透明质酸实验方法

透明质酸HA ( Hyaluronic Acid ) 是由(1 - β- 4) D - 葡糖醛酸和(1 - β- 3) N - 乙酰基- D -氨基葡糖组成的双糖单位重复连接构成的大分子糖胺聚糖[1 ] 。由于其具有特殊的生理作用、独特的流变学特性和极强的持水保湿能力,在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域得到了广泛的应用[2 ,3 ] 。微生物发酵法是利用某些种属的链球菌在生长繁殖过程中向胞外分泌以HA 为主要成分的荚膜来生产HA。与组织提取法相比,具有成本低、生产规模不受动物原料限制、发酵液HA以游离态存在、易于分离纯化和形成规模化生产、无动物来源的致病病毒污染的危险等优点[ 4 ] 。利用链球菌发酵法生产HA 的研究主要集中在日第2 期邓开野,等:透明质酸产生菌的筛选及诱变本,英美等国也有少量报道,大多见于专利。作者对牛鼻黏膜进行了透明质酸产生菌野生型的分离,同时利用复合诱变育种方法处理HA产生菌,以期得到既不产生乙型溶血素、HA 产量又有提高的发酵HA 所适用的菌种。 1 　实验材料 采集的样品为长春皓月肉牛公司和海南省三亚市防疫站的牛鼻黏膜140 份。培养基有以下几种: ①斜面培养基。牛脑沁液800 mL ,牛心沁液200 mL ,牛肉膏的质量分数为0. 3 % ,蛋白胨为1 % ,NaCl 为0. 5 % ,琼脂为1. 8 % ,灭菌前p H = 7. 0 ,121 ℃灭菌20 min 。②血琼脂平板培养基。葡萄糖的质量分数为2 %,蛋白胨为1 %,牛肉膏为1 % ,MgSO4 ·7H2O 为0. 1 % , KH2 PO4 为0. 2 % ,琼脂为1. 6 %,灭菌前p H = 7. 0 ,121 ℃灭菌20 min. ,冷却至50 ℃以下,无菌条件下加入无菌脱纤维兔血。③摇瓶培养基。葡萄糖的质量分数为4 % ,蛋白胨为1 % ,牛肉膏为1 %,MgSO4 ·7H2O 为0. 1 % , KH2 PO4为0. 2 % ,灭菌前p H = 7. 0 ,121 ℃灭菌20 min ,冷却至50 ℃以下,无菌条件下加入体积分数为10 %的小牛血清。 2 　试验方法 2. 1 　菌种分离筛选操作方法 (1) 初筛。将牛鼻黏膜用0. 1 %蛋白胨溶液稀释成不同梯度涂于血琼脂平板,在37 ℃下培养24 h 。观察各菌落在血平板上的溶血性和形态,用接种针挑起看其黏度、荚膜染色和革兰氏染色[5 ] 并镜检。 (2) 复筛。在发酵摇瓶中接入初筛疑似菌株,每株3 瓶,在200 r/ min , 37 ℃下培养24 h 。用红外吸收光谱对经复筛发酵液提纯得到的多糖精品作定性分析。 (3) 红外吸收光谱法。取HA 2 mg , KBr 压片,用IR2400 红外分光光度计在4000 ～ 500cm- 1 范围内扫描。 2. 2 　诱变方法 (1) 制备菌液。菌液经3500 r/ min 离心10min 后弃上清。供紫外线诱变处理的菌体用生理盐水洗涤2 次,重新悬浮于5 mL 生理盐水中,摇匀后倒入盛有45 mL 灭菌生理盐水并带玻璃珠的100 mL 锥形瓶中,振荡10 min , 调整细胞浓度至108 / mL 。在进行诱变处理菌体时,用0. 1mol/ L 、p H = 6. 0 的磷酸盐缓冲液代替生理盐水,其他与供紫外线诱变处理菌体的菌液制备相同。 (2) 紫外线诱变处理。紫外灯的功率为15W ,照射距离为30 cm。将3 mL 菌液和磁力搅拌棒放入直径为9 cm 的无菌培养皿中,搅拌照射时间为2 min 。 (3) N TG 诱变处理。称取1 mg N TG 倒入无菌离心管中,加入0. 1 mol/ L 、p H = 6. 0 的磷酸缓冲液1 mL ,暗处振荡溶解。取4 mL 菌液加入上述离心管中,充分摇匀,立即置于37 ℃水浴振荡处理30 min (N TG 处理终浓度为100 g/mL) 后,离心收集菌体,将含N TG 的上清液倒入浓NaO H 溶液弃去,用无菌水洗涤菌体3 次,用大量稀释法终止N TG 的诱变,最后向离心管中加5 mL 无菌生理盐水。 (4) 突变株筛选。诱变处理的菌液经过中间培养稀释涂于平板上,从血琼脂平板上挑取溶血性较弱或不具溶血性的菌株。