VD） 测定维生素 A 及其制剂中维生素 A 的含量，以单位表示，每单位相当于全反式 维生素 A 醋酸酯 0.344µg 或全反式维生素 A 醇 0.300µg。 测定应在暗室中进行。 一、紫外-可见分光光度法 由于维生素 A 制剂中含有稀释用油和维生素 A 原料药中混有其他杂质，采 用紫外-可见分光光度法测得的吸光度不是维生素 A 独有的吸收。在以下规定的 条件下，非维生素 A 物质的无关吸收所引入的误差可以用校正公式校正，以便 得到正确结果。 校正公式采用三点法，除其中一点是在吸收峰波长处测得外，其他两点分别 在吸收峰两侧的波长处测定，因此仪器波长应准确，故在测定前，应对仪器波长 进行校正。 检查法 取供试品适量，精密称定，加环己烷溶解并定量稀释制成每 1ml 中含 9～15 单位的溶液，照紫外－可见分光光度法（附录 IV A），测定其吸收峰 的波长，并在下表所列各波长处测定吸光度，计算各吸光度与波长 328nm 处吸 光度的比值和波长 328nm 处的 E1％1cm值。 波长/nm 吸光度比值 波长/nm 吸光度比值 300 316 328 0.555 0.907 1.000 340 360 0.811 0.299 如果吸收峰波长在 326～329nm 之间，且所测得各波长吸光度比值不超过表 中规定的±0.02，可用下式计算含量： 每 1g 供试品中含有的维生素 A 的单位＝E1％1cm（328nm）×1900 如果吸收峰波长在 326～329nm 之间，但所测得的各波长吸光度比值超过表 中规定值的±0.02，应按下式求出校正后的吸光度，然后再计算含量： A328（校正）＝3.52（2A328－A316－A340） 2 如果在 328nm 处的校正吸光度与未校正吸光度相差不超过±3.0％，则不用 校正吸光度，仍以未经校正的吸光度计算含量。 如果校正吸光度与未校正吸光度相差在－15％至－3％之间，则以校正吸光 度计算含量。 如果校正吸光度超出未校正吸光度的－15％至－3％的范围，或者吸收峰波 长不在 326～329nm 之间，则供试品须按下述方法测定。 另精密称取供试品适量（约相当于维生素 A总量 500 单位以上，重量不多于 2g），置皂化瓶中，加乙醇 30ml 与 50％（g/g）氢氧化钾溶液 3ml，置水浴中煮 沸回流 30 分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水 10ml 冲洗冷凝管内部管壁，将皂化 液移至分液漏斗中（分液漏斗活塞涂以甘油淀粉润滑剂），皂化瓶用水 60～100ml 分数次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚振摇提取 4次，每次 振摇约 5 分钟，第一次 60ml，以后各次 40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每 次约 100ml，洗涤应缓缓旋动，避免乳化，直至水层遇酚酞指示液不再显红色， 乙醚液用铺有脱脂棉与无水硫酸钠的滤器过滤，滤器用乙醚洗涤，洗液与乙醚液 合并，置 250ml 量瓶中，用乙醚稀释置刻度，摇匀；精密量取适量，置蒸发皿内， 微温挥去乙醚，迅速加异丙醇溶解并定量稀释制成每 1ml 中含维生素 A9～15 单 位，照紫外－可见分光光度法（附录 IV A），在 300nm、310nm、325nm 与 334nm 四个波长处测定吸光度，并测定吸收峰的波长。吸收峰的波长应在 323～327nm 之间，且 300nm 波长处的吸光度与 325nm 波长处的吸光度的比值应不超过 0.73， 按下式计算校正吸光度： A325（校正）＝6.815A325－2.555A310－4.260A334 每 1g 供试品中含有的维生素 A 的单位＝E1％1cm（325nm，校正）×1830 如果校正吸光度在未校正吸光度的 97％～103％，则仍以未经校正的吸光度 计算含量。 如果吸收峰的波长不在 323～327nm 之间，或 300nm 波长处的吸光度与 325nm 波长处的吸光度的比值超过 0.73，则应自上述皂化后的乙醚提取液 250ml 中，另精密量取适量（相当于维生素 A300～400 单位），微温挥去乙醚至约剩 5ml， 再在氮气流下吹干，立即精密加入甲醇 3ml，溶解后，精密量取 500µl，注入维 生素 D 测定法（附录 VII K）第二法项下的净化用色谱柱系统，准确收集含有维 3 生素 A 的流出液，在氮气流下吹干，而后照上述方法自“迅速加异丙醇溶解” 起，依法操作并计算含量。 二、高效液相色谱法 本法适用于维生素 A 醋酸酯原料及其制剂中维生素 A 的含量测定。 检查法 色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂；以正己烷-异丙醇 （997：3）为流动相；检测波长为 325nm；对照品溶液连续进样 5 次，主峰峰面 积的相对偏差不得过 3.0％；系统适用性溶液所得色谱图中维生素 A 醋酸酯 主峰与其顺式异构体主峰分离度应大于 3。 系统适用性溶液制备：取维生素 A 对照品适量（约相当于维生素 A 醋酸酯 300mg），置烧杯中，加入碘试液 0.2ml，混匀，放置约 10 分钟，定量转移置 200ml 量瓶中，加正己烷稀释至刻度，再精密量取 1ml，置 100ml 量瓶中，加正己烷稀 释至刻度。 精密称定供试品适量（约相当于 15mg 维生素 A 醋酸酯），置 100ml 量瓶中， 加正己烷稀释至刻度，再精密量取 5ml，置 50ml 量瓶中，加正己烷稀释至刻度。 另精密称定维生素 A 对照品适量（约相当于 15mg 维生素 A 醋酸酯），置 100ml 量瓶中，加正己烷稀释至刻度，再精密量取 5ml，置 50ml 量瓶中，加正己烷稀 释至刻度。精密量取供试品溶液、对照品溶液及系统适用性溶液各 10µl 注入液 相色谱仪，色谱图，按外标法以峰面积计算，含量应符合规定。 【附注】 （1）甘油淀粉润滑剂 取甘油 22g，加入可溶性淀粉 9g，加热至 140℃，保持 30 分钟并不断搅拌，放冷，即得。 （2）不含过氧化物的乙醚 照麻醉乙醚项下的过氧化物检查，如不符合规定， 可用 5％硫代硫酸钠溶液振摇，静置，分取乙醚层，再用水振摇洗涤 1 次，重蒸， 弃去首尾 5％部分，馏出的乙醚再检查过氧化物，应符合规定。 （3） 若维生素 A 对照品中含有维生素 A 醋酸酯顺式异构体，则可直接用作系 统适用性分离度考察，不必再做破坏性实验。