第二章 蛋白质分子设计

null第二章 蛋白质分子第二章 蛋白质分子设计目的： 一、为有目的的蛋白质工程改造提供设计和指导性信息，如提高蛋白质的热、酸稳定性 二、探索蛋白质的折叠机理，为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律 层次： 一、蛋白质三维结构已知基础上的分子设计 二、在三维结构未知的情况下，借助一级结构序列信息及生物化学性质进行分子设计工作 蛋白质分子设计的分类蛋白质分子设计的分类依据改造部位的多少将蛋白质分子设计分为三类 定点突变或化学修饰法(小改) 定点突变技术 盒式替换技术 2. 拼接组装设计法(中改):对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装，以期望能转移相应的功能，获得具有新特点的蛋白质分子 3. 从头设计全新蛋白质蛋白质分子设计的基础蛋白质分子设计的基础 蛋白质的结构与功能是开展蛋白质分子设计的基础，对蛋白质结构与功能之间的认识对蛋白质分子设计是至关重要的，决定着蛋白质分子设计的成功与否。具体包含以下内容： 1）蛋白质生物功能的多样性 2）蛋白质功能由其高级结构决定 3）蛋白质的一级结构与其构象及功能的关系 4）蛋白质空间构象与功能活性的关系 5）结构生物学与生物信息学促进蛋白质分子设计不同生物体的细胞色素C序列间氨基酸差异数目的比较　　不同生物体的细胞色素C序列间氨基酸差异数目的比较　　蛋白质一级结构与其构象及功能的关系 系统树　　系统树　　null蛋白质空间构象与功能的关系 null 肌红蛋白和血红蛋白是两个研究得最透彻的蛋白质，它们是蛋白质结构与功能的范例。肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质，它和血红蛋白的亚基在氨基酸序列上具有明显的同源性，它们的构象和功能也十分相似。肌红蛋白肌红蛋白Mb是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段-螺旋结构 易与氧气结合，氧解离曲线呈直角双曲线。 整条多肽链折叠成紧密球形分子，氨基酸侧链上的疏水侧链大都在分子内部，富极性及电荷的则在分子表面 Mb分子内部有一个袋形空穴，血红素居与其中。血红素辅基与蛋白质部分稳定结合血红蛋白血红蛋白血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基中间有一个疏水袋形空穴，可结合一个血红素并携带1分子氧， 因此1分子Hb共结合4分子氧 Hb各亚基的三级结构与Mb极为相似 Hb各亚基之间通过8对盐健，紧密结合成亲水的球状蛋白 成人红细胞中Hb主要是由两条α肽链和两条β肽链组成（α2β2）null 血红蛋白在氧分压较低时，与氧气结合较难，氧解离曲线呈Ｓ状曲线。 但当氧与血红蛋白分子中一个亚基的血红素辅基的铁结合后，即引起该亚基构象的改变，一个亚基构象的改变又会引起其余亚基的构象相继发生改变，亚基间的次级键被破坏，结果整个分子从紧密的构象变成比较松散的构象，易于与氧结合，从而使血红蛋白与氧结合的速度大大加快。血红蛋白的构象变化与结合氧血红蛋白的构象变化与结合氧肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线nullMb易与O2结合，而Hb在O2分压较低时较难结合O2 Hb氧解离曲线为S状曲线，而Mb的为直角双曲线。因为： Hb第一个亚基与氧气结合以后，促进第二及第三个亚基与氧气的结合，当前三个亚基与氧气结合后，又大大促进第四个亚基与氧气结合。即Hb各亚基间存在正协同效应。null血红蛋白中血红素辅基的结构 null血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。null 氧合作用显著改变Hb的四级结构，血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换（从T态→R态）T态（tense state）紧张态，对氧的亲和力低，不易与氧结合 R态（relaxed state）松驰态，它与氧的亲和力高，易于与氧结合null蛋白质分子设计的原则蛋白质分子设计的原则活性设计 考虑被研究的蛋白质功能，涉及选择化学基团和化学基团的空间取向 对专一性的设计 Scaffold设计(框架设计) 疏水基团与亲水基团需合理分布 最优的氨基酸侧链几何排列 蛋白质的侧链构象由空间两个立体因素决定，1）侧链构象决定于旋转每条链的立体势垒，择优构象可通过实验统计测量；2）侧链构象由氨基酸在结构中的位置决定 蛋白质分子设计的程序蛋白质分子设计的程序蛋白质分子设计的程序蛋白质分子设计的程序收集相关蛋白质的结构信息 建立所研究蛋白质的结构模型 结构模型的生物信息 选择设计目标 序列设计 预测结果 获得新蛋白质 新蛋白质的检验 完成新蛋白质设计蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面 筛选以及纯化蛋白质需要进行细致的表征，测定它们的序列、三维结构、稳定性、催化活性等。 专一性突变产物是蛋白质设计成败的关键。一些新技术，如PCR及自动化技术的发展使各种类型的基因工程变得快速、容易。 计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重要位置。