HPLC法测定全血中秋水仙碱

418 中国卫生检验杂志 2006年4月 第 16卷 第4期 Chinese Journal of Health Laboratory Technology，Apr 2006；Vol 16 No 4 【论著】 HPLC法测定全血中秋水仙碱 陈晓红，李小平，姚浔平 (浙江省宁波市疾病预防控制中心，浙江宁波 315010) [摘要] 目的：建立测定全血中秋水仙碱的简便、灵敏、准确的高效液相色谱二极管阵列(DAD)检测方法 方法：全血样 品经 1％ 三氟醋酸乙腈溶液提取后，用Waters Oasis@ MCX小柱进行净化，在 ZORBAX Eclipse XDB—c8柱(150 mm X 2．1 mm x5 m)上以乙腈+0．04％三氟醋酸(23+77)为流动相，二极管阵列(DAD)紫外 245 am检测，柱温 35℃，外标 法定量。结果：秋水仙碱在0．50—50．0 ms／L范围内均具有良好的线性，血样中定量检出下限为0．10 nq-s／L，方法回收率 为 88．1％一101．9％，RSD小于 10％。结论：该方法的建立具有灵敏度高、操作简便、快速、准确，适用于中毒病人的中毒 诊断。 [关键词】 全血；秋水仙碱；高效液相色谱；二极管阵列 [中图分类号] 0657．7 2 [文献标识码] A [文章编号] 1004—8685(2006)04 —0418—03 Determination of colchicine in whole blood by HPLC Chen Xiao一， ， ，Li Xiao-ping，Yao Xun-ping (Ningbo Municipal Center for Disease Control and Prevention，Ningbo 315010，China) [Abstract] 0bjeetlve：To establish a simple，sensitive and accurate method for the determination of colchicine in whole blood bv HPLC—DAD．Methods：After colchicine in whole blood was extracted by 1％ Trifluoroacetic—Aeetonitrile．the sample was cleaned with solid phase extraction using Oasis@ MCX cartridges and the colchicine Was separated on ZORBAX Eclipse XDB— C8 column(150 mm x 2．1 mm x 5 m)with DAD detection at 245 am by using the mobile phase consisting of Acetonitrile (23％)and 0，04％ Trifluoroacetic(77％)．The column temperature WSS controlled at 35℃．Results：Calibration curve was linear within the ran ge of 0．50—50．0 mg／L and tIle limit of quantification was found to be 0．10 mg／L Th e extraction recovery Was be． tween 88．1％ ～101．9％ ．the月．sD was less than 10％ ．Conclusion：rI'his method is sensitive．fast and accurate for determination of Race colchicine in whole blood and can be used in the diagnosis of the clinical poisoned patients． 『Key words] whole blood；Colchicine；HPLC—DAD 秋水仙碱作为抗痛风药物在临床应用已多年，它作为抗 肿瘤药，尤其是对乳腺癌有较好的疗效，但是如果摄入过多就 会引起中毒。