蛋白定量中文说明书

BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)说明书 产品特点 „ 增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒(Enhanced BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最 常用的两种蛋白浓度方法之一 BCA法改进研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单， 高稳定性，高灵敏度和高兼容性。 „ 灵敏度高，检测浓度下限达到 10μg/ml，最小检测蛋白量达到 0.2μg，待测样品体积为 1-25μl。 „ 在 20-2000μg/ml浓度范围内有较好的线性关系（如图 1）。 y = 0.1378x - 0.1006 R2 = 0.99 0 0.3 0.6 0.9 1.2 0 2 4 6 8 1 BSA (mg/ml) A b va lu e( 57 0n m ) 0 图 1; 用该试剂盒检测 0.5-10mg/ml不同浓度BSA 曲线，R2>0.99. „ BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达 5% 的 SDS，5%的 Triton X-100，5%的 Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂 的影响，需确保 EDTA 低于 10mM，无 EGTA，二硫苏糖醇低于 1mM，β-巯基乙醇低 于 0.01%。不适用 BCA法。 包装 产品编号 产品名称 包装 YY0012-1 BCA试剂 A 100ml YY0012-2 BCA试剂 B 3ml YY0012-3 蛋白标准(5mg/ml BSA) 1ml — 说明书 1份 保存条件： BCA试剂 A和 B室温保存，蛋白标准请-20℃冻存。本试剂盒自订购之日起一年内有效。 注意事项： „ 需酶标仪一台，测定波长为 540-595nm之间，562nm最佳。需 96孔板。如果没有酶标 仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但测定时，需根据比色皿的最小检测体积，适 当加大 BCA工作液的用量使不小于最小检测体积，样品和标准品的用量可相应按比例 放大也可不变。使用分光光度计测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量可能 会显著减少。 „ 如发现样品稀释液或裂解液本身就有较高背景，请试用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒 或其他蛋白定量试剂盒。 „ 为了加快 BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热，但是切勿过热。 „ EDTA浓度必须小于 10mM，不兼容 EGTA。不适用 BCA法时，请试用 Bradford蛋白 浓度测定试剂盒或其他蛋白定量试剂盒。 ^_^ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1. 根据样品数量，按 50体积 BCA试剂 A加 1体积 BCA试剂 B(50:1)配制适量 BCA工作液， 充分混匀。BCA工作液室温 24小时内稳定。 2. 完全溶解蛋白标准品，取 10微升稀释至 100微升，使终浓度为 0.5mg/ml。蛋白样品在什 么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀 释。但是为了简便起见，也可以用 0.9%NaCl或 PBS 稀释标准品。 3. 将标准品按 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升加到 96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的 溶液补足到 20微升。 4. 加适当（<20 微升）体积样品到 96 孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到 20 微 升。 5. 各孔加入 200微升 BCA工作液（试管法检测 BCA工作液体为 2毫升），37℃放置 30分 钟。 注：也可以室温放置 2小时，或 60℃放置 30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长 不断加深。并且显色反应 会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时 间。 6. 测定 A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 测定方法 A. 试管法： 1. 据样品的数目和蛋白质的浓度，按每个反应使用 0.5ml Solution A, 0.01ml Solution B准备 A+B混合液：50份 Solution A + 1份 Solution B，混匀后使用。该混合液需要在 24小 时内用完。注意：每个测定要做 2-3个平行反应，即每个样品需要 1.5ml Solution A和 0.03ml Solution B。注意：本处采用的比色体系需要用 0.5ml的比色杯；如果没有 0.5ml 比色杯，反应体系需要放大到实验将采用的比色杯准确读数所需要的体积。 