建立蛋白质三维结构模型，确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能对蛋白质工程是至关重要的。 在明确突变位点或蛋白质序列应改变的区域后，可以进行定位突变，但要得到具有预期结构与功能的蛋白质是不容易的，可能需要经过几轮的循环。蛋白质三维结构知识的必要性蛋白质三维结构知识的必要性 蛋白质三维结构知识对于蛋白质工程是绝对必要的。目前PDB(Protein Data Bank)已收集数以万计个蛋白质晶体结构，但是通常蛋白质序列的数目比蛋白质三维结构的数目大100倍。当我们开始对某一天然蛋白质进行蛋白质分子设计时，首先要查找PDB了解这个蛋白质的三维结构是否已被收录。如果PDB中没有收录又未见文献报道，我们需要通过蛋白质X射线晶体学及NMR测定蛋白质的三维结构，或者通过结构预测的方法构建该蛋白质三维结构模型。二、基于天然蛋白质结构的分子设计二、基于天然蛋白质结构的分子设计定位突变 1) 蛋白质修饰 2) 基因定位突变 从基因水平上进行蛋白质分子的改造，即采用定位诱变的方法，对编码蛋白质的基因进行核苷酸密码子的插入、删除、置换和改组，然后对突变后的基因进行蛋白表达并分析所表达蛋白质的功能活性，其结果为蛋白质分子改造提供新的设计方案。设计目标及解决设计目标及解决办法 蛋白质结构与功能的关系对于蛋白质工程及蛋白质分子设计都是至关重要的。如果我们想改变蛋白质的性质，必须改变蛋白质的序列。 Hartley等于1986年完成了一个我们所要的有关蛋白质重要性质设计目标及解决办法表，该表至今仍有参考价值。蛋白质定位突变的设计目标及解决办法 蛋白质定位突变的设计目标及解决办法 设计目标解决办法热稳定性 对氧化的稳定性 对重金属的稳定性 pH稳定性 提高酶学性质引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积，增加表面盐桥 把Cys转换为Ala或Ser，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu，把Trp转换为Phe或Tyr 把Cys转换为Ala或Ser，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替代表面羧基 替换表面荷电基团His、Cys以及Tyr的置换，内离子对的置换 专一性的改变，增加逆转数(turnover number)，改变酸碱度定位突变种类定位突变种类根据基因突变的方式，还可以分为以下三类： 插入一个或多个氨基酸残基 删除一个或多个氨基酸残基 替换或取代一个或多个氨基酸残基 最大量的定位突变是在体外利用重组DNA技术或PCR方法定点突变 盒式突变定位突变的程序定位突变的程序建立所研究蛋白质的结构模型 找出对所要求的性质有重要影响的位置 预测突变体的结构 构建突变体，获得突变体蛋白 突变体蛋白质的检验基因定位突变的蛋白质分子设计程序遵循设计原理中的程序蛋白质中功能残基的鉴定蛋白质中功能残基的鉴定1．根据结构信息确定残基的突变 2．突变实验方法鉴定功能残基 随机突变和删除分析及连接片断扫描突变 3．利用蛋白质同源性鉴定功能残基蛋白质分子拼接蛋白质分子拼接替换蛋白质分子的一个肽段，或 一个结构域 抗体工程（Chapter VI）nullnull第二节 全新蛋白质设计第二节 全新蛋白质设计 也称为蛋白质分子从头设计，是指基于对蛋白质折叠规律的认识，从氨基酸的序列(一级序列)出发，设计制造自然界中不存在的全新蛋白质，使之具有特定的空间结构和预期的功能工具：计算机模拟技术 基因操作技术 蛋白质全新设计的一般策略 蛋白质设计循环蛋白质全新设计的一般策略 蛋白质的全新设计蛋白质的全新设计蛋白质结构的从头设计 蛋白质功能的从头设计 取得的进展：血红素结合蛋白、 氧化还原活性蛋白质、 DNA结合蛋白 基于蛋白质的高分子材料蛋白质结构的从头设计蛋白质结构的从头设计中心问题：设计一个具有稳定及独特的三维结构 的序列 克服的障碍：线性聚合链的构象熵 采取的策略： 1）使相互作用的强度与数目达到 最大（理论基础：分析已知结构 的天然蛋白质中的二级结构单元） 2）通过共价交叉连接减小折叠的构象熵null１．二级结构的设计原则： α螺旋设计 优点：结构比较简单 α螺旋设计使用的策略： 1）选择倾向于形成α螺旋的氨基酸，如亮氨酸、谷氨酸或赖氨酸等 2）在设计两亲性的α螺旋时，为使结构中形成一个亲水面和一个疏水面，疏水氨基酸残基应按3或4的间隔排列 3）为稳住α螺旋，常需要在其N段加一个N帽，形成N帽的氨基酸残基有Gly、Asn、Set和Met等，在其C端加一个C端帽，形成C帽的氨基酸有Gly、Ser、Arg和Gln等 4）使带正电荷的氨基酸残基靠近C端，带负电荷的氨基酸残基靠近N端蛋白质从头设计的手段null１．二级结构的设计原则： β折叠设计 比α螺旋困难， 1） β折叠片结构中氢键形成在不同的β折叠股间 2） 单个氨基酸残基平均形成的氢键数较α螺旋中少，结构稳定性差 β折叠设计使用的策略： 1）选择形成β折叠片倾向性较大的氨基酸残基 2）使亲水性和疏水性残基相间排列蛋白质从头设计的手段null配体诱导组装 配位结合位点设计在结构中有几个相互作用片断的界面处。如果这个位点对配体有很高的亲和力，则结合配体的合适的自由能将充分克服熵消耗并且驱动肽自组装 ＋