成人一次食入 0．1—0．2 mg的秋水仙碱即可引 起中毒。一旦中毒，便会出现咽干、烧心、口渴、恶心、呕吐、腹 痛、腹泻等症状，严重者可出现血便、血尿或尿闭等现象，如果 一 次食入 20 mg的秋水仙碱就可致人死亡。目前在药物中测 定秋水仙碱大都采用电化学法、荧光光度法以及HPLC—UV 检测法 ，但对于生物样品的检测国内还未见报道。本文 采用乙腈+0．04％三氟醋酸(23+77)为流动相，二极管阵列 (DAD)紫外 245 nm检测，高效液相色谱法测定全血中的秋水 仙碱，取得了满意的结果，具有简便、快速、准确的优点。 1 材料与方法 1．1 试剂 乙腈为HPLC级(Merck，Darmstadt，Germany)；三氟醋酸 为AR级(Merck，Darmstadt．Germany)，所有的溶剂使用前均用 [作者简介] 陈晓红(1967一)。女，在职硕士，副主任技师，主要 从事理化检测研究。 0．45 m滤膜过滤。秋水仙碱(含量>97．0％，Sigma公司)； 标准贮备液(1．0 mg／m1)：准确称取 10．0 mg秋水仙碱标准于 1O mI容量瓶中，用少量甲醇溶解后，并用甲醇定容至刻度；实 验用水均来自Milli—Q纯水系统；空白全血(采自健康人静 脉，经肝素抗凝)；Oasis@ MCX固相萃取小柱(3 ml／60 mg，美 国 Waters公司)。 1．2 仪 器 Agilentl 100 seriesMSD Trap SL型高效液相色谱 一质谱联 用仪，包括四元泵、在线真空脱气机、DAD检测器、柱温箱、自 动进样器和 ESI源(美国Agilent公司)；YXJ—II高速离心机 (常州澳森电器有限公司)；VORTEX—GENIE 2型旋涡混合仪 (美国)；KQ一2200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公 司)；全玻璃溶剂过滤器(美国Waters公司)；HGC一24型氮吹 仪(天津恒奥科技有限公司)；Milli—Q纯水系统(美国Milli— pore公司)；2 ml的具塞聚四氟乙烯离心管。 l_3 色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB—c8柱(150 mill X2．1 mm x5 m)；流速：0．，mlfmin；柱温：35℃；流动相：乙腈 + 0．04％三氟醋酸(23十77)。 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国卫生检验杂志2006年4月 第 l6卷 第4期 Chinese Journal of Health Laboratory Technology，Apr 2006；Vol 16 No 4 419 1．4 样 品处理 准确取200 血样于 2 ml具寒聚四氟乙烯离心管中，加 入 300 的 1％ 三氟醋酸乙腈溶液，于旋涡混合仪上混合 2 min，超声 10 min，10 000 r／min离心 10 min，吸取上清液于 另一离心管中，再用 300 1％ 三氟醋酸乙腈溶液重复提取 一 次，合并有机相，在40~C水浴上用氮吹仪浓缩至干，用 2 ml 0．05 moL／L HC1溶解后过 Oasis@ MCX固相萃取小柱(预先 以 2 ml甲醇和 2 ml水活化)，相继以 2 ml 0．05 moL／L HC1、 2 ml甲醇和5％ 氨水：甲醇(60：40)淋洗杂质，用 2 ml含 5％ 氨水：甲醇 (10：90)溶液洗脱待测物，洗脱速度控制在 0．5 mL／min以下。收集洗脱液，在4o℃ 水浴上用氮吹仪浓缩 至干，残渣用 1 ml甲醇溶解，涡旋混合，上机自动进样(进样 量为 5 )测定(见图 1)。 ^ |， 2 6 10 时间(rain1 圈l 血样中秋水仙碱色谱圈 2 结果与讨论 2．1 色谱条件的优化 2．1_1 检测波长的选择 利用二极管阵列检测器在线扫描， 扫描波长为200—400 nm，得到秋水仙碱的紫外吸收光谱图 (见图2)，本实验选择检测波长为245 nm。 波长(rim1 圈2 秋水仙碱DAD紫外波长扫描图 2．