再将其置于斜面培养基,在37 ℃下培养14～16 h ,选取2～3 环接入装有50 mL 摇瓶培养基的250 mL 三角瓶中,在200 r/ min 的旋转摇床上培养24 h 后测定发酵液中透明质酸的含量,选取产量提高的菌种。 (5) HA 的提纯[6 ] 。 目前, HA 产生菌的诱变方法多为紫外线照射和化学诱变剂等常规方法, 本实验室使用微波诱变、超声波诱变及微波- 超声波复合诱变的方法选育出高产菌株, 其诱变菌株比原始菌株透明质酸产量高出61%, 且该菌种经5 次传代后透明质酸产量稳定, 实验证明该诱变选育方法具有一定的研究价值。3.3.1 透明质酸生产菌株的选育野生型的链球菌作为HA 产生菌, 首先要经过诱变使其成为溶血素和透明质酸酶缺陷型菌株。链球菌多会产生溶血素( Streptolysin) , 溶血素有溶解红细胞、杀死白细胞和毒害心脏的作用。溶血素混入成品HA, 还会使HA 的品质降低, 不能用于医药品和化妆品, 所以规模生产必须获得非溶血性的菌株。邓开野[11]从血琼脂平板上筛选出一株不具有溶血性的突变菌株, 其性能比原始菌株有很大提高。 如果直接用野生菌发酵, 发酵液中会有一定量HA, 但含量极低, 一般情况下不会超过2g/L, 得到的HA 分子量也很低, 因此必须经过诱变、筛选等手段选育出高产菌株。而现阶段报道多以紫外诱变和化学诱变为主, 应从其它多种育种方法着手, 以期得到稳定的高产菌株。 2.2.2 培养基。目前所用培养基氮源为各种肉浸膏、蛋白胨、氨基酸、酵母膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机铵盐等。其中酵母浸膏最常用。在发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸, 可以提高HA 的产率。碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物, 最常用的是葡萄糖。其他还有磷酸盐、硫酸盐、钾、钠、钙、镁等无机盐。此外, 为了获得高分子量的HA, 培养基中不能含有促使HA 降解的金属离子, 如铁离子、铜离子; 也不能加入自由基清除剂, 以防止HA 降解。 2.2.3 发酵条件。HA 发酵有需氧发酵也有厌氧发酵。有氧发酵一般产率较高且分子量高。在发酵过程中保持适当的溶氧量, 而在不同的阶段采用不同的溶氧量, 也是提高HA产率的手段之一。在HA 发酵过程中, pH 值一般控制在6.0～8.5 范围内, 低于6.0 或高于8.5 会影响菌体的生长, 降低HA 的产率和分子量。剪切力也不应过大。发酵温度通常为37 ℃, 也有采用35 ℃或33 ℃等较低温度的。发酵过程中需要检测的主要参数有pH 值、溶氧量、葡萄糖含量、发酵液粘度、HA 含量和菌体密度等。测定发酵液粘度可直观反映出HA 产率的高低。 2.2.4 从发酵液中提取HA。在后处理前, 首先要杀灭和除去发酵液中的菌体。通常加入杀菌剂或加热灭活菌体后离或过滤除菌。也有文献报道将壳聚糖或氯代十六烷基吡啶直接加入发酵液中以沉淀HA。HA 含量较高时, 发酵液粘度很高, 需要用水稀释后再离心或过滤除菌, 滤液再经乙醇沉淀、CPC 沉淀、超滤等方法进行分离纯化, 最后用有机溶剂沉淀、真空干燥制得最终产品。乙醇沉淀时, HA 溶液中一定要有盐的存在, 否则不会产生沉淀。常用的盐为NaCl和NaAc, 浓度在1 %左右。乙醇沉淀HA 不仅可除去杂质,而且可以脱色。 2.1 过程 取斜面菌种，接种于装有灭菌培养液锥形瓶中，37℃培养12h~16h，接种于种子罐中。培养液中氮源为蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏等，碳源为葡萄糖。37℃搅拌培养12h~16h，接种于发酵罐中。接种比例1：10。发酵液配方基本与种子液相同，只是葡萄糖含量较高，一般为3%~6%。维持通气量0.3vvm~1.0vvm，搅拌转速120r/min，37℃发酵40h~46h。在发酵过程中，发酵液的pH 值不断下降，需调pH6.5~7.0。