RSCA技术应用于HLA_A_B座位高分辨基因分型的研究

�实验研究 � 本栏目由北京万泰生物药业有限公司赞助 RSCA 技术应用于 HLA�A , B座位高分辨基因分型的研究* 邓志辉 � 吴国光 � 张 � 旋 � 周 � 丹 � 高素青(深圳市输血医学研究所,广东深圳 518035 ) � � 摘要:目的 � 采用参比链介导的构象分析( refer ence strand mediat ed conformation analysis, RSCA)技术, 建立新 型、可靠的 H LA�A、B 高分辩基因分型方法,应用于 HL A 基因分型及供、受者组织配型。方法 � 采用一对座位特异 性引物,扩增 H L A�A、B 基因的第 2、3 外显子和第 2 内含子。扩增产物与单链标记荧光物质的参比链按一定比例混 合,经变性、退火反应及脱水处理后,在杂交产物中掺入分子量内参标准物, 用 ABI377 型基因测序仪电泳。用 ABI GeneScan 3. 1 软件分析每一泳道内异源双链波峰的迁移值、峰高及峰面积值, RSCA H LA Typer1. 3 软件分析 HL A 等位基因型。应用本方法 ,对第 13届国际组织相容性协作组( IHW)送检的 20 份盲检, 以及 2 份 HL A 等 位基因型已知的质控样本进行了检测。结果 � 2 份质控 DNA 的检测结果,与已知的 H L A 基因型完全相符; 20 份盲 检样本 H LA�A、B 座位的检测结果, 与 IHW公布的结果完全相同, 准确率达 100%。结论 � RSCA 为新型、高分辨水 平的 HL A 基因分型方法,并且出现模棱两可结果的情况少,分型结果准确、可靠。 关键词:参比链介导的构象分析( RSCA) � H LA�A、B 座位 � 基因分型 � 高分辨率 中图分类号:Q503 � R457� 1+ 1� Q754 � � 文献标识码:A � � 文章编号: 1004�549X( 2005) 04�0296�03 * 基金项目:广东省卫生厅科研基金项目课题(编号 A2001641) � � HLA 分型当前普遍采用以 DNA 为基础的基因分型方 法,如 PCR�序列特异性引物( PCR�SSP )、PCR�序列特异性 寡核苷酸探针杂交( PCR�SSOP )、H LA 基因测序( SBT )等。 随着我国造血干细胞捐献者资料库的建立和临床非血缘关 系骨髓移植的开展,研究和探讨新型、可靠、高通量、高分辩 率的 HL A 基因分型方法具有重要意义。 参比链介导的构象分析( r ef er ence str and mediated con� fo rmation analysis, RSCA )是一种新型的 H LA 高分辩基因 分型方法,与经典的以测序为基础分型方法学不同, 该方法 利用不同 H LA 等位基因与参比链形成的 DNA 空间构象的 差异,采用基因测序仪荧光法检测和相关分析软件进行 HL A 基因分型[ 1~ 3]。笔者对 2002 年第 13 届国际组织相容 性协作组( IHW)送检的 20 份盲检样本, 进行了 HLA�A、B 基因分型,现如下。 1 � 材料与方法 1. 1 � DNA 样本来源 � 20 份盲检考核样本及 2 份 HL A 等 位基因型已知的质控样本, 均由国际组织相关性协作组 ( IHW)提供,每份 DNA的浓度为 100ng/ ml。 1. 2 � 主要试剂及仪器 � RSCAT M A 座位 H LA 分型试剂盒 (批号: RSCA�M�A�001)和 RSCA TM B 座位 HLA 分型试剂 盒(批号: RSCA�M�B�001, 美国 PEL�FREEZ 公司) ; 9700 型 PCR扩增仪及 ABI Pr ismTM 377 型基因测序仪(美国 ABI 公 司)。 1. 3 � PCR 扩增 � 采用一对位点特异性引物, 扩增 HL A�A 、 B 基因的第 2、第 3 外显子及第 2 内含子, PCR 产物为 980bp。反应体系为 50�l, 内含 RSCA amplification buffer 20�l, ddH2O 22. 6�l, HLA�A 座位 5 端、3 端扩增引物各 1�l ( HL A�B 基因扩增:分别加入 B 座位 5 端、3 端扩增引物各 1�l) , T aq 酶( 5U /�l) 0. 4�l, 基因组 DNA ( 100ng/�l) 5�l。 扩增条件为: 98 ! 20s; 96 ! 20s, 68 ! 90s, 35cycles; 72! 5m in; 15 ! 永久保存。 1. 4� RSCA 变性及退火反应 1. 4. 1� 反应体系的组成 � H LA�A 座位: 取 6�lHL A�A 基 因的 PCR 产物,分别与 RSCA TM A 座位试剂盒的 2 种参比 链( 2�l)混合。