肿瘤基因治疗的研究进展

× 综述·讲座¬ 肿瘤基因治疗的研究进展 梅新华 临沂市人民医院外科 ,山东 临沂 276003 Recent advance s in tumor gene therapy and virus vectors M EI X in2hua Department of S urgery , L iny i People’s Hos pi tal , L iny i 276003 , P. R. China 【摘要】　目的 :综述分析国内外肿瘤基因治疗 研究现状的文献 ,为基础与临床研究提供研究 方向、思路和资料。方法 :应用 MEDL INE、 CA、CBMdisc、CMCC、CJ FD 和 CSTPCD 等数据 检索系统及数据库 ,以“肿瘤基因治疗”等为关 键词 ,检索 1998201～2007206 与肿瘤基因治疗 相关的文献。纳入标准 :1)肿瘤基因治疗的动 物及临床试验研究 ,包括方法、效果及进展 ; 2)肿瘤基因治疗与其他生物疗法疗效、不良反 应及优缺点的比较。根据纳入标准 ,粗选 143 篇文献 ,最后 17 篇文献纳入综述分析。结果 : 基因治疗作为肿瘤治疗的新手段是随着 DNA 重组技术的成熟而发展起来的 ,是以改变遗传 物质为基础的生物医疗技术 ,它通过将正常基 因或有治疗作用的基因导入靶细胞来纠正突 变或有缺陷的基因 ,以达治疗目的。基因沉默 疗法、自杀基因疗法、免疫基因疗法、基因替代 疗法、反义基因疗法、多药耐药相关基因治疗、 抗肿瘤新生血管治疗和抗端粒酶治疗等均取 得显著进展。结论 :不同的肿瘤基因治疗方法 各有利弊 ,随着治疗方法与病毒载体的不断改 造和完善 ,基因的转移率、靶向性与安全性不 断提高。 中华肿瘤防治杂志 ,2008 ,15 (16) :1275 - 1278 [ ABSTRACT] 　OBJECTIVE : To reviewed recent advances in tumor gene therapy. METHODS : Papers on tumor gene therapy and virus vectors , published f rom Jan. 1998 to J un. 2007 , were ret rieved in MEDL IN E , CA , CBMdisc ,CMCC , CJ FD , and CST2 PCD databases using the keywords tumor gene therapy. Criteria of paper adoption : 1) Animal and clinical experiment s of malig2 nant tumor gene therapy including the methods , effect s and pro2 gresses ; 2) Comparison of the side effect s , efficacy , and advan2 tages and disadvantages of tumor gene therapy with the ones of other biotherapies. According to the above criteria , 143 papers were selected , and 17 papers out of them were finally analyzed and reviewed. RESULTS : Tumor gene therapy developed with the DNA combination technique is a biomedical technique based on the changing of genetic materials. It could t ransfer normal genes or genes with therapeutic effect into target cells to correct mutant or vicious genes and achieve therapeutic purpose. Tumor gene therapy includes gene silencing therapy , suicide gene thera2 py , immune