银杏内酯对大鼠局灶性脑缺血的保护作用

中 国 药 科 大 学 学 报 Journal of China Pharmaceutical University 2001，a2(2)：1 41～ l 45 1 4l 银杏内酯对大鼠局灶性脑缺血的保护作用 吴雪丰，王秋娟 ，楼凤昌 (中国药科太学生理学教研室： 植物化学教研室，南京 210009) 摘 要 目的 研究银杏内酯对大鼠局灶性脑缺血的作用。方法 选用中动脉阻塞一再灌模型观测对 匕脑缺 血大鼠给药组和模型组的各项指标。结果 银杏内酯口服能使脑缺血大鼠的神经行为明显改善，脑梗塞面积和脑 含水 量显著降低 ；高、中、低三个 剂量组与缺血模型组相比均有显著性差异。该 药还能 降低缺血后脑组织匀浆中的 MDA、LD台量，提高SOD和GsH活性。脑组织病理切片也证实7该药对神经细胞的保护作用 结论 银杏内酯 对大鼠局灶性脑缺血有保护作用。 关键词 银杏内酯；中动脉阻塞 再灌模型：大鼠；局灶性脑缺血；保护 中豳分类号：R965．1：R972 文献标识码：A 文章编号：l000—5048(2001)02一O1 41-l 7 银杏内酯(Gfnkgolides，Gin)是由银杏植物中 提取的天然产物。它是一类强特异性的血小板活化 因子(platelet activating factor，PAF)拮抗剂，可用于 血淤气滞引起的缺血性脑血管疾病，治疗中风病患 者。PAF及其受体大量存在于脑组织中，脑缺血时 局部PAF浓度增高⋯，它激活血小板，多形核白细 胞(PMN)及内皮细胞，引起内皮细胞结构破坏，血 小板、PMN聚集、粘附，释放 5一羟色胺、自由基、白 三烯类、前列腺素类等血管活性介质及细胞因子。 最终导致细胞内钙离子增加，膜结构破坏，脑组织 微循环及代谢障碍，使得细胞产生不可逆性损害， 乃至死亡[ 。银杏内酯对抗脑缺血的作用已有报 道，在数种动物模型上得到了验证。研究明，银杏 内酯 B能显著降低小鼠电惊厥休克和脑缺血后脑 组织中游离脂肪酸(FFA)含量 及xCd,鼠脑缺血 再灌期脑组织谷胱甘肽过氧化物酶和 Na K—ATP 酶活性的抑制 ]，同时还能降低沙土鼠脑缺血再灌 注90 rain时前脑和中脑FFA含量 ]。然而，在模拟 临床中风的中动脉缺血模型上尚未见到关于银杏 内酯药效学的报道，所以我们采用中动脉阻塞 再 灌模型研究了银杏内酯对大鼠局灶性脑缺血的保 护作用，以期进一步验证银杏内酯的作用极其机 理 。 1 实验 1．1 动 物 SD大鼠，(350±50)g，中国药科大学实验动物 中心。合格证号：苏动质 97004 1．2 药物 银杏内酯原料药(含银杏内酯B 56 ，银杏内 酯 A 30 ，银杏内酯C 2 ～3 ，银杏内酯 G、K 5 ，银杏内酯 J等 0．5 ～l ，总内酯含量 95． 35 )，批号 9501 05，中国药科大学植物化学教研 室提供。 杏 灵 颗 粒 (Xingling granule，Xing)，批 号 990305，每克颗粒含总黄酮 l7．6 mg，总内酯 2．4 mg，上海杏灵科技药业有限公司。 尼膜同(尼莫地平片，Nimotop，Nim)，每片含 药 30 mg，批号CAGFT3，德国拜尔公司。 1．3 试 剂 乳酸测定试剂盒(LA)，批号 20000705；丙二醛 测定试剂盒(MDA)，批号 20000715；超氧化物歧化 酶测定试剂盒(SOD)，批号 20000705；谷胱苷肽测 定试剂盒(GSH)，批号 20000721；考马斯亮兰试剂 盒，批号 20000825，均为南京建成生物工程研究所 产品。 收稿日期 2000-1 0-09 ‘通讯作者T*I：025 3271 32 4 E mail njqlt039@jlonilne·tom 基盘项目 国家新药基盘资助项 目部丹内容(93 67 N 45) 江苏省 三药 重点攻关项目部丹内容(苏科技(2000)357号) 维普资讯 http://www.cqvip.com l 42 中 国 药 科 上 学 学 报 32卷 2 方法及结果 2．1 对局灶性脑缺血 太鼠脑功能、梗塞和脑含水 量的 影响 取雄性 SD大鼠 70只，体重 300～400 g，按体 重随机分为 7组，分别为银杏内酯高剂量组(40 mg／kg)，中剂量组 (20 mg／ks)，低剂 量组 (10 rag／ kg)．阳性对照尼膜同组(1．2 mg／kg)，阳性对照杏 灵颗粒组(24 mg／kg)，假手术组及缺血模型对照组 (均给以等量 0．5 CMC~Na) 于实验前 7 d，每天 ig 1次，第 7天最后一次于缺血前 60min给药。参 考 Longa等人的方法，采用颈内动脉线栓法制备大 鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。