1_2 色谱柱的选择 本实验试验了XDB CI8、SB Cl8及XDB c (均为 150 mm×2．1 mm×5 I~m)3种色谱柱采用不同比例 的乙腈+0．o4％三氟醋酸为流动相进行分析的情况。结果 明，XDB C 柱对秋水仙碱具有较高的灵敏度，而且峰型尖、对 称性好等优点。 2．1．3 流动相的选择 本文参照文献 选择乙腈水体系作 为流动相，在水相中添加三氟醋酸调节pH，试验了添加不同浓 度的三氟醋酸对检测秋水仙碱的影响，实验表明，添加低浓度 的三氟醋酸不仅能提高灵敏度，而且能有效地改善色谱峰的 拖尾现象。 2．2 进样体系的选择 本文分别用乙腈、甲醇和流动相来配制标准溶液进行测 定，结果显示，用秋水仙碱的乙腈溶液其峰型呈馒头型，且拖 尾。用流动相来配制标准溶液峰尖，但存在一定的拖尾，甲醇 溶液的色谱峰尖且峰型对称。 2．3 全血中的提取条件 秋水仙碱为碱性化合物，根据文献报道提取方法有酸化 提取和碱化萃取两种 ’ ，本实验利用三氟醋酸来沉淀蛋白， 用 1％ 三氟醋酸乙腈溶液进行酸化提取。提取后的样品过固 相萃取小柱进行净化。 2．4 清洗液、洗脱液的选择 提取后的样品过 Oasis@ MCX固相萃取小柱(预先以 2 Tlll甲醇和2 ml水活化)后，依次用0．05 moL／L的HC1、甲醇 和5％ 氨水：甲醇(60：40)进行清洗，除去杂质。由于固相萃 取柱是利用固体吸附剂吸附样品中的目标化合物，使之与样 品基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和 富集目标化合物的目的。为此本文选择酸和碱进行清洗，减 少基体干扰，清洗时为确保目标化合物不被洗下来必须控制 一 定的酸碱浓度。结果显示酸洗时 HC1的浓度不能大于 0．05 moL／L，而碱洗时甲醇的比例不能大于 45％。本文试验 了各种比例的5％ 氨水与甲醇溶液，甲醇比例小于45％ 时， 其洗脱能力为零，随着甲醇比例的增大，其洗脱能力也随之最 大，当甲醇比例达到80％ 时，其洗脱能力为 l0o％，为此，本实 验选用的清洗液甲醇浓度为 40％，洗脱液甲醇浓度为90％。 2．5 方法专属性 准确吸取6份健康人空白全血样品各 200 ，将一定浓 度的秋水仙碱标准溶液加入空白全血中，按 l_4项进行操作测 定，用1 100 seriesMSD Trap SL型高效液相色谱 一质谱联用仪 对色谱峰进行鉴定。结果表明，样品的平均质谱图与秋水仙 碱的标准质谱图完全一致，所获得的色谱图具有高度的专属 性，秋水仙碱的质谱图(见图3)。 10 1 J5 jl--0 。．5 0．0 100 200 300 400 500 m／z 圈3 秋水仙碱标准一级质谮图 2．6 标准曲线和检 出限 准确吸取6份健康人空白全血样品各 200 ，加入一定 量的秋水仙碱标准液，配制成相当于浓度为 0、0．45、0．9o、 4．50、18．00、45．00 mg,／L的秋水仙碱全血样品，按上述条件进 行测定，以秋水仙碱的浓度(X，me,／L)对相应的峰面积(Y)进 行线性回归，得到回归方程及相关系数，Y=88．6X一0．9，r= 0．9992。目标组份在 0．45—45．0 me,／L范围内均具有良好的 线性，按S／N=3，计算检出限为为0．10 me,／L。 2．7 方法的回收率和精密度 分别在6份200 健康人空白全血样品中加入一定量的 标准液，其浓度分别为0．50、5．0o、45．0 me,／L各2份，按上述 方法检测，计算其回收率。每个样本重复测定5次，方法回收 率为88．1％～101．9％，RSD小于 10％，可满足临床检测要求。 2．8 模拟样品测定 在5份 1 ml空白全血样品中加入一定量的标准液，于旋 涡混合仪上混合 2 min，配制成浓度分别为0．20、1．00、3．00、 1 0．00、25．00 me,／L的模拟样品，按上述方法进行测定。每个 (下转第494页) 维普资讯 http://www.cqvip.com 494 中国卫生检验杂志2006年4月第 l6卷 第4期 Chinese Journal of Health Laboratory Technology。