HLA�B 座位: 取 6�l H L A�B 基因的 PCR产 物,分别与 RSCAT M B 座位试剂盒的 3 种参比链( 2�l)混合。 1. 4. 2 � RSCA 变性及退火反应条件: HLA�A、B 座位的 RSCA∀ 变性及退火反应#条件均为: 95 ! 4min; 55 ! 5min; 15 ! 5m in。 1. 5� 制备电泳样本 1. 5. 1� 脱水 � PCR 产物与每一参比链混合 , 经∀ 变性及退 火反应#形成的杂交产物(包括同源双链、异源双链) , 按等量 的比例重新混合, 然后在真空离心机中脱水。 1. 5. 2� 掺入荧光标记的分子量标准物 � 脱水后的离心管 中,加入 1. 5�l DNA ladder ,同源双链及异源双链溶解于分 子量内参标准物溶液中。 1. 6� 电泳 1. 6. 1 � 制备 6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶 30m l � 取 Long Ranger Gel So lution 3. 6ml, 10 倍的 RSCA 电泳缓冲液 3. 0ml,双蒸水 23. 4ml。上述混合物经过滤、抽气后, 加入 180�l过硫酸铵和 18�l TEMED, 轻轻混匀后,立即倒胶。 1. 6. 2� 设置有关电泳参数 如∀ Run module#及 ∀ Gel pr ef er� ence#, 分别按[ 4, 5]进行。 1. 6. 3� 电泳 � 编制样本表, 在凝胶中加入步骤 1. 5 所制备 �296� 中国输血杂志 2005年 8月第 18卷第 4期 � Chin J Blood T ransfusion, Augu st , 2005, Vol . 18, No. 4 的电泳样本。使用由 Pel�Freez 公司提供的 RSCA 电极缓冲 液,用 ABI Pr ismT M 377 型基因测序仪进行电泳和检测。 HL A�A 、B 基因分型样本的电泳、收集信息需 10h。 1. 7 � 结果分析 � 电泳完毕,采用 ABI GeneScan 3. 1 分析软 件,根据每一泳道中掺入的分子量标准物的片段大小, 计算 每一同源双链波峰、异源双链波峰的迁移值、峰高 ( peak height)及波峰面积 ( peak area ) 等参数。然后应用 RSCA HLA Typer 1. 3 软件, 把每一样本异源双链波峰的迁移值 与 RSCA 数据库所包含的 HL A 等位基因的迁移值逐一进 行比对,确定 HL A 等位基因型。 2 � 结果 20 份盲检考核样本的检测结果见表 1, 其结果与 IHW 公布的结果[2]完全相同, 准确率达 100%。每次实验, IHW 提供的 2 份质控样本的检测结果, 与已知的 H LA 等位基因 型相同。H L A�A 基因扩增产物与参比链形成的同源双链、 异源双链波峰,见图 1 所示。 表 1 � 第 13届 IHW 考核样本的基因分型结果 样本编号 H LA 等位基因型 H LA�A HLA�B RSCA�01 0201, 8001 5703, 5703 RSCA�02 0101, 2901 4006, 5201 RSCA�03 0202, 03011 3501, 5301 RSCA�04 3201, 6601 51011, 7301 RSCA�05 1101, 2403 1502, 5502 RSCA�06 31012, 3301 1402, 3502 RSCA�07 2403, 3303 4601, 1512 RSCA�08 2902, 03011 07021, 4404 RSCA�09 3601, 7401 5301, 5703 RSCA�10 3402, 6802 1510, 4403 RSCA�11 1101, 3402 2705, 8201 RSCA�12 0102, 6601 5801, 5802 RSCA�13 0206, 3002 1801, 3908 RSCA�14 2402, 2901 2702, 0705/ 06 RSCA�15 0205, 6802 1402, 5801 RSCA�16 1101, 2402 2706, 4801 RSCA�17 0211, 68012 3505, 4004 RSCA�18 0206, 1101 3501, 1501 RSCA�19 0216, 03011 5101, 5101 RSCA�20 0201, 0201 3501, 3501 注: IHW提供的 2份质控样本, 质控样本 1的基因型为 H LA�A * 0206, 3001; H LA�B * 3905, 4201, 质控样本 2 的基因型为: H LA�A * 0201, 0301; H LA�B * 0702, 3501 上图: 7号考核样本( H LA�A 基因杂合子)与一参比链形成的 2个异 源波峰;下图: 20号考核样本 ( H LA�A 基因纯合子)与一参比链形 成的 1个异源波峰 图 1 � 2 例考核样本 HL A�A 基因扩增产物与 一参比链形成的异源波峰 3� 讨论 RSCA 技术的原理新颖、独特, 与经典的 PCR�SSP、 PCR�SSOP、SBT 等 DNA 分型方法不同。