167例血友病A患者凝血因子Ⅷ抑制物筛查及分析

血友病A(HA)是一种由于凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷 所致的出血性疾病，是一种x染色体连锁隐性遗传性疾病。 在男性中的发病率约(10～20)／10万⋯。主要临床现是 反复发生异常出血，主要依靠反复输注FVi制剂替代治疗， 以达到治疗和预防出血的目的。但是替代治疗会在一部分 患者中导致相应凝血因子抗体的产生。最终导致疗效下降或 无效，这已成为治疗HA的最严重并发症之一。国内外目前 对FⅧ抑制物的发生率报道不一，我国HA患者抑制物的发 生率报道相对较少，对抑制物形成的危险因素等研究尚处在 初步阶段，缺乏对FⅧ抑制物患者临床动态监测。因此，调 查抑制物的发生情况及动态变化，对于抑制物形成的防治和 临床治疗具有重要的理论和现实意义。 对象和 一、研究对象 我院门诊和病房收治及登记注册的167例HA患者，男 性，中位年龄27．5岁，年龄分布为≤10岁占25％、lO一39岁 占63％、≥40岁占12％。临床分型重型[FⅧ活性(FⅧ：C) ≤1％]124例，占74％；中型(1％5％)20例，占12％。临床表现：关节出 血，肌肉出血，齿龈及皮下血肿，血尿，消化道出血等。替代 治疗所用FⅧ制品统计：15％患者使用新鲜冰冻血浆和冷沉 淀．70％患者多用血浆源性FⅧ制剂，如康斯平，约15％患者 使用重组FⅧ制剂，如拜科奇。按诊断时的轻、中、重型入 组，在随访l一2年的时间段内不限使用FⅧ制剂类型。 二、样本收集及处理 随时收集新确诊HA患者资料，建立患者资料数据库。 采集患者静脉血，以柠檬酸钠抗凝，收集的血标本立即 3000r／min离心5min，及时分离血浆并分装保存于一80℃， 定期成批检测活化的部分凝血活酶时间(APrr)、FVl：C、抑 制物筛查。3～6个月间隔对抑制物滴度偏高的患者随访出 血情况并采集血标本同上处理，分装监测时，I’I'、FVl：C、抑制 物滴度。 三、检测方法 DOI：10．3760／ema．j．issn．0253-2727．20l1．09．013 基金项目：国家杰出青年科学基金(30825018)；湖北省研究与 开发项目(2009BCCOIO) 作者单位：430022武汉，华中科技大学附属协和医院血液病研 究所；湖北省血友病诊治中心；华中科技大学附属协和医院血栓与止 血研究室 通信作者：胡豫，Email：huyul964@tom．㈣ 1．FⅧ：C测定：选用一期凝固法为基础，应用CA7000 全自动凝血仪(日本Sysmex公司产品)测定FVI：C。实验所 用APrIT试剂和乏FⅧ血浆等配套试剂购自德国Dade BehfingMarburg公司。 2．改良Nijmegen法测定FⅧ抑制物： (1)正常缓冲血浆制备：100名健康志愿者(P1r、APrr均 在正常参考值范围内)经血浆采集后混匀得120ml正常混 合血浆；再向上述混合血浆加入固体咪唑680nag，浓度达到 0．1mol／L，在4oC条件下，缓慢向其中滴定浓度0．1moL／L HCl至pH7．4。 (2)制备FⅧ：c

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曲线：用乏FⅧ血浆倍比稀释正常 缓冲血浆，对应的FⅧ：c为100．00％一3．12％，上机测定 AP'IT，并绘制标准曲线。 (3)测定血友病残余FⅧ：c：100山患者血浆与等量正 常混合血浆混匀组成测试血浆，100山乏FV$血浆与等量正 常混合血浆混匀组成对照血浆，测试血浆和对照血浆再于 37℃水浴2h，测定测试血浆中AFIT值，根据标准曲线计 算残余FⅧ：C，再计算FⅧ抑制物滴度值，用Bethesda单位 (BU)表示。 3．结果判定：残余FV$：c下降50％为1．0BU，阈值设 定为残余FⅧ：C66％(即0．6BU)；残余FⅧ：C80％为阴性； 残余FVm：C66％～踟％