gene therapy , gene replacement therapy , antisense gene therapy , multidrug resistant related gene therapy , antian2 giogenic therapy , and anti2telomerase therapy , etc. CONCL U2 SIONS : Different tumor gene therapy have their own advantages and disadvantages. The t ransfer rate , target seeking and safety of the gene are increasing with the improving of the therapy. Chin J Cancer Prev T reat ,2008 ,15 (16) :1275 - 1278 【关键词】　肿瘤 ;基因治疗 ;综述文献 [ KEYWORDS] 　neoplasms ; gene therapy ; review literature 【中图分类号】　R730. 51 　　　【文献标识码】　A 　　　【文章编号】　1673 - 5269 (2008) 16 - 1275 - 04 　　基因治疗是以改变遗传物质为基础的 DNA 重组 技术 ,需要将目的基因传递到细胞内 ,这一过程必需载 体的协助才能达到目的 ,因此载体在基因的转移中担 任重要角色。随着免疫学的发展和基因技术研究的不 断加深 ,结合病毒载体、免疫基因和转基因等方法在肿 【通讯作者简介】　梅新华 ,男 ,山东临沂人 ,主治医师 ,主要从 事肿瘤基础与临床治疗的研究工作。 Tel :86 - 539 - 9216636 　E2mail :zy125602 @163. com 瘤的基因治疗中取得了许多成就 ,为肿瘤的治疗展现了广阔的应用前景。1 　基因沉默疗法RNA 干扰 ( RNA interference , RNAi) 是指在生物体细胞内 ,与靶基因同源的外源性或内源性双链RNA (double st randed , dsRNA)诱导转录后引起特异性基 因 沉 默 ( post2t ranscriptional gene silencing ,P T GS) 。2002 年 , Kay 研究小组首次报道了应用 ·5721·中华肿瘤防治杂志 2008 年 8 月第 15 卷第 16 期　　CHIN J CANCER PREV TREA T ,August 2008 ,Vol . 15 　No. 16 RNAi 技术在哺乳动物整体水平进行基因表达沉默的 实验研究 ;2004 年 ,先后报道了用酶法构建全基因组 小分子干扰 RNA (small interfering RNA , siRNA) 文 库新技术和应用基因组 siRNA 文库 ,从全基因组水平 对高等动物基因功能进行高通量 RNAi 研究。Shin 等[1 ]和 Pang 等[2 ]利用 RNAi 技术先后在胃癌、大肠癌 和肝细胞癌治疗的实验研究中取得了明显的效果。国 内也有许多 RNAi 研究的相关报道[3 ] 。 现已阐明 RNAi 发生机制的大致模型。1)启动阶 段 :长 dsRNA 或短发夹 RNA ( short haipin RNA , shRNA) 进入细胞后 ,在一种具有 RNase Ⅲ活性的 dsRNA 特异性核酸内切酶 ( dsRNA specific endoun2 clease ,Dicer)作用下 ,被切割为 21～23 个核苷酸组成 的片段 ,即 siRNA。2) 效应阶段 : siRNA 双链结合一 个核酶复合物从而形成 RNA 诱导沉默复合物 ( RNA2 induced silencing complex ,RISC) ,识别 mRNA ,其中 的反义链与靶 mRNA 互补结合 ,正义链则被置换出 来。继而 ,RISC 中的 Dicer 在靶 mRNA 与 siRNA 结 合区域的中间将其切断。3) 级联放大 :在 RNA 依赖 性 RNA 聚合酶 ( RNA2dependent RNA Polymerase , RdRP)的作用下 ,以 mRNA 为模板 , siRNA 为引物 , 扩增产生足够数量的 dsRNA 作为底物提供给 Dicer 酶 ,产生更多的 siRNA ,从而使效应阶段反复发生 ,一 个完整的 mRNA 就被降解成 21～23 nt 的小片段 ,导 致相应的基因表达沉默。 