Apt 2006；Vol 16 No 4 2 4 药敏试验 详见表 4。 表4 福氏志贺菌4c亚型药敏试验结果 S’：表示敏感；‘R’：表示耐药。 3 讨论 通过以上生化试验、血清学试验、噬菌体裂解试验等特 性，可以证明这是一株志贺菌新菌型，在查阅有关资料 。 和 目前的抗原对照表．以及国外曾有报道 来看，拟命名为福氏 志贺菌4c亚型，该菌型在我省属首次报道。世界各地流行的 菌群，每二三十年发生一次变迁 。群型的划分对调查传染 源，判断复发与再感染，了解流行菌群、菌型的变迁，以及菌苗 制备均有重要意义H 。所以，提醒广大菌种鉴定人员要注意 新菌型的出现。 此次，腹泻患儿起初症状是下腹部持续性钝痛，伴有腹 泻，为黄色稀水样便，每日10余次，无里急后重，无发热，未予 重视。此后，症状加重，大便性状为暗红色果酱样，量不多，每 日6—7次，并伴有低热 38．5~C，大便常规检查有脓细胞、红细 胞。这些起初的不典型症状，提醒基层广大临床工作者，由于 微生物的变异，一些疾病出现了不典型症状，所以在诊疗和检 验中要细心观察，仔细分析，才不至于贻误治疗。 由于细菌为了生存，出现了生化特性的变异。此株细菌 与另两株”。 靛基质、阿拉伯糖试验结果出现异同。这说明在 细菌的鉴定过程中，生化试验不能作为鉴定的单独的依据．必 须结合形态特征、培养特性、血清学特征等综合判断。 通过药敏试验可以帮助临床医师选择效果更佳的药物进 行抗感染治疗，并能了解本地区致病菌耐药性变迁情况。目 前，抗生素耐药性问已成为全球关注的焦点。我国是世界 上滥用抗生素最为严重的国家之一．耐药菌引起的医院感染 人数，已占到住院感染患者总人数的30％ 左右 。此次试验 也不例外，如对治疗菌痢效果比较好的氟哌酸、庆大霉素等都 出现 耐药性，而且氟哌酸试验结果本株与另两株 l¨2 各不相 同。细菌耐药性主要是由耐药性(R)质粒所介导 J。通过耐 药质粒传递的耐药现象在自然界所发生的细菌耐药现象中最 重要，也最多见，在临床上占有重要地位 J。R质粒能使细菌 产生特异酶，可使抗菌药物失效．当微量诱导物如少量抗菌药 存在时，即可产生大量特异酶，增加细菌耐药性。因此，建议 临床使用抗菌药物应遵循以下原则：首先必须确诊为细菌感 染；其次查找感染病原；再次进行药敏试验；根据病原种类，药 敏结果以及药物自身和在人体内作用特点综合选用药物。预 防因为滥用抗菌药物造成更多变异菌株的产生，危害人类生 体健康。 [参考文献] [1]孙勇详，金以森，毛建勋，等 ．福氏志贺菌4c亚型生物学特性研究 ipaH基因检测[J] 中国卫生检验杂志，2005，15(5)：531—532． [2]余玮．一株 F4c型志贺菌的检出[J]．现代预防医学，2003。30 (5)：730—732． [3]何晓晴．卫生防疫细菌检验[M]．北京：新华出版社，1989．226— 673． [4]吴文漪，查祖瑚．传染病学[M]．南京：东南大学出版社，1999． [5]周贵民，张军民．我国细菌耐药性监测应注意的几个问胚[J]．中 华检验医学杂志，2004，27(1)：5—6． [6]孙长贵．细菌对抗菌药物耐药性研究进展[J]．临床检验杂志， 2002，20(特刊)：70—73． (收稿El期：2005—10—3I) (上接第419页) 样本重复测定5次，结果见表l。 表 1 模拟样品测定结果( =5l 3 小结 本文建立的高效液相色谱法二极管阵列检测器测定全血 中秋水仙碱检测方法，它可为临床诊断提供科学的依据。 [参考文献] [1]卞晓岚，翟青，张芳华，等．高效液相色谱法测定复方秋水仙碱胶 囊中秋水仙碱的含量[J]．广东微量元素科学，2004，11(6)：41— 44． [2]于素华，胡教 ，冷宗周 ．碳糊电极阳极伏安法测定秋水仙碱 [J]．药学学报，1997，32(3)：210—212， [3]刘永明，李桂枝．荧光光度法测定片剂中秋水仙碱的含量[】]．分 析化学，2000，28(3)：330—332． [4]张润生，余琛，刘罡一，等．血液中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的 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