质谱法分析肠道病毒71型疫苗原液的主要蛋白成分_高帆

·论　著· 质谱法分析肠道病毒７１型疫苗原液的主要蛋白成分 高帆１，毛群颖１，张军楠１，秦文彦２，姚昕１，吴星１，王一平１， 邵杰１，王轩１，徐苗１，梁争论１ １．中国食品药品检定研究院 卫生部生物技术产品检定方法及其化重点实验室，北京　１０００５０； ２．北京博奥生物有限公司，北京　１０２２０６ 摘要：目的　采用质谱法对我国２家进入临床试验肠道病毒７１型 （ＥＶ７１）灭活疫苗的主要蛋白成分进行 分析和比较，为完善ＥＶ７１疫苗的质控方法提供实验依据。方法　应用梯度ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法对２家生产自 Ｖｅｒｏ细胞的ＥＶ７１疫苗原液 （Ａ、Ｂ原液）进行蛋白电泳分析，蛋白条带经切胶回收、脱色、胰酶酶切后 提取蛋白多肽，采用液质联用仪 （ＬＣ／ＭＳ）对回收的各条带蛋白多肽进行二级质谱序列测定。采用酶联免 疫法 （ＥＬＩＳＡ）和二喹啉甲酸法 （ＢＣＡ）分别检测浓缩后的疫苗原液中ＥＶ７１抗原含量和总蛋白含量，计 算比活值。结果　将原液浓缩１０余倍后经梯度ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析，抗原Ａ为４条带，抗原Ｂ为６条带。 采用质谱法检测各条带蛋白并搜库分析发现，各条带均含有ＥＶ７１多聚蛋白；抗原 Ａ条带１、３和抗原Ｂ 的条带１、３、４、５、６含有猴源蛋白。经ＰＳＭｓ（鉴定多肽次数）计算发现ＥＶ７１蛋白占总蛋白比例分别为 ９６．７％和９５．０％，比活值为８６５．５、２９１．８Ｕ／μｇ。结论　质谱法可作为疫苗中蛋白检测的辅助方法，并考 虑在多批次检测的基础上提出限量要求，为疫苗质量的一致性提供保障。 关键词：肠道病毒７１型 （ＥＶ７１）；疫苗；蛋白；质谱 （ＭＳ） 中图分类号：Ｒ３７３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：２０９５－０１３６ （２０１３）０６－０４１０－０４ Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍａｊｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｄｏｍｅｓｔｉｃ　ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ　７１ ｖａｃｃｉｎｅ　ｂｕｌｋｓ　ｂｙ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ ＧＡＯ　Ｆａｎ＊，ＭＡＯ　Ｑｕｎ－ｙｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｊｕｎ－ｎａｎ，ＱＩＮ　Ｗｅｎ－ｙａｎ，ＹＡＯ　Ｘｉｎ，ＷＵ　Ｘｉｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｙｉ－ｐｉｎｇ， ＳＨＡＯ　Ｊｉｅ，ＷＡＮＧ　Ｘｕａｎ，ＸＵ　Ｍｉａｏ，ＬＩＡＮＧ　Ｚｈｅｎｇ－ｌｕｎ ＊Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｆｏｒ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ　ｆｏｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　Ｑｕａｌｉｔｙ　ａｎｄ　Ｓｔａｎｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００５０，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＬＩＡＮＧ　Ｚｈｅｎｇ－ｌｕｎ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｚｈｅｎｇｌｕｎ＠１２６．ｃｏｍ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｄｏｍｅｓｔｉｃ　ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ　７１ （ＥＶ７１）ｖａｃ－ ｃｉｎｅｓ（Ａ　ａｎｄ　Ｂ）ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ　ｔｈａｔ　ｈａｖｅ　ｅｎｔｅｒｅｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｔｒｉａｌｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎ－ ｔｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ＥＶ７１ｂｕｌｋｓ（ａｎｔｉｇｅｎ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ）ｆｒｏｍ　Ｖｅｒｏ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｗｏ　ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｇｒａ－ ｄｉｅｎｔ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂａｎｄｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｔ，ｅｘｔｒａｃｔｅｄ，ｄｅ－ｃｏｌｏｒｅｄ，ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅｓ， ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ．Ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＬＣ／ＭＳ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｔｈｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎ－ ｔｒａｔｅｄ　ｂｕｌｋ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＥＬＩＳＡ　ａｎｄ　ＢＣＡ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｃａｌｃｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｂｕｌｋ　ｗａｓ ｆｉｒｓｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ　ａｂｏｕｔ　ｔｅｎ　ｆｏｌｄｓ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｗｈｉｃｈ　ｓｈｏｗｅｄ　４ｂａｎｄｓ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｇｅｎ　Ａ　ａｎｄ ６ｂａｎｄｓ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｇｅｎ　Ｂ．Ａｌｌ　ｂａｎｄｓ　ｃｏｎｔａｉｎ　ＥＶ７１ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ；ｂａｎｄ　１，３ｉｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　Ａ　ａｎｄ　ｂａｎｄ　１，３，４，５，６ｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ　Ｂ　ｃｏｎｔａｉｎ　ｍｏｎｋｅｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＥＶ７１ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｏ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　９６．７％ｉｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　Ａ ａｎｄ　９５．０％ｉｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　Ｂ；ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　８６５．５ａｎｄ　２９１．８ｉｎ　ａｇｔｉｇｅｎｓ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ－ ｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｍａｙ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｒｅｓｉｄｕａｌ　ｈｏｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ａ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　ｖａｌｕｅ ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｓｅｔ　ａｆｔｅｒ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｂａｔｃｈｅｓ　ｆｏｒ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ　７１ （ＥＶ７１）；Ｖａｃｃｉｎｅ；Ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ 基金项目：国家高技术研究发展 （８６３计划）（２０１２ＡＡ０２Ａ４０２） 作者简介：高帆，硕士，助理研究员，主要从事疫苗质量控制、评价及研究工作 通讯作者：梁争论，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｚｈｅｎｇｌｕｎ＠１２６．ｃｏｍ ·０１４· 中国病毒病杂志２０１３年１１月第３卷第６期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｖｉｒａｌ　Ｄｉｓ，Ｎｏｖ　２０１３，Ｖｏｌ．３Ｎｏ．６ 　　手足口病 （ＨＦＭＤ）是一种可由多种肠道病 毒引起，导致５岁以下婴幼儿出现手、足、口部疱 疹、皮 疹 的 传 染 性 疾 病［１］，肠 道 病 毒 ７１ 型 （ＥＶ７１）是其主要病原体之一，ＨＦＭＤ重症患儿 可出现脑干脑炎、无菌性脑膜炎、神经源性心衰和 肺水肿等多种神经系统疾病，一般病程进展迅速、 病情重、死亡率高且易遗留神经系统后遗症［２－３］。 自２００８年以来，ＥＶ７１引起的相关疾病在我国呈 现持续流行态势，由于缺乏有效的防控手段和治疗 药物，已成为严重危害我国婴幼儿身体健康的重要 公共卫生问题之一。