发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5%以下，pH 值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。发酵结束，用三氯乙酸调pH4.0~4.5，板框过滤除菌体，滤液调pH6.0~6.5，加3 倍体积95%乙醇，沉淀出HA。沉淀用发酵体积的0.1mol/L 氯化钠水溶液溶解，在搅拌下，加入过量的1%CPC 与滤液中的HA 发生络合沉淀，静置使沉淀下沉。虹吸出母液，加入0.1mol/L 氯化钠液洗涤沉淀两次。沉淀在发酵体积的0.4mol/L 氯化钠液中搅拌解离过夜。过滤，滤液加乙醇沉淀，乙醇脱水，真空干燥得HA 链球菌属于兼性厌氧菌。在HA的发酵工艺中，大多数采用有氧发酵，也有的采用厌氧发酵。根据HA 生物合成路线，有氧发酵的葡萄糖能量代谢可产生更多的ATP，有利于UTP 生成，而UTP 是合成HA 的两个活化前提物，即UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖所必需的物质。因此从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于HA 的合成。Nimrod 等[14]用兽疫链球菌的一个变异菌株进行发酵，在厌氧条件下，HA 的产率为2g/L；在通气条件下，为4g/L~6g/L。在发酵过程中通常保持一个适当的溶氧量，也可在不同阶段采用不同的溶氧量。通过增加通气量和提高搅拌转速可提高发酵液的溶氧，但转速过快可导致HA 的机械降解。在 HA的发酵过程中，pH 值是一个重要的因素，一般控制在6.0~8.5 范围内，最好在7.0 左右。链球菌是一种乳酸菌，产生乳酸等小分子有机酸，需用碱液进行中和，以维持适当的pH 值。 在摇瓶和种子罐培养阶段，温度一般控制在37℃。发酵温度一般为37℃，也有的采用35℃或33℃等较低的温度，或在不同的阶段采用不同的温度。在种子培养阶段和发酵的初期，37℃培养可使菌体较快的生长繁殖，发酵中期和后期可适当降低温度，据报道可使葡萄糖的代谢方向由合成菌体细胞壁转向合成HA，提高HA 的产率。 211　粗品制备 量取一定体积发酵液,缓慢加入2倍体积的乙醇,边加边搅拌, 静置2 h, 4000 r·min- 1 离心5 min,倾去上清液,沉淀用工业乙醇脱水3次,真空干燥即得HA粗品。212　6种除蛋白方法 加热法[ 6 ] 　取适量HA 粗品溶于蒸馏水中,于90℃水浴中边加热边搅拌10 min,冷却至室温, 4000 r·min- 1离心5 min,弃去沉淀,上清液醇沉干燥即得HA精品。 盐酸法[ 4 ] 　取适量HA 粗品溶于蒸馏水中,用10% HCl溶液调节pH至410～415, 4000 r·min- 1离心5 min,弃去沉淀,上清液用稀NaOH溶液调pH至610～615,醇沉干燥即得HA精品。 三氯乙酸法[ 4 ] 　取适量HA粗品溶于蒸馏水中,用10%三氯乙酸溶液调pH值至410～415,4000 r·min- 1离心5 min, 弃去沉淀, 上清液用稀NaOH溶液调pH至610～615,醇沉干燥即得HA精品。 　Sevage法[ 4 ] 　取适量HA粗品溶于蒸馏水中,加入总体积1 /5的氯仿和氯仿体积1 /5的正丁醇,剧烈振摇20 min,静置分层,弃去蛋白乳化层。按上述方法重复4次后,上清液醇沉干燥即得HA精品。 氯仿法[ 6 ] 　取适量HA 粗品溶于蒸馏水中,用10% HCl溶液调pH至510,加入等体积的氯仿,振摇20 min,静置分层,弃去下层氯仿及中间的蛋白乳化层,再向上清液中加入等体积的氯仿,重复上述操作2次后,弃去乳化层及氯仿,上清液醇沉干燥即得HA精品。 　等电点沉淀法　取适量HA粗品溶于蒸馏水中,加热至55 ～60℃,过滤,滤液用5 mol·L - 1NaOH溶液调pH至1010～1015,过滤,再用10%HCl溶液调pH至610～615,过滤,滤液加入约2～3倍体积工业乙醇沉淀,沉淀用蒸馏水溶解,再用5 mol·L - 1 NaOH溶液调pH至1010～1015,过滤,然后用10% HCl溶液调pH至610～615,过滤,滤液醇沉干燥即得HA精品。