大鼠用 1 0 水合 三氯乙醛(3O0 mg／kg)ip麻醉，仰卧恒温手术台上 颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，向外牵引二腹 肌及胸锁乳突肌，由颈总动脉分叉处向头端依次游 离，结扎并剪断颈外动脉的分支：枕骨下动脉和甲 状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉 使其主干游离备用，然后分离颈内动脉，用丝线在 颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动 脉。将尼龙线(长 4 cm，直径0．28 ram)经颈外动脉 主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进 ，以颈总 动脉分叉处为标记，推进 20 mm左右时感到阻力， 即达到了较细的大脑前动脉内，阻断了MCA的所 有血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣 1 h后，拔出 尼龙线，扎紧动脉残端。缝合皮肤．完成 MCAO导 致局灶性脑缺血一再灌模型。假手术组大鼠麻醉后， 仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞大脑中动脉。 术后 24 h按 Bedcrson的方法对动物的行为缺 陷进行分级评分，标准如下： 0级：丰观察到神经症状；． 1级：提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈 曲 肩内旋，肘外展，紧贴胸壁； 2级：将动物置于光滑平面上．推手术侧肩向对侧移动 时，阻力降低； 3级：动物自由行走时向手术对侧环转或转图； 4级；软瘫，眭体无自发活动 MCAO 24 h后，断头处死大鼠，取出全脑，左右 脑分别切开，称重 在右脑视交叉及其前后各2 mm 处，做冠状切片，脑切片于 1 TTC溶液中避光 37 C孵育 25 min，用眼科镊分离苍白区(梗塞区)和 非苍白区(正常区)．计算梗塞百分比如下： 梗塞百分比( )一苍自区重量／(苍白区重量+非苍白 区重量)×1 00 将染色后的脑组织烘干，对照大脑湿重求出脑 含水量如下： 脑组织含水量( )一(1一齄组织千重／齄组织湿重)× 1 00 Tab 1．Eff~t of$hlkgotide(Gin)0n brain functions．infarction percentage and middle∞ brHl artery oCcl~ion(MCAO)ra 士s， =J0) 。P< 0．05， ’。P< 0 0J． 。。。P< 0．001 MCAO modell。P< 0 05，。。， < 0 0J，⋯ P< 0．001地 sham operateiNIm (Nimotop)}Xing (Xi~]ing~anule，‰ tant 17，6 mg ginkgo flavonolds and 2 4 mg Gin per gram) 由表 l可知，ig银杏内酯 10，20，40 mg／kg能 使 MCAO大鼠的脑卒中评分降低，MCAO梗塞范 围缩小，脑组织含水量减少，其作用强度与杏是颗 粒比较无明显差异” 。 2．2 对局灶性脑缺血大鼠生化指标的影响 取雄性大鼠70只(300～400 g)，分组给药，手 术方法如前。MCAO 24 h后，大鼠断头处死，取脑， 去除小脑。将大脑用生理盐水制成 1 0 匀浆，按南 京建成生物工程研究所提供的试剂盒，测定 大脑组织中的超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽 (GSH)．丙二醛(MDA)和乳酸(LA)等的含量 维普资讯 http://www.cqvip.com 2期 吴雪丰等 银杏内酯对大鼠局灶性脑缺血的保护作用 1 43 Tab Z Eff=ets of Gin 0n the biochemical indJe：~,0f f0caI ischemic fab。brain homogeRate(r土 ， —l0) ⋯ P< 0．001 V6" Ⅶ operate P< O 001 MCAOm0ddl△P< 0．05， e< O nl， △ P< 0．0011 MCAO+Xingl。 < 0 05．0。P< 0、01 由表 2可见银杏内酯可使局灶性脑缺血大鼠 再灌注损伤的脑组织内的 MDA，LA等含量降低， 表明组织缺血缺氧和过氧化程度受到明显抑制；同 A 时SOD和 GSH含量增加，反映了药物对机体抗氧 化能力和清除自由基的能力有提高。其作用与杏灵 颗粒比较无显著性差异 B C h蛐 一OperatetA )；MCAO modeltB J}MCA0十 ul几L u rag／ 】(c) Fig 1．