09 单核细胞的分离

GE Healthcare Ficoll-Paque 单核细胞的分离 方法与应用 通用电气医疗集团 (GE Healthcare) 手册 GST Gene Fusion System Handbook 18-1157-58 Affinity Chromatography Principles and Methods 18-1022-29 Antibody Purification Handbook 18-1037-46 Cell Separation Media Methodology and applications 18-1115-69 Isolation of mononuclear cells Methodology and applications 18-1152-69 Ion Exchange Chromatography & Chromatofocusing Principles and Methods 11-0004-21 Purifying Challenging Proteins Principles and Methods 28-9095-31 Gel Filtration Principles and Methods 18-1022-18 Recombinant Protein Purification Handbook Principles and Methods 18-1142-75 Protein Purification Handbook 18-1132-29 Hydrophobic Interaction and Reversed Phase Chromatography Principles and Methods 11-0012-69 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients Principles and Methods 80-6429-60 Microcarrier Cell Culture Principles and Methods 18-1140-62 单核细胞的分离 方法与应用 目录 介绍 ....................................................5 Ficoll-Plaque PLUS ........................................6 分离原理 ...........................................................6 推荐方法 .......................................................7 所需设备和溶液 .....................................................8 样品制备 ...........................................................8 淋巴细胞分离操作 ...................................................8 洗涤淋巴细胞以使其与血小板脱离 ....................................10 实验室典型结果 ....................................................10 注意事项 ..........................................................11 问题解决不完全履行 ................................................12 采用 Ficoll-Plaque PLUS方法分离的淋巴细胞的特性 ......................13 Ficoll-Plaque PLUS的进一步应用 ......................................13 可用性和储存 ......................................................14 符合 ISO 13485:2003 和 (GMP) 的 Ficoll-Paque PREMIUM ...................................15 应用 ..............................................................15 规格 ..............................................................16 可用性和储存 ......................................................16 参考文献 ...............................................17 订购信息 ...............................................21 从通用电气医疗集团 (GE-Healthcare) 选购的用于细胞科学研究的产品 ......21 TM PLUS (见第 6页) 是一种无菌的、用于提纯少量或大量人外周血中高 产和高纯度的淋巴细胞的即用型密度梯度介质，基于Bøyum (1) 发展方法中的一简 单快速的离心操作来完成纯化过程。Ficoll-PaqueTM PLUS也可以用来制备除人外周 血的其它来源的淋巴细胞。 购自通用电气医疗集团的 Ficoll-Paque PLUS： ● 是FicollTM PM400和密度为 1.077 ± 0.001 g/ml的泛影酸钠的无菌内毒素测试 (< 0.12 EU/ml) 溶液。 ● 推荐用于全人外周血中高产的各种淋巴细胞的少量或大量分离。 ● 属于严格质量控制的试验，保证了不同批次细胞的增殖性能。 ● 供应时，采用瓶装，橡胶隔片密封，这样容易保证溶液抽取时处于无菌状态。 ● 可用的便利的包装尺寸：根据研究要求设计的6 · 100 ml和根据日常常规淋巴 细胞分离需要所设计的6 · 500 ml。每一包装中已含有使用的详细说明。 ● 避光储存于4-30 ˚C中，其稳定性可保持最少 3年。 采用本小册子里推荐的操作对正常人外周血进行分离可进行如下典型的淋巴细胞 制备： ● 原血液样品中60 ± 20%的淋巴细胞回收率 ● 95 ± 5%单核细胞 ● 分离细胞具有 > 90%的活力 ● 3 ± 2%粒细胞 ● 5 ± 2%红细胞 ● 原血液样品中总血小板含量 < 0.5% 2005年 10月，通用电气医疗集团将 Ficoll-Paque PREMIUM投入市场。该产品 (见 第 15页) 是在 Ficoll-Paque PLUS基础上，在符合 (GMP) 的环境 (37)下生产的，已 通过 ISO 13485:2003标准认证，并将用于临床。Ficoll-Paque PREMIUM可合并到使 用Ficoll-Paque PLUS的现有操作中，使人单个核细胞从骨髓、外周血及脐带血中分 离成为可能。 ‰ØÉÜ 手册 18-1152-69 AC 2007-05 5 Ficoll-Paque PLUS Ficoll-Paque PLUS是一密度为1.077 ± 0.001 g/ml的水溶液，每100 ml溶液中含5.7g Ficoll PM400、9 g泛影酸钠及 0.0231 g 依地酸钙钠。Ficoll PM400是一由蔗糖和 氯醇合成的高分子量 (Mr 400 000) 聚合物，可溶于水。Ficoll PM400的分子高度分 支，近似球形，以10 nm的斯托克斯半径紧密的盘绕在一起。与分子量相同的线性 多糖 (如葡聚糖，Mr 400000 : /h / 49 ml/g) 相比，Ficoll PM400具有低特性粘度 (17 ml/g)，具有低渗透压。 泛影酸钠是一方便与Ficoll PM400形成的低粘度高密度溶液的化合物。泛影酸钠 (Mr 635.92) 是 3,5-双 (乙酰胺基) -2,4,6-三碘苯甲酸的钠盐。 由于泛影酸钠是一种光敏物质，因此Ficoll-Plaque PLUS必须