该技术采用一对 H LA 座位特异性引物, 扩增 H LA�A、B 基因的第 2、第 3 外 显子及第 2 内含子, 全长 980bp。扩增产物与单链标记有荧 光物质的参比链混合, 经特定的变性、退火反应, 结果 DNA 序列完全互补的两条单链重新结合, 形成同源双链( homo� duplex ) ; 而 DNA 序列不完全互补的 2 条单链结合后, 则形 成异源双链( heter oduplex ) , 如参比链的正义链( 5 端标记有 荧光物质)与 HL A�A 或 B 基因扩增产物的反义链结合。 异源双链由于存在链内二级结构, 在非变性聚丙烯酰胺 凝胶中的迁移速率较同源双链慢; 不同的 H LA 等位基因, 其 DNA 序列不同, 与参比链形成的异源双链的空间构象也 存在差异,因而在凝胶中的迁移速率也不一致。通过测定每 一样本的异源双链波峰的迁移值, 将该迁移值与 RSCA 分 型数据库中所包含的 HL A 等位基因的迁移值逐一进行自 动比对, 从而确定受检者的等位基因型。已有研究表明,该 技术可检测出 H L A 等位基因中单个核苷酸差异水平[ 1]。 RSCA 方法的优点在于每人份每个 H LA 座位只需作一 次 PCR 扩增反应,与 PCR�SSP方法相比, 所需的 DNA 量少; 扩增产物与参比链杂交形成的异源双链, 采用基因测 序仪荧光法检测, 灵敏度高;而且在杂交混合物中, 掺入荧光 标记的分子量标准物, 可校正凝胶、同一凝胶不同泳道的差 异,以保证计算异源波峰迁移值的准确性。RSCA 为高分辨 水平的 HL A 基因分型方法,与经典的 SBT 方法相比, 其优 点还在于不存在 SBT 分型中的顺式/反式问题[ 1] , 出现模棱 两可的结果少。笔者使用的 RSCAT M A 座位试剂盒中有 2 种不同的参比链, 而 RSCAT M B 座位试剂盒则有 3 种不同的 参比链; HL A�A 或B 基因的扩增产物经变性后分离, 因而 不存在 SBT 分型中的顺式/反式问题; 不同的 HL A 等位基 因与参比链形成的异源波峰, 其迁移值也不同; 因而可通过 联合采用多种参比链, 来区分 HL A 等位基因。 �297�中国输血杂志 2005年 8月第 18卷第 4期 � Ch in J Blood T rans fus ion, August , 2005, Vol. 18, No. 4 从 RSCA 分型的电泳图谱中可观察到: H LA 纯合子等 位基因型,只有一个异源波峰; 而杂合子一般有 2 个异源波 峰(少数情况下, 一异源波峰与另一异源波峰或同源波峰同 泳,则出现一个波峰, 但峰值较高) , 并且纯合子的异源波峰 的峰高、峰面积值较杂合子异源波峰要高, 根据 RSCA 异源 波峰这一特点,可以清楚地鉴定纯合子、杂合子等位基因型。 同时, 由于 H LA�A、B 基因的 RSCA 分型中的电泳参数如 ∀ r un module#中的∀ electr opho resis voltag e#、∀ elect rophor e� sis curr ent# 、∀ co llection time# 等均相同, 因此, HL A�A、B 基因的扩增产物与参比链杂交形成的杂交产物, 可在同一凝 胶、不同泳道中进行电泳检测, 可得到正确结果。 RSCA技术对实验条件的控制,要求严格。笔者在实验 过程中发现:非变性聚丙烯酰胺凝胶聚合时间的长短, 对结 果有显著影响。在室温条件下, 凝胶聚合时间短(如 2. 5h) , 同源波峰及异源波峰在凝胶中迁移速度偏快, 检测到同源波 峰的实际∀ r un time#值小于标准值。笔者认为凝胶一般在室 温下聚合 5h 后, 使用效果较好。此外, RSCA 试剂盒提供的 膜上样缓冲液是否冲洗干净,对结果也有显著影响。若该上 样缓冲液冲洗不干净, 同源波峰及异源波峰的迁移速度偏 慢,检测到同源波峰的实际∀ run time# 值大于标准值, 也不 能得到正确分型结果。经使用膜梳子上样, 电泳 2 min 后拨 出膜梳子,再用 10ml注射器冲洗膜上样缓冲液, 可得到满意 的结果。 