研发疫苗是控制严重 ＨＦＭＤ 的有效手段。目前已有多家企业投入疫苗的研发。 我国有３家企业研发的疫苗已完成Ⅲ期临床试验， 初步分析结果明ＥＶ７１疫苗具有良好的安全性和 保护效果［４－６］。 生物质谱 （ＭＳ）是生物分子分析的质谱技术， 已经成为分析、鉴定蛋白质、多肽、细胞因子等生 物大分子的重要手段和前沿方法［７－１４］。本文通过采 用生物质谱技术，对我国完成Ⅲ期临床试验的其中 ２家企业生产的ＥＶ７１疫苗原液进行蛋白成分鉴定 与分析，探索ＥＶ７１疫苗质控研究的新方法，为完 善疫苗质控标准提供依据。 １　材料与方法 １．１　ＥＶ７１原液　２家ＥＶ７１疫苗原液，编号为 Ａ、Ｂ。细胞基质为 Ｖｅｒｏ细胞，蛋白浓度分别为 ０．００３、０．０３１ｇ／Ｌ。由２家 ＥＶ７１疫苗研发企业 馈赠。 １．２　主要试剂　ＥＶ７１抗原含量检测试剂盒，北 京科兴生物制品有限公司馈赠。ＢＣＡ蛋白含量检 测试剂盒，购自美国 Ｔｈｅｒｍｏ公司。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电泳梯度胶及电泳液，购自美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司。胰 酶购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司。 １．３　主要仪器　液质联用仪ＬＴＱ　Ｏｒｂｉｔｒａｐ　Ｖｅｌｏｓ ＬＣ／ＭＳ，高效液相系统的型号为 ＥＡＳＹ－ｎＬＣＴＭ １０００Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｎａｎｏ－ＨＰＬＣ　Ｓｙｓｔｅｍ，为一体式纳 升级不分流高效液相分离系统；质谱仪型号为 ＬＴＱ　Ｏｒｂｉｔｒａｐ　Ｖｅｌｏｓ，均由美国 Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司生产。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳槽、酶标仪， 美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司生产。高速冷冻离心机，美国 ＢＥＣＫＭＡＮ公司生产。 １．４　ＥＶ７１原液浓缩　按照说明书操作步骤，用 截留分子量为３Ｋ的超滤浓缩离心管对ＥＶ７１原液 进行浓缩。抗原 Ａ、Ｂ浓缩倍数分别为１０倍、１５ 倍，总蛋白含量分别为０．０３、０．４６ｇ／Ｌ。滤出液经 ＥＶ７１抗原含量检测试剂盒检测未见ＥＶ７１抗原。 １．５　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳　取浓缩后的样品加入１／１０ 体积的１０×Ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ中，混匀。微沸状态煮 ５ｍｉｎ后冷却至室温。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，上样量均 为３８μｌ。梯度胶浓度为７％～２０％；浓缩胶电压 １００Ｖ，３０ｍｉｎ；分离胶电压１４０Ｖ，９０ｍｉｎ。经 考马斯亮蓝染色后拍照。 １．６　质谱检测样品的制备　切取ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳 获得的蛋白条带，分别进行脱色、胰酶酶切并提取 酶切后的蛋白多肽，真空浓缩抽干。每个切胶条带 从低分子量到高分子量依次编号为１、２、３，以此 类推。 １．７　质谱检测　洗脱液 Ａ＝９９．９％水、０．１％甲 酸；洗脱液Ｂ＝９９．９％乙腈、０．１％甲酸。流速： ０．２５μｌ／ｍｉｎ。质谱全扫描范围：ｍ／ｚ　４００～１　５００。 全扫描中选择离子强度 ＴＯＰ２０的母离子，通过 ＣＩＤ碎裂，进行二级质谱序列测定。另外，从 Ｕｎｉｐｒｏｔ网站 （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）下载 蛋白质组数据并构建数据库用于质谱数据分析。由 北京博奥生物有限公司对样品进行质谱检测。 １．８　ＥＶ７１原液比活检测　采用ＢＣＡ法和ＥＬＩＳＡ 法对浓缩后的ＥＶ７１原液进行总蛋白含量检测和 ＥＶ７１抗原含量检测。比活值 （Ｕ／μｇ）＝ＥＶ７１抗 原含量值 （Ｕ／ｍｌ）／总蛋白含量值 （μｇ／ｍｌ）。检 测方法详见参考文献［１５］。 ２　结　果 ２．１　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳比较　超滤浓缩１０余倍后 的ＥＶ７１疫苗抗原Ａ、Ｂ，经７％～２０％梯度ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳分析，抗原 Ａ可见４条带，抗原Ｂ可 见６条带。其中条带１～４，两者对应的分子量一致。 抗原Ａ、Ｂ的１、２、３和４条带相对分子质量约为 １０×１０３、２４×１０３、２６×１０３ 和３５×１０３，与文献报 道的ＶＰ４、ＶＰ３、ＶＰ２和ＶＰ１的分子量相近［１６］。 ２．２　２种抗原每条条带中的蛋白组成结果比较　 将图１中电泳条带按所示编号进行经切胶、处理后 进行质谱检测。质谱检测的原始文件使用 Ｐｒｏ－ ｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ软件进行搜库计算分析，并使用 过滤设置，保留结果可靠的多肽和蛋白。检测结果 见表１，抗原Ａ和抗原Ｂ的各条带中均含有ＥＶ７１ 多聚蛋白。抗原Ａ的条带１和３中含有猴源蛋白； 抗原Ｂ的条带中除２外，其余均含有猴源蛋白。 