大多数学者认为 ,RNAi 具有以下 4 个重要特征。 1) 高度特异性 : siRNA 只降解与其同源的靶向 mR2 NA ,并不影响其他基因 mRNA 表达。2)高效性 :细胞 仅需几个分子的 siRNA 即可产生明显的 RNAi 效应 , 这得益于作用过程中的放大效应。3)可传播性和遗传 性 :RNAi 的效应不仅局限于单个细胞内 ,还可在细胞 之间相互传递和维持效应 ,甚至可传递给子一代。 但近期有报道 , siRNA 上 1 个碱基的改变并不影 响 siRNA 的活性 ,甚至 4 个碱基的突变也不能使 siR2 NA 的干扰完全失活 ,对 siRNA 的特异性从侧面提出 质疑[ 4 ] 。另外 ,有研究结果显示 , siRNA 的浓度影响 其干扰的特异性 ,浓度降低 ,特异性增强 ,并有研究者 提出 ,siRNA 的特异性是细胞性依赖性的[4 ] 。 2 　自杀基因疗法 自杀基因 ( suicide gene) 疗法也称前药转换酶基 因疗法 ,是指将某些病毒的基因转导入肿瘤细胞 ,此基 因编码的特异性酶能将对细胞无毒或毒性极低的药物 前体在肿瘤细胞内代谢成细胞的毒性产物 ,以达到杀 死肿瘤细胞的目的。自杀基因治疗系统的种类很多 , 主要包括单纯疱疹病毒 Ⅰ型胸苷激酶/ 丙氧鸟苷 ( HSV12t k/ GCV) 系统、带状疱疹病毒胸腺嘧啶激 酶/ 阿糖甲氧基嘌呤 (VZV2t k/ Ara2M) 系统、胞嘧啶脱 氨酶/ 52氟 胞 嘧 啶 系 统 ( CD/ 52FC ) 和 硝 基 还 原 酶/ CB1954 (N TR/ CB1954)系统等。目前研究较多的 是 HSV2t k / GCV 系统 ,研究者正在致力于提高自杀 基因疗法的效率。Okada 等[5 ] 发现 ,将表达逆转录包 蛋白的复合体载体 ,与 AVC2、GCEGFP (两者均为腺 病毒载体)共同转导可以提高转导的效率 ,提高了体外 细胞对更昔洛韦 ( ganciclovir , GCV) 前药的敏感性 , 而对种植于裸鼠的肿瘤抑制率也达到了 50 %。Mori2 uchi 等[6 ] 在 HSV2t k/ GCV 系统中 , 利用同时表达 HSV2t k 和核转录因子 ( nuclear factor kappa B , N F2κB)抑制剂 IkB 突变形态的 TO IkappaB (一种人工 合成的复制缺陷载体) ,在 GCV 存在下 TOIkappaB 组 的细胞杀伤率达到 90 %～100 % ,且细胞毒性极低 , TO IkappaB + GCV 组裸鼠也比对照组存活率高。 在自杀基因的探索中 ,不少研究者发现 ,少量的自 杀基因转染的癌细胞与未转染的癌细胞按一定的比例 混合后培养 ,不仅转染的癌细胞被杀灭 ,两者相互接触 后相邻的未转染癌细胞也大量死亡 ,此即“旁观者效 应”。治疗中 ,“旁观者效应”是一重要特征 ,即有毒代 谢物通过缝隙连接或凋亡小体从转染细胞移动到邻近 细胞 ,对其产生杀伤作用 ,大大提高了自杀基因的杀伤 效应。Ammerpohl 等[ 7 ] 在用 HSV2t k 基因治疗脑胶 质瘤时发现 ,作为增强瘤细胞间隙链接的 42丁酸苯酯 和 GCV 合用时显著增加了旁观者效应。 3 　免疫基因疗法 免疫基因治疗是通过基因重组技术 ,增强机体的 抗肿瘤免疫功能 ,达到治疗肿瘤的目的 ,主要包括增强 免疫效应细胞功能的细胞因子基因疗法、调节增强抗 原识别能力的主要组织相容性复合物的基因疗法和共 刺激分子基因疗法等。在肿瘤免疫治疗中 ,免疫活性 细胞的免疫监督和杀伤活性起着重要作用。细胞毒淋 巴细胞对肿瘤细胞低反应性的一个主要原因是肿瘤细 胞表面共刺激分子 B27 家族的低表达 ,导致 CD28 和 CD152 以及 B27 之间相互作用减弱。细胞毒性 T 淋 巴细胞 (cytotoxic T lymp hocytes , CTL ) 是免疫系统 的主要效应细胞 ,其介导的细胞毒作用需要识别细胞 表面的 T 细胞抗原受体和主要组织相容性复合体分 子。相反 ,Fas2FasL 介导的细胞毒作用无特异性。因 为肿瘤表面通常表达 Fas ,所以 FasL 和 CTL 是抗肿 瘤的两大武器。Zhang 等[8 ] 构建了包含有 B721 和 FasL 基因的重组腺病毒载体 ,感染人胃癌细胞株 SGC27901 ,将 FasL + / B721 + SGC27901 注射到小鼠 体内 ,结果成瘤性明显下降 ,受 SGC27901/ FB211 诱导 的 CTL 对 SGC27901 的细胞毒作用明显增强。 树状突细胞 (dendritic cells ,DC) 是体内功能最强 ·6721· 梅新华　肿瘤基因治疗的研究进展 的专职抗原递呈细胞 (antigen2p resenting cell , A PC) , 也是惟一能诱导初次免疫应答的 A PC。在肿瘤的发 生发展中 ,肿瘤细胞通过抑制 A PC ,特别是 DC 的抗 原递呈作用来逃避宿主对其进行的免疫攻击。DC 来 源的肿瘤疫苗将是具有巨大潜力的肿瘤免疫治疗手 段。关心等[9 ] 用荧光染料 P KH672GL (绿色荧光) 和 P KH262GL (红色荧光)分别标记 DC 和肝癌细胞系人 类白细胞抗原分子细胞 ,成功构建了便于识别和筛选 的人源 DC 与肝细胞的融合 DC 疫苗 ,并有效诱导产 生特异性 T 淋巴细胞免疫杀伤肝癌细胞。 4 　基因替代疗法 抑癌基因亦称抗癌基因 ,是指正常细胞内存在的 能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。基因替代 治疗就是利用载体将缺失的抑癌基因转染肿瘤细胞 , 以达到杀伤肿瘤细胞的目的。 目前已分离克隆出 20 余种抑癌基因 ,p53 基因是 与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因 ,肿瘤生成会伴随 p53 的缺失。Senat us 等[ 10 ] 发现一种 p53 羧基末端 肽 ,可重新恢复 p53 的瘤细胞吞噬作用 ,而对其他的良 性肿瘤及人外周骨髓瘤细胞作用较小 ,所以可作为新 的抗癌因子。相对于常规的 p53 基因治疗 , Ito 等[11 ] 研究的 p53 促进细胞吞噬的调节基因 ,在转导 p53 腺 病毒载体后 ,促进突变 p53 基因对脑胶质瘤细胞的吞 噬作用 ,却并不诱导野生 p53 基因对脑胶质瘤细胞凋 亡的耐受性。 p27 基因是一种抑癌基因 ,调控细胞周期并抑制 细胞分裂 ,其编码的 p27 蛋白为细胞周期素 ( Cyclin) 依赖性蛋白激酶抑制因子 ( Cyclin2dependent kinase inhibitor ,CD KI) 。Zhu 等[12 ] 将重组腺病毒介导的 p27 转染人胃癌细胞株 MN K245 ,18 h 后 , FCM 观察 到G1～S期前一亚二倍体凋亡峰 ,DNA 电泳发现特征 性的凋亡带 ,原位缺口末端标记技术 ( TUN EL ) 检测 发现实验组的凋亡率明显高于对照组 ,证实了 p27 在 体内和体外的诱导凋亡作用。 目前研究的抑癌基因还有 Fhit 及第 10 号染色体 丢失的张力蛋白同源的磷酸酯酶等 ,但真正应用到临 床 ,还需要大量的研究。 5 　反义基因疗法 反义基因疗法就是根据碱基互补原则 ,用人工合 成或生物体表达的特定 DNA 或 RNA 片断 (反义核 酸) ,抑制或封闭专一靶基因的技术。Survivin 是一种 凋亡抑制基因 ,它在正常组织中不表达 ,而在胚胎发育 组织和多数人类肿瘤组织中均有程度不同的表达。 Tong 等[13 ]在体外通过随机寡核苷酸库联合特定软件 分析 ,选择合适的 Survivin 反义位点 (antisense acces2 sible sites ,AAS) ,并转染入胃癌细胞株 MN K245 ,实 验组 Survivin RNA 和蛋白水平明显下降 ,部分肿瘤 细胞呈现凋亡的特征性改变。并且这种作用与 AAS 的位置有关系 ,提示反义 Survivin 能够诱导凋亡 ,抑 制肿瘤细胞生长。 分化抑制因子 (inhibitor of differentiation , Id) 又 称 DNA 结合抑制因子 ,属于螺旋2环2螺旋 ( helix2loop2 helix , HL H)转录因子家族成员之一 ,与肿瘤的发生、 侵袭及肿瘤血管生成等方面密切相关。Id 蛋白可成 为肿瘤靶向治疗的一个新靶点。 目前用于反义治疗的基因还有 Bcl22、c2erb2B2 和 增殖细胞核抗原等。 6 　多药耐药相关的基因疗法 多药耐药 ( multidrug resistant , MDR) 是指在化 疗药物治疗肿瘤中发现的肿瘤细胞的非特异普遍耐药 性。