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为<0．6BU；残余FⅧ：C≤ 30％样本需要稀释后重新测定。根据抑制物滴度水平进行 分型：高滴度抑制物者指患者血浆FⅧ抑制物滴度≥5BU； 低滴度抑制物者指抑制物滴度<5BU。 四、疗效判断 疗效判断标准按照文献[2]。显效：出血停止，且第1次 用药后10min或60min后FⅧ：c升高达到或接近预期水 平。好转：出血症状改善。无效：出血症状无改善或者加重。 五、统计学处理 采用SPSSD．0统计软件对数据进行统计学处理。率的 比较采用x2检验或Fisher确切概率法，影响产生抑制物的 相关因素分析采用x2检验。 结 果 1．FVl抑制物产生率和影响因素：改良Nijmegen法检测 结果显示167例患者中抑制物阳性15例(9．O％)，其中有 3例(1．8％)大于5BU为高滴度抑制物(5．58—12．5Bu)患 者，在低滴度抑制物患者中有l例在l一5BU(1．46BU)，有 11例小于lBU(0．60一O．87BU)。对167例替代治疗的HA 患者进行相关因素分析，在诸多相关因素中，血友病的严重 万方数据 ·628- 中华血液学杂志2011年9月第32卷第9期ChinJHematol。September201I，V01．32。No．9 呈度、家族史、是否有大出血或手术使用大剂量FⅧ制剂史 偏高者动态监测中仍表现为高滴度，定量上无减退或消失 羞三个因素与患者替代治疗后是否产生抑制物有相关性 (表3)。 表I)(P<0．05)。 表3 4例抑制物滴度大于1．0Bu患者动态监测结果 表I 167例血友病A患者FⅧ抑制物产生的相关因素 抑制物滴度(Bu) 分析结果 例号 第1次抽血 第2次抽血 第3次抽血 ⋯素 糍鬻。盎 ： 亿1．4，6。 ，3．．7。46 sm 首次出血年龄(岁) 3 O 6·97 6·51 ≤2 92 9．8 O．689(0．161、 4 5·58 每年出血次数 3．高滴度抑制物的存在对替代治疗的影响：给患者FⅧ ≤5 41 12·2 o·2岍(o·686) 浓缩制剂康斯平600U替代治疗，在半衰期8。12h内观察 ．三二．。；。。 1267·9 患者用药前，用药后1h,6h的AFITAVI1、FⅧ：c、FⅧ抑制物滴度 血黧景醒 123，22 0020 霉磊茗釜吴等：u的例：与滴度：J：谳嚣了茎喜(5 422) 3-"FⅧ：C≤l％ 1． ． ． 奇佰俅，删J殳人了_]小。州秒qJ司嗣，曼，J、 u‘o廿u州I思石 FVi：C>l％440 对比，结果显示前者使用替代治疗疗效明显不及后者，表现 血友病家族史 在APTT的延长未减少，FⅧ：c未能提高，FW抑制物呈高滴 有4226·2o·ooo(20·325)度(表4)。 大出血或手术使用大量FW．q! 讨 论 有 37 24．30．000(13．685) 无 1304．6 目前已有许多国家对HA患者产生FⅧ抑制物进行了前 2．抑制物滴度大于lBE的4例患者随访：4例患者的 临床特征基本资料见表2。对于首次筛查出抑制物滴度高于 5BU的患者，应定期3—6个月电话随访其出血和所用替代 治疗情况，在对方同意的情况下采血复查抑制物滴度。例1 在筛查监测中均为低滴度。例2自筛查时就有高滴度抑制 物，监测中仍表现高滴度。例3在监测过程中出现抑制物阳 性并且表现为高滴度。例4由于手术原因持续输注过大量 FⅧ制品后检测出抑制物。上述几例中抑制物产生后，滴度 FV$抑制物发生率不一。在本研究中我们对国内主要以华中 地区患者为研究对象，采用改良Nijmegen法检测167例HA 患者抑制物阳性率9．0％，其中3例(1．8％)患者有高滴度 抑制物，12例(7．2％)为低滴度的抑制物，分析可见本中心 HA患者以低滴度抑制物为主，高滴度抑制物的患者占少数。 重型HA患者就诊居多，在替代治疗上几乎所有入选患者是 用多种类型Fvm制剂。重型血友病、家族史阳性者及手术输 注大量多类型血制品与抑制物产生有相关性(P<0．05)。目 表2 4例抑制物滴度大于1．0BU患者基本资料 注：4按照每kg体重、每输注lu的FVl制品，可提高血浆FⅧ：C的2％计算FⅧ：C预期升高值 万方数据 前认为主要影响抑制物产生的因素表现在以下几方面：①环 境因素：主要指治疗相关因素，如输注FⅧ制剂的类型、给药 模式等。2003年Wight等po报道应用单一pdFⅧ、多种类型 pdFⅧ和rFⅧ的抑制物的累积发病率比较中，rFⅧ输注者高 于前两组。目前对多种类型治疗时抑制物产生率尚无定论。 其次在给药模式上，这里主要是对大出血或手术患者，往往 需要FⅧ制剂的持续输注强化治疗，德国有关研究表明，轻 中型HA患者采用持续输注其抑制物发生率高达50％14J，持 续输注可能使机体免疫系统激活持续暴露于FⅧ。