在各条带检测出的ＥＶ７１多聚蛋白中，选择最高可 信度的多肽氨基酸序列 （未列出）与阜阳株 （Ｇｅｎｅ　Ｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＥＵ７０３８１２） 进 行 ·１１４·中国病毒病杂志２０１３年１１月第３卷第６期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｖｉｒａｌ　Ｄｉｓ，Ｎｏｖ　２０１３，Ｖｏｌ．３Ｎｏ．６ ＢＬＡＳＴ比对，确定抗原Ａ、Ｂ的条带１～４分别为 ＶＰ４、ＶＰ３、ＶＰ２和ＶＰ１。 注：抗原Ａ、Ｂ为２家企业生产的ＥＶ７１抗原；Ｍ为蛋白 Ｍａｒｋｅｒ。 图１　超滤浓缩后ＥＶ７１抗原ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图 ２．３　质谱法检测蛋白比例与ＥＶ７１疫苗抗原比活 值比较　经条带中蛋白ＰＳＭｓ值 （鉴定多肽次数） 的半定量计算，获得２家企业疫苗抗原中ＥＶ７１蛋 白占总蛋白的比例。并通过对浓缩后抗原进行蛋白 含量检测和ＥＶ７１抗原含量检测，计算得到２家企 业疫苗抗原比活值，见表２。 ３　讨　论 目前我国已有３家企业生产的ＥＶ７１全病毒灭 活疫苗完成Ⅲ期临床试验，其中２家企业采用Ｖｅ－ ｒｏ细胞作为ＥＶ７１病毒培养的细胞基质。本课题组 在前期研究［１５］中建立了ＥＶ７１国家抗原定量标准 品 （２０１０Ｎｏ．００２３），规范疫苗抗原的活性单位 Ｕ／ｍｌ，在检测以Ｖｅｒｏ细胞作为基质的ＥＶ７１疫苗 抗原含量时发现２家企业的比活值存在差异，为了 解比活值与抗原蛋白和宿主蛋白的关系，本研究尝 试采用 ＭＳ法对２家疫苗原液的主要蛋白成分进行 鉴定、分析。ＭＳ由于具有高准确度、高灵敏度和 高自动化程度的特点，可准确测定多肽或蛋白质的 相对分子量及氨基酸序列，已在生物学领域得到广 泛应用。以往研究中，ＭＳ常用于检测各种病毒的 衣壳蛋白特征并进行鉴别分析［７－８］、病毒准种检 表１　２种抗原每个条带中的蛋白组成 条带 编号 抗原Ａ 蛋白编号 蛋白来源 蛋白名称 抗原Ｂ 蛋白编号 蛋白来源 蛋白名称 １ Ｂ５ＬＦＺ５ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｂ２ＺＵＮ０ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｅ９ＲＧ９８ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｅ０ＷＷＣ７ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｆ７ＨＵ８２ 猴 α－辅肌动蛋白－４ Ｅ９ＲＧ９４ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｆ７Ｂ７Ａ２ 猴 未知蛋白 Ｆ７Ｂ７８６ 猴 细胞角蛋白－１ Ｆ７ＢＫ７２ 猴 肽基脯氨酸顺／反异构酶 Ｆ７Ｈ４Ｍ５ 猴 未知蛋白 Ｆ７Ｈ２Ａ５ 猴 抑制蛋白 Ｆ６ＵＲ３０ 猴 未知蛋白 ２ Ｂ２ＺＵＮ０ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｂ２ＺＵＮ０ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｅ０ＷＷＣ７ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｄ０ＰＷＥ９ ＥＶ７１ 多聚蛋白 ３ Ｄ２ＣＮＲ２ ＥＶ７１ 多聚蛋白 （片段） Ｂ２ＺＵＮ０ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｆ７Ｂ７８６ 猴 细胞角蛋白－１ Ｅ０ＷＷＣ７ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｆ７Ｂ５Ｇ７ 猴 未知蛋白 Ｅ５ＲＰＧ９ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｆ７Ｅ５２６ 猴 未知蛋白 Ｅ５ＲＰＧ０ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｆ７ＡＥＫ９ 猴 细胞角蛋白－２ｅ Ｆ７ＨＣＧ９ 猴 猴源未知蛋白 Ｆ７Ｂ５Ｇ７ 猴 猴源未知蛋白 ４ Ｅ０ＷＷＣ７ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｅ０ＷＷＣ７ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｂ５ＬＦＺ５ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｂ９ＶＳＨ０ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｅ５ＲＰＧ０ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｄ３ＹＧＵ８ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｑ９ＱＦ５２ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｄ９ＨＮＳ２ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｅ９ＲＧ９８ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｄ４ＱＤＴ５ ＥＶ７１ 多聚蛋白 （片段） Ｑ５ＤＷ４５ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｉ２Ａ６０６ ＥＶ７１ ＶＰ１蛋白 Ｇ８Ｚ７Ｊ５ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｆ７Ｄ２Ｊ４ 猴 未知蛋白 Ｂ８ＺＩＶ３ ＥＶ７１ 多聚蛋白 （片段） Ｆ７Ｂ７Ａ２ 猴 未知蛋白 Ｂ８ＺＩＷ６ ＥＶ７１ 多聚蛋白 （片段） ５ 　— — 　　— Ｂ２ＺＵＮ０ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｅ０ＷＷＣ７ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｆ７Ｂ７８６ 猴 猴源细胞角蛋白 Ｆ７ＡＥＫ９ 猴 猴源细胞角蛋白－２ｅ Ｆ７Ｅ５２６ 猴 猴源未知蛋白 Ｆ６ＵＧ９５ 猴 猴源未知蛋白 Ｆ７Ｂ５Ｇ７ 猴 猴源未知蛋白 Ｆ７ＨＧＹ２ 猴 猴源未知蛋白 Ｆ７Ｈ７Ｖ０ 猴 猴源桥粒斑蛋白－３ ６ 　— — 　　— Ｅ０ＷＷＣ７ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｅ５ＲＰＧ０ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｅ５ＲＰＧ９ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｄ３ＹＧＵ８ ＥＶ７１ 多聚蛋白 Ｆ７Ｂ５Ｇ７ 猴 未知蛋白 Ｆ７Ｂ７Ａ２ 猴 未知蛋白 Ｆ７ＡＥＫ９ 猴 细胞角蛋白－２ｅ ·２１４· 中国病毒病杂志２０１３年１１月第３卷第６期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｖｉｒａｌ　Ｄｉｓ，Ｎｏｖ　２０１３，Ｖｏｌ．３Ｎｏ．６ 表２　蛋白比例与ＥＶ７１抗原比活的比较 抗原 编号 ＥＶ７１蛋白 比例 （％） 宿主细胞蛋白 比例 （％） 宿主细胞 蛋白类型 比活值 （Ｕ／μｇ） Ａ　 ９６．７　 ３．３ Ｖｅｒｏ　 ８６５．５ Ｂ　 ９５．０　 ５．０ Ｖｅｒｏ　 ２９１．８ 测［９］、病毒突变研究［１０］、蛋白修饰分析［１１－１２］，或 者根据病毒衣壳蛋白鉴别血清型［１３］，以及用于监 测病毒结构蛋白的动态变化［１４］等。但采用 ＭＳ对 疫苗进行蛋白鉴定及分析的相关研究鲜有报道。 本研究将ＥＶ７１原液经浓缩后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 蛋白电泳分析，再进行脱色、胰酶酶切后提取蛋白 多肽，应用二级质谱对各条带的ＥＶ７１蛋白和宿主 蛋白进行鉴定。研究结果显示，抗原 Ａ可见４条 带，抗原Ｂ可见６条带；除抗原Ａ的第２、４条带 和抗原Ｂ的第２条带不含宿主蛋白外，其余各条 带均含有ＥＶ７１蛋白和宿主蛋白。提示应用该方法 进行多批次平行检测，可建立疫苗原液生产一致性 的质控指标，完善ＥＶ７１疫苗质控方法，为严格控 制宿主蛋白残留量以确保疫苗的安全性提供帮助。 另外，蛋白浓度的差异可能是导致抗原 Ａ和抗原 Ｂ条带数量不一致的原因。经ＰＳＭｓ值 （鉴定多肽 次数）计算发现，２家企业ＥＶ７１蛋白占总蛋白的 百分数相近，Ａ抗原为９６．７％、Ｂ抗原为９５．０％， 结果与药品注册检验中高效液相色谱 （ＨＰＬＣ）法 的纯度检测结果基本一致，但抗原的比活值相差 ２．９７倍，推测不同生产工艺可能是造成ＥＶ７１疫 苗活性存在差异的原因，进一步研究应对２家疫苗 的蛋白结构和抗原特性进行深入探讨。 参考文献 ［１］　Ｍｏｎｔｏ　Ｈ．Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ　７１：ｔｈｅ　ｖｉｒｕｓ，ｉｔ　ｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｏｕｔ－ ｂｒｅａｋｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｎｆｅｃｔ，２０００，３３ （４）：２０５－ ２１６． ［２］　Ｃｈａｎ　ＬＧ，Ｐａｒａｓｈａｒ　ＵＤ，Ｌｙｅ　ＭＳ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｅａｔｈｓ　ｏｆ　ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｄｕｒｉｎｇ　ａｎ　ｏｕｔｂｒｅａｋ　ｏｆ　ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ，ａｎｄ　ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　Ｓａ－ ｒａｗａｋ，Ｍａｌａｙｓｉａ：ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅ ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，２０００，３１ （３）：６７８－ ６８３． ［３］　Ｌｕｍ　ＬＣ，Ｗｏｎｇ　ＫＴ，Ｌａｍ　ＳＫ，ｅｔ　ａｌ．