Protective eH b of Gin On focal isehemia of rat(pathological slices×200 2．3 砷局灶性脑缺血大鼠脑组织学的影响 的核深染，核固缩，核溶解，核体不规则，并见明显 取雄性大鼠35只(300~400 g)，分组给药，手 软化灶形成 术方法如前 MCAO后 24 h断头处死大鼠，取出全 银杏内酯口服三个荆量组 大脑皮质锥体细胞 脑于 1O％甲醛溶液中固定。标本于腊制模具中切 和脑实质神经细胞的核固缩、核溶解程度比缺血对 片后作 H．E，染色，对大脑皮层海马进行病理组织 照组明显减轻，软化灶减少。其中高剂量效果比较 学检查。结果如下所示： 显著．而低剂量组的效果不明显。 假手术组：各例脑组织神经元及胶质细胞正 奋灵颗粒对照组和尼膜同对照组也对脑缺血 常，核膜清楚，核仁明显，未见神经变性、坏死及炎 造成的脑组织损伤有明显保护作用。 细胞浸润等明显病理改变 ，． ，。 缺血模型组：各倒脑组织均见神经元结构模 ” 糊，胞体肿胀，尼氏小体减少或消失，出现不同程度 我们采用l~nga s颈内线栓法加以改进制备大 维普资讯 http://www.cqvip.com 1 44 中 国 药 科 大 学 学 报 32卷 脑中动脉阻塞一再灌模型，损伤小，稳定性高，方法 比较可靠，是国内外 90年代以来逐渐广泛使用的 方法 结果表明，银杏内酯 po 10，20，40 ms／ks连续 7 d可剂量依赖性地改善中动骈=闭塞所致局灶性脑 缺血大鼠的神经功能，明显缩小梗塞面积、减轻脑 水肿；该药还可剂量依赖性地显著降低中动骈=闭塞 大 鼠大脑组织中的丙二醛(MDA)和乳酸(LA)含 量+增加超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱苷肽(GSH) 含量。病理切片也表明银杏内酯可明显改善局灶性 脑缺血下大鼠的脑代谢；维持脑缺血状态下神经细 胞的正常形态和功能，延缓、减轻其坏死。 很多均表明，脑缺血后病理生理改变有诸 多因素参与，如能量代谢耗竭、兴奋性氨基酸毒性、 细胞内钙超载、毒性氧自由基产生、酸中毒、花生四 烯酸产生等。这些不利因素是导致神经元损伤的主 要原因 ]。银杏内酯具有强大的PAF拈抗作用。据 报道 ．外源性 D—Asp负载后，银杏内酯 B能抑制其 在缺血再灌时大鼠海马区的ca”一依赖性 PAF释 放 ]，抑制沙土鼠脑缺血再灌注后 PKC的激活， 抑制 2～10 m0l／L PAF所导致的多种神经瘤细胞 内can斗浓度增加『l 尤其重要的是作为特异性 PAF拮抗剂，银杏内酯B从形态学上改善 Glu．海 人藻酸对原代培养的大 鼠大脑皮层神经细胞损 伤 tz．J s]。而我们的试验采用缺血一再灌模型重点研 究氧自由基对脑组织的损伤。脑缺血后，尤其是缺 血 再灌期 ，生成大量氧自由基(oR)和脂质过氧化 物(LP)，也是造成神经元损伤的重要因素 。我们 测定的脑匀浆生化指标表明，银杏内酯给药组可以 降低 LA，MDA含量，即降低脑脂质过氧化速率；同 时升高 SOD．GSH的含量，加快对组织超氧阴离子 自由基。一的清除。银杏内酯对脑缺血的保护作用 还与其显著的抗组织氧自由基作用密切相关，这一 点在国内外文献中尚未见报道 。 参 考 文 献 [】] 方思伟(FangSW'．李麟仙(Li LX)，王子灿(Wang ZC)等．抄 土鼠厦大鼠局部脑魄血时血小板活化因子的变化_J]．中国 病理生理杂 蠡(c L P,~Fm )，1 999．15(5)：392 394． [2] 王 伟(Wang W)．董为伟(Dong WW) 脑缺血病理损伤过 程中的活性升质PAFEJ]．国外匪学 神垃病学神垃外科学分 册 (Fo-e~ 船 舶 啪 啷 _蜥 ＆ eIrr )-1蛐 5，5： 237．24l [3] Birele DL．Kurian P Platelet—activating factor antagonist BN 5202l“c a~umulation of fr polyuRsat~3ted fatty acj‘l in mot蟮e tirain during i~hemia and f ，l988，s1：1 900 I905 shock[J] [43 汪红性(Wang HY)，王瑜(Wang Y)，赳晓宁(Zhao XN) 银杏 叶提取物对宴验小鼠脑驶血的防护作甩lJ]．中国中药杂志 “ ，c’ l删 Mc~erza )，【999，23(3)：l69 1 71 [5] Panetta T．Mar~ lli VL．Bmquet P， Effoets of aIfiatelet activating factor antagonist (BN52021) on free fatty"acids， diaeycly~txls．．