②患者 因素：主要包括病情严重程度、年龄、家族史。研究表明，重 型HA患者抑制物发生率高于轻中型，前者为25％一40％， 后者相应为3％一13％”1。Santagostino等旧J一项病例对照研 究中，108例HA儿童有抑制物家族史的其抑制物发生率为 20％，明显高于对照组。此外儿童HA患者与抑制物的形成 有一定的关系，有报道儿童(平均年龄在12岁)比成人更易 产生抗FⅧ抗体”J。③基因因素：主要是大片段缺失、基因 倒位等严重基因缺陷类型，综合与基因突变有关的抑制物发 生率约在20％～80％川，其中以内含子22倒位报道最高，占 重型患者的40％～60％悼1。 无论遗传性血友病患者还是获得性患者，一旦产生相应 的抑制性抗体，将使患者的治疗更为艰难，实验室对此抗体 的准确测定至关重要。目前对FⅧ抑制物的检测也有进步， 临床普遍应用的方法是经典的Bethesda测定一J，但是该方法 敏感性不高。ELISA法¨叫能够检测所有抗FⅧ抗体，敏感 性高于Bethesda法，但是抗原要求高、价格昂贵，在国内少 用。而Nijmegen法测定明显改善FⅧ抑制物测定的特异 性⋯J，因此本实验室采用此法定量测定，也可多种方法对比 测定。我们所测得的抑制物阳性率和国内外报道基本一致。 抑制物的产生是否是一过性或持续性存在要进行动态 监测，HA患者抑制物的产生主要是指输注外源性FV!诱发 的FV!抑制物，已有研究结果显示，多在输注外源性FⅧ10d 后，特别是在50一100d内产生，且年龄段50—60岁最 多¨“。目前通过对新诊断患者进行前瞻性研究，再定期筛 查抑制物，最后对阳性患者的危险因素分析，得出结论最准 确pj。综合对抑制物发病率调查中。对经治患者和初治患者 分别进行动态观察，检测频率大于3个月不等，总时间在4个 月到29年不等，前者抑制物形成的发病率在8％一25％[131， 后者在5％一32％¨“。 我们在2年时间对抑制物检测，其中4例患者抑制物滴 度大于1BU，临床资料典型，动态观察中间隔约6个月复查 1次，此期间患者按需替代治疗，发现抑制物滴度基本持续在 第一次检测水平，无明显量的变化，高滴度抑制物的患者出 血情况严重。治疗效果不佳，生活质量低下。在对高滴度抑 制物患者观察其用药前、用药后lh、6h的APTr、FVi：C、 ·629· FⅧ抑制物，与滴度小于0．6BU患者比较。前者使用替代治 疗疗效明显不及后者好。综上分析抑制物一旦产生则在短 时间内很难消失或减退，较高滴度患者在替代治疗上疗效 差。这将提示患者今后临床治疗的方法、用药的选择都要及 时调整，须长期监测相关指标。 参考文献 [1]Bieoeehi1VIP，PasinoM，LanzaT，eta1．Analysisof18novelnlu- tatiominthefaCtOl"Ⅷgene．BrJ Haematol，2003，122：810-817． [2】张之南，沈悌．血液病诊断及疗效标准．2版．北京：科学出版 社。1998：304． [3]wi咖J，PaisleyS．TheepidemMogyofinhibitorsinhaemophilia A：asystematic陀view．Haemophilia．2003，9：418-435． [4]vonAuerC，OldenburgJ，YonDepkaM。ela1．Inhibitordevelop- merttinpatientswithhemophiliaAaftercontinuousinfusionofFVll concentrates．AnnNYAeadSei，2005，1051：498-505． [5]DimicheleD，RivardG，HayC，et81．1nhibitorsinhaemophilia： clinicalaspects．Itaemophilia，2004，10Suppl4：140-145． [6]Santa906finoE，l～laneusoME，RocinoA，eta1．Environmental riskfactorsforinhibitordevelopmentinchildrenwithhaemophilia A：aease-controlstudy．BrJ Haematol，2005，130：422-427． [7]OldenbttrgJ，PadovaA．