Ｆａｔａｌ　ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ　７１ｅｎ－ ｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｐｅｄｉａｔｒ，１９９８，１３３ （６）：７９５－７９８． ［４］　Ｅｐｇｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｔｏｐｌｉｎｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｒｏｍ　ｐｈａｓｅ　ＩＩＩ　ｔｒｉａｌ　ｏｆ　ｅｎ－ ｔｅｒｏｖｉｒｕｓ　７１ｖａｃｃｉｎｅ（Ｓｉｎｏｖａｃ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）ａｇａｉｎｓｔ　ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ　ａｎｄ ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ ［ＥＢ／ＯＬ］．（２０１３－０３－１６）［２０１３－０５－１５］．ｈｔ ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｇｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｎｅｗｓ／２０１３／Ｍａｒ／Ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｔｏｐｌｉｎｅ－ ｒｅｓｕｌｔｓ－ｆｒｏｍＰｈａｓｅ．ｃｆｍ． ［５］　Ｚｈｕ　ＦＣ，Ｍｅｎｇ　ＦＹ，Ｌｉ　ＪＸ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ，ｓａｆｅｔｙ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ａｎ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　ａｌｕｍ－ａｄｊｕｖａｎｔ　ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ　７１ ｖａｃｃｉｎｅ　ｉｎ　ｃｈｉｌｄｒｅｎ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ：ａ　ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ， ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｐｈａｓｅ　３ｔｒｉａｌ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ， ２０１３，３８１ （９８８２）：２０２４－２０３２． ［６］　Ａ　Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＥＶ７１Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｈｕｍａｎ　Ｄｉｐｌｏｉｄ Ｃｅｌｌ，ＫＭＢ－１７）ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｉｎｆａｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｉｌｄｒｅｎ ［ＥＢ／ＯＬ］． （２０１３－０３－１０）［２０１３－０５－１５］．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｅｅｐｄｙｖｅ．ｃｏｍ／ｌｐ／ ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｔｒｉａｌｓ／ａ－ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ－ｓｔｕｄｙ－ｏｆ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ－ｅｖ７１－ｖａｃｃｉｎｅ－ｈｕ－ ｍａｎ－ｄｉｐｌｏｉｄ－ｃｅｌｌ－ｋｍｂ－６７９ｋＯＹｑ０ｎｃ？ａｒｔｉｃｌｅＬｉｓｔ＝％ ２Ｆｓｅａｒｃｈ％ ３Ｆｑｕｅｒｙ％３ＤＨｕｍａｎ％２ＢＤｉｐｌｏｉｄ％２ＢＣｅｌｌ％２５２Ｃ％２ＢＫＭＢ－１７． ［７］　Ｓｗａｔｋｏｓｋｉ　Ｓ，Ｒｕｓｓｅｌｌ　Ｓ，Ｅｄｗａｒｄｓ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ ｍｏｄｅｌ　ｖｉｒｕｓ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅｓｉｄｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ａｎｄ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ａｎａｌ　Ｃｈｅｍ，２００７， ７９ （２）：６５４－６５８． ［８］　Ｒｅｓｃｈ　Ｗ，Ｈｉｘｓｏｎ　ＫＫ，Ｍｏｏｒｅ　ＲＪ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｏｓｉ－ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｍａｔｕｒｅ　ｖｉｒｉｏｎ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００７， ３５８ （１）：２３３－２４７． ［９］　Ｙｅａ　Ｃ，Ｂｕｋｈ　Ｊ，Ａｙｅｒｓ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ ｖｉｒｕｓ　ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｌａ－ ｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ－ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００７，４５ （３）： １０５３－１０５７． ［１０］　Ｌｅｗｉｓ　ＪＫ，Ｂｅｎｄａｈｍａｎｅ　Ｍ，Ｓｍｉｔｈ　ＴＪ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ　ｖｉｒａｌ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｂｙ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ Ｓｃｉ　ＵＳＡ，１９９８，９５ （１５）：８５９６－８６０１． ［１１］　Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ　Ｊ，Ｒａｐｐ　Ｅ，Ｒｅｉｃｈｌ　Ｕ．Ｎ－ｇｌｙｃａｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　ＣＧＥ－ ＬＩＦ：ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　ｖｉｒｕｓ　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａ－ ｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００８， ２９ （２０）：４２０３－４２１４． ［１２］　Ｍｕｒｒａｙ　Ｓ，Ｎｉｌｓｓｏｎ　ＣＬ，Ｈａｒｅ　ＪＴ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ ｔｈｅ　ｃａｐｓｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ　２ｂｙ　ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ， ２００６，８０ （１２）：６１７１－６１７６． ［１３］　Ｖａｎ　Ｖｌｉｅｔ　Ｋ，Ｍｏｈｉｕｄｄｉｎ　Ｙ，ＭｃＣｌｕｎｇ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ａｄｅｎｏ－ａｓ－ ｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ　ｃａｐｓｉｄ　ｓｅｒｏｔｙｐｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００９，１５９ （２）：１６７－１７７． ［１４］　Ｓｐｅｉｒ　ＪＡ，Ｂｏｔｈｎｅｒ　Ｂ，Ｑｕ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｌｏｃａｌ　ｓｙｍｍｅ－ ｔｒｙ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｇｌｏｂａｌｌｙ　ｓｔａｂｉｌｉｚｅ　ａ　ｍｕｔａｎｔ　ｖｉｒｕｓ　ｃａｐｓｉｄ　ｔｈａｔ ｍａｉｎｔａｉｎｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｃａｐｓｉｄ　ｄｙｎａｍｉｃｓ ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ， ２００６，８０ （７）：３５８２－３５９１． ［１５］　Ｌｉａｎｇ　ＺＬ，Ｍａｏ　ＱＹ，Ｇａｏ　Ｑ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｈｉｎａ′ｓ ｎａｔｉｏｎａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎｄ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉ－ ｂｏｄｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｆｏｒ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ　７１ （ＥＶ７１） ｖａｃｃｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１１，２９ （５２）：９６６８－９６７４． ［１６］　Ｓｏｎｇ　ＹＢ，Ｙｕ　Ｎ，Ｈｅ　ＳＪ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏ－ ｇｅｎｉｃｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ＶＰ１－ＶＰ４ｏｆ　ｅｎ－ ｔｅｒｏｖｉｒｕｓ　７１［Ｊ］．Ｎａｎｆａｎｇ　Ｙｉｋｅ　Ｄａｘｕｅ　Ｘｕｅｂａｏ，２０１１，３１ （１１）：１８４６－１８５０．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ） 宋远斌，余楠，何思杰，等 ．肠道病毒７１型 ＶＰ１－ＶＰ４基 因克隆及其表达产物的免疫原性［Ｊ］．南方医科大学学报， ２０１１，３１ （１１）：１８４６－１８５０． 收稿日期：２０１３－０７－１７　修回日期：２０１３－０９－１９　责任编辑：李川 ·３１４·中国病毒病杂志２０１３年１１月第３卷第６期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｖｉｒａｌ　Ｄｉｓ，Ｎｏｖ　２０１３，Ｖｏｌ．３Ｎｏ．６