2. BSA标准品和样品的准备：样品用水或其它不干扰显色反应的缓冲配置，使待测定的浓 度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备 3个平行测定。标准曲线一般 5-6个点即可， 根据 样品的浓度确定各点的具体浓度。稀释 BSA时,可以用水，最好采用与样品一致 或近似的溶液。如待测定的浓度为 200μg/ml左右，按下的次序加入 BSA标准或样品 及 Solution A+B混合物，混匀。 管 1 管 2 管 3 管 4 管 5 管 6 管 7 待测样 品 稀释 1 待测样品 稀释 2 BSA (μl) 0 2.5 5 10 15 20 25 25 25 H2O (μl) 25 22.5 20 15 10 5 0 0 0 Mix(A+B)(μl) 500 500 500 500 500 500 500 500 500 OD562 OD562平均值 Con (μg/ml) 0 50 100 200 300 400 500 未知样品浓度可以从标准曲线中查得, 实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。 3. 可以在 1.5ml Eppendorf管内做反应。在管壁上依次标上序列号，按上表加样品，注意： 每次反应都需要做一个和未知样品溶液相同的空白做对照。 4. 保温。对于蛋白质在 20ug-500ug/ml采用标准反应：37度保温 30分钟；对于 5-20μg/ml 采用增强法反应：60度保温 30分钟。注意：保温前需要将离心管盖盖上。 5. 保温结束后，取出反应管，冷却到室温。 6. 测定 562nm的光吸收。注意：OD值的测定需要在保温接受后一小时内完成。60度保温 结束后需要离心将盖子上的水蒸汽收集到管内。 7. 标准曲线的绘制。注意：数据处理时需要去除明显错误的值。未知样品浓度可以从标准 曲线中查得, 实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。如果是计算机绘制得曲线，可以从计算 机给出的线性方程式计算出未知样品的浓度。注意：实际操作时不必每次都做标准曲线， 可以做一两个标准样品，和标准曲线比较得出浓度系数。未知样品的实际浓度=从标准曲 线中得到的浓度*浓度系数。 B. 96孔板法： 1. 据样品的数目和蛋白质的浓度，准备 37C或 60C恒温箱；按每给反应使用 200ulSolution A, 4ul Solution B准备 A+B混合液：50份 Solution A + 1份 Solution B，混匀后使用。该混 合液需要在 24小时内用完。注意：每给测定要做 2-3个平行反应，即每个样品需要 0.6ml Solution A和 0.012ml Solution B。 2. BSA标准品和样品的准备：样品用水或其它不干扰显色反应的缓冲配置，使待测定的浓 度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备 3个平行测定。标准曲线一般 5-6个点即可， 根据样品的浓度确定各点的具体浓度。稀释 BSA时,可以用水，最好采用与样品一致或近 似的溶液。如待测定的浓度为 200μg/ml左右，按下表的次序加入 BSA标准或样品及 Solution A+B混合物，混匀。 孔 1 孔 2 孔 3 孔 4 孔 5 孔 6 孔 7 待测样品 稀释 待测样品 稀释 2 BSA (μl) 0 2.5 5 10 15 20 25 25 25 H2O (μl) 25 22.5 20 15 10 5 0 0 0 Mix(A+B)(μl) 200 200 200 200 200 200 200 200 200 OD562 OD562平均值 Con (μg/ml) 0 50 100 200 300 400 500 未知样品浓度可以从标准曲线中查得, 实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。 3. 在每个孔中加入 25ul样品，然后加入 200ul A+B混合液,盖上盖子混合 30秒。 4. 盖上盖子，37度保温 30分钟。 5. 冷却到室温， 6. 测定 562nm的光吸收。注意：OD值的测定需要在保温接受后一小时内完成。 7. 标准曲线的绘制。注意：数据处理时需要去除明显错误的值。未知样品浓度可以从标准 曲线中查得, 实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。如果是计算机绘制得曲线，可以从计算 机给出的线性方程式计算出未知样品的浓度。注意：实际操作时不必每次都做标准曲线， 可以做一两个标准样品，和标准曲线比较得出浓度系数。未知样品的实际浓度=从标准曲 线中得到的浓度*浓度系数。 常见问题： 1. 是否每次测定时都需要做标准曲线？ 建议每次测定时都做标准曲线。因为 BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并 且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则如需精确 测定宜每次都做标准曲线。 2. 测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加吸光度或颜色没有明显变化。 可能的原因是样品中含有严重干扰 BCA 法测定蛋白浓度的物质，详细的 BCA 法的兼容 性. Text1: 上海麦莎生物科技有限公司