导致肿瘤细胞 MDR 的一个重要原因 , 是其 MDR1 基因扩增和过度表达。MDR 相关的基因治疗 一般集中在抑制肿瘤细胞的 MDR1 基因表达 ,从而增 加常规化疗的效果。郭华等[14 ] 以 MDR1 基因 mRNA 为靶点设计合成 2 个反义肽核酸 (peptide nucleic acid , PNA)序列 ,利用 PNA2DNA 杂交 ,阳离子脂质 体介导转染脑神经母细胞瘤耐药细胞株 S K2N2SH。 检测显示 ,S K2N2SH 细胞 P2gp 表达明显降低 ,MDR1 mRNA 表达轻度下降 ,细胞内多柔比星 (ADM) 聚集 浓度明显增加 , PNA 在 MDR1 基因抑制中的特殊作 用为逆转肿瘤的 MDR 提供了新的途径。 缺氧诱导因子 1 ( hypoxia inducible factor 1 , H IF21) 对于肿瘤 MDR 形成有多方面的作用 , 以 H IF21为靶点的肿瘤治疗 ,为克服肿瘤放、化疗抵抗提 供了新思路。马超等[15 ]构建靶向 HIF21α的短发夹状 小干扰基因 (p Silencer2H IF) 并转染到人乳腺癌耐 AMD 细 胞 株 MCF27/ ADR 中 , 细 胞 中 H IF21α、 MDR21 mRNA 水平明显降低 , P2糖蛋白 ( P2glycopro2 tein , P2gp) 的表达亦降低 ,细胞存活率由 76 %下降到 43 % ,Rh123 荧光强度由 2210 %升为 8616 % ,提示 p Silencer2HIF 有逆转 MDR 的作用。 7 　抗肿瘤新生血管形成疗法 在肿瘤生成与转移中新生血管发挥重要作用 , V EGF 和转化生长因子是促进新生血管生成的主要生 长因子 ,以 V EGF 作用最强。与其他基因治疗相比 , 该疗法无需直接转染肿瘤靶基因 ,只需转染肿瘤 4 周 , 创造抑制血管生成的环境。小鼠血管内给予针对 V EGF 受体的 siRNA 时发现 ,V EGF 受体表达减少 , 肿瘤的生长速度和血管生成明显减少。 ·7721·中华肿瘤防治杂志 2008 年 8 月第 15 卷第 16 期　　CHIN J CANCER PREV TREA T ,August 2008 ,Vol . 15 　No. 16 8 　抗端粒酶疗法 端粒是位于染色体末端的复合结构 ,调控细胞的 有丝分裂 ,随着细胞分裂将逐步缩短 ,最后导致细胞凋 亡。所以端粒的持续存在是肿瘤细胞增殖的基础。端 粒酶是一种逆转录酶 ,能够以自身 RNA 为模板合成 端粒的末端重复序列 52T TA G23′,以补偿端粒片段的 缺失 ,在正常组织中通常处于抑制状态 ,但在恶性肿瘤 和永生化的细胞中常处于激活状态。人端粒酶逆转录 酶 (human telomerase reverse t ranscriptase , h TER T) 是端粒酶的活性限速成分。迄今已发现 6 种类型的核 酶 ,其中锤头状核酶由于结构简单 ,设计方便 ,成为基 因治疗的首选。何霞等[16 ] 将端粒酶特异性核酶表达 载体 pCIneo2h TR2RZ 和 pCIneo2h TER T2RZ 分别转 染 A549 肺癌细胞 ,证实了核酶对靶 RNA 切割的有效 性 ,并且细胞端粒酶的活性降低。说明端粒酶 h TER T mRNA 及端粒酶 RNA 均可作为肺癌的治疗 靶点 ,端粒酶特异性核酶有望成为肺癌基因治疗的手 段。在人类正常胃组织中无端粒酶表达 ,而在胃癌组 织中端粒酶阳性表达率达 85 %～100 %。Ye 等[17 ] 将 人端粒酶反义寡核苷酸分别转染高、中和低分化的人 胃癌细胞 MN K228、SGC27901 和 MN K245 ,当反义寡 核苷酸的浓度由 5 U/ mol 增加到 10 U/ mol 时 ,3 组细 胞株的端粒酶活性由部分降到完全被抑制。不同浓度 的人端粒酶反义寡核苷酸治疗 96 h 后 ,3 组细胞生长 抑制率分别为 40189 %、71128 %和 15186 % , FCM 还 观察到 MN K245、SGC27901 细胞有细胞凋亡现象。 【参考文献】 [ 1 ] Shin J , Kim J , Ryu B , et al . 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