采用 RSCA H LA 分型技术, 对 IHW 送检的考核样本 进行 HL A�A、B 基因分型, 取得了满意的实验结果, 但运用 于常规 H L A 基因分型, 尚有待于进一步完善; ∃ 是 RSCA 分型数据库中所包含的 HL A 等位基因, 需进一步扩大和完 善; % 是解决实验时间特别是电泳时间过长问题 (使用 ABI377 型测序仪, 电泳时间需 10h) ; % 是结果分析尚需进 一步自动化, 若在同一计算机平台下使用 GeneScan、RSCA H LA T yper软件, 结果分析将更为简便。 参 考 文 献 1 � Arguello JR, Lit t le AM, Bohan E, et al. A high r esolu tion HLA class & and clas s ∋matching m ethod for bone mar row donor se� lection . Bon e Mar row T ransplantat ion, 1998, 22(3) : 527 2 � Kalve I, Devit t D , Lit tl e AM, et al. E valuat ion of RSCA as a no� vel, emerging H LA typing m ethod. Available at ht tp: / / www . ih� w c. org / b ook . htm 3 � Daniel S, Ram on J , Rafael Arguello, et al. C ox . Applicat ion of RSCA for the T yping of H LA�DPB1. Hum Immunol, 1998, 59 ( 3) : 734 4 � Pel�Freez Clinical Sys tems, LLC. In st ruct ions for U sing RSCAT M A�Locus H LA Mul ti�Dye Typing Kit . Available at ht tp: / / w ww. pel�f reez. com 5 � Pel�Freez Clinical Sys tems, LLC. In st ruct ions for U sing RSCAT M B�Locu s HLA Mul ti�Dye Typing Kit . Available at ht tp: / / w ww. pel�f reez. com ( 2004�07�21收稿, 2005�04�20修回) 本文编辑:尚 � 云 临床合理用药的宝典 � 医(药)师掌握最新药物信息的必备手册 (药物临床信息参考 2005)隆重出版 � � 近年来药物的研发进展迅速,不仅新上市的药品层出不穷, 而且医院常用药物,甚至国家基本药物中的一些药名在数年 前都闻所未闻,药物研究人员、医生、药师怎样来把握千变万化、日新月异的临床用药信息, 以更好地开展其专业工作, 成为了 一个焦点问题。由国家食品药品监督管理局药品审评中心监制(审稿者汇集了国内第一流的医药专家) , 四川科技出版社出 版的(药物临床信息参考 2005)能有效解决上述难题,这是一本以通用药物为主线编辑的综述性信息参考书,内容侧重药物的 临床应用信息,包括药物名称、组成成分、临床应用、药理、注意事项、不良反应、药物相互作用、给药说明、用法与用量、制剂与 规格 10 个项目, 条目化的编写使其内容清晰明确,便于查阅。该书 2003、2004 版出版后, 发行量已逾数万余册。2005 版新增 28 篇药物专论,删除 37 篇临床已淘汰或不常用的药物专论, 367 篇药物专论有重大更新, 新增 1869 个中英文药物名称, 内容 更加充实、体例更加合理。(中国输血杂志)编辑部代售此书, 定价: 198 元。 另外,本部还代售下列川科版医药卫生新书:(全科医生手册) ( 98 元) ,(实用皮肤病学手册) ( 98元) ,(心理障碍诊治指南) ( 46 元) ,(癫痫治疗学) ( 58 元) ,(MRI原理)( 75 元) , (人体正常超声解剖图解) ( 50 元) ,(医事法学) ( 48元) ,(当代肝胆疾病治 疗学) ( 148 元) ,(中西医结合妇科手册)( 42 元) , (中西医结合儿科手册) ( 34 元) ,(中西医结合抢救内科急重症) ( 38元) ,(病毒 病常用中药药理与临床)( 60 元) , (现代中医治疗学) ( 83元) ,(临床实用方剂手册)( 40 元)。所售书均免费邮寄,需挂号者加 3 元;款到即寄书。购书款请汇至: 610081 成都市北站东一路 73 号 中国输血杂志编辑部 刘晓明 �298� 中国输血杂志 2005年 8月第 18卷第 4期 � Chin J Blood T ransfusion, Augu st , 2005, Vol . 18, No. 4