Geneticriskfactorsforinhibitorstofae- totsViiandIX．I-laemophilia．2006．12Suppl6：15．22． [8]G∞d“eAC，Peake111．"filemolecularbasisofhemophiliaA： 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2006，12：579-590． (收稿日期：201l埘-16) 万方数据 167例血友病A患者凝血因子Ⅷ抑制物筛查及分析 作者： 刘小红， 王华芳， 杨锐， 魏文宁， 郭涛， 胡豫 作者单位： 430022武汉，华中科技大学附属协和医院血液病研究所;湖北省血友病诊治中心;华中科技大学附属协和医 院血栓与止血研究室 刊名： 中华血液学杂志 英文刊名： Chinese Journal of Hematology 年，卷(期)： 2011,32(9) 参考文献(14条) 1.Bicocchi MP;Pasino M;Lanza T Analysis of 18 novel mutations in the factor Ⅷ gene[外文期刊] 2003(5) 2.张之南;沈悌 血液病诊断及疗效标准 1998 3.Wight J;Paisley S The epidemiology of inhibitors in haemophilia A:a systematic review 2003 4.von Auer C;Oldenburg J;von Depka M Inhibitor development in patients with hemophilia A after continuous infusion of F Ⅷ concentrates 2005 5.Dimichele D;Rivard G;Hay C lnhibitors in haemophilia:clinical aspects 2004(Suppl 4) 6.Santagostino E;Mancuso ME;Rocino A Environmental risk factors for inhibitor development in children with haemophilia A:a case-controlstudy[外文期刊] 2005 7.Oldenburg J;Pavlova A Genetic risk factors for inhibitors to factors Ⅷ and Ⅸ 2006(Suppl 6) 8.Goodeve AC;Peake IR The molecular basis of hemophilia A:genotype-phenotype 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JIANG Yan.XU Xin-nü.XIAO Xia.MU Juan.LIU Peng-jiang.Lü Hai-rong 铁过载诱导活性氧物质生成对骨髓造血功能影响的体外实 验研究[期刊论文]-中华血液学杂志2011,32(9) 8. 周虎.王宏梅.马丽.李慧媛.刘晓帆.薛峰.周泽平.齐爱萍.张冬雷.杨艳辉 原发免疫性血小板减少症Sema4A基因表达与T辅助 (Th)细胞因子关系的初步研究[期刊论文]-中华血液学杂志2011,32(9) 9. 江明华.王兆钺.苏健.曹丽娟.李建琴.孙雄华.白霞.王改锋.阮长耿.JIANG Ming-hua.WANG Zhao-yue.SU Jian.CAO Li-juan.LI Jian-qin.SUN Xiong-hua.BAI Xia.WANG Gai-feng.RUAN Chang-geng 6例Wiskott-Aldrich综合征患儿的临床特点和基因分析[期刊 论文]-中华血液学杂志2011,32(9) 10. 刘子勤.刘嵘.师晓东.李兢贤.邹继珍.LIU Zi-qin.LIU Rong.SHI Xiao-dong.LI Jing-xian.ZOU Ji-zhen 幼年黄色肉芽肿三例 临床分析并文献复习[期刊论文]-中华血液学杂志2011,32(9) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zhxyx201109013.aspx