polyph0s口h0ln珊Id and blood flow in the ~rbll brain·inhibition of isehemia-reperfu~ indued⋯ h珀】Injur)' [口． m％ s 一 ．】987，1g9：580 593 [6] Bedezson JB，PRn LH．n M， at Rat middle e~ehral itl-teF)． ot~lumlon 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对抗海人藻酸神经毒性的作用[J] 南通医学院学报( n^ ～ 雌 Nank~j)，2000 gO(1)：13 15． 维普资讯 http://www.cqvip.com 2期 吴雪丰等：银杏内酯对大鼠局灶性脑缺虬的保护作用 145 Protective Effect of Ginkgolides on Rat Focal Brain Ischemia wu Xue—Feng，WANG Qiu—Juan，LOU Feng—ctIan g1 旆 of 蛔 ； Dwision of Ph41tochemistry．China Ptarrmaceutical Univer．sity，Na~jing 210009，China ABSTRACT AIM The aim is to study the possible effects of Ginkgolides on rat focal brain ischemia． MEI1{0DS The model of rat focal brain ischemia was made through middle cerebral artery occlusion—reperfusion and several indices was measured． REsuIJ1 Ginkgolides (po)could significantly improve the behavior of ischemic rats and markedly decrease their infarction percentage＆ water content．There was sisnificant difference between the three dosages groups and the contro1．The drug could also decrease the M DA．LA concentration and increase the S0D ．GSH activity in rats brain homogenate at the 8alne time． The pathological slices also proved its protective effect on neuron cells． CONCLUSION Ginkgolides have a mar ked prospective activity on rat focal brain ischemia． KEY W 0RDS Ginkgolides ：Middle cerebral artery occlusion—reperfusion model：Rat focal brain isChernia · 会 讯 · 心血管重构，离子通道病变，心律失常及药物治疗(CRIAD) 国际学术研讨会 由中国药科大学主办的 心血管重构，离子通道病变， L-律失常及药物治疗国际学术研讨会”将于 2001年 9月 25～27 目在中国南京举行。 人类心血管系统潜在地遭受着先天性及环境因素的袭击。在心血管疾病的发展进程中．心脏及血管的重构是多种心血 管疾病中最重要的机制，亦是研制新药中药效的主要靶子。临床上，药物治疗心脏病及糖尿病亦着重于消退心血管重掏。在 进入新世纪之际，对具有潜在危险因子人群应子 很好的医疗和医药监护。 会议主要内容： 1．心脏重构 ，离子通道病变，缺血性病损，心律失常及高血压病t 2．心血管重掏：由高血压病及甲状腺疾病等引起} 3．药物研究开发，中药及当代西药 4．临床治疗 ：对各类心脏病、糖尿病、心脏重构及血管重构的相关临床表现治疗。 会议征集，说明如下： i．会议论文用英语撰写，应符合 Drug Development Research投稿须知的要求。 2．研讨会论文将在美国核心期刊Drug Development Re~e,arch特辑上发表． 3．论文截止时问：2001年 7月 25目． 联系地址：(20009)南京 中国药科大学 076信箱 CRIAD国际研讨会 联系人：戴簿哉教授 电话：86／25／3271270，3271516，3271423 传真 ：86／25／3313027，321361l E—mail：dezaJ — dai@hotma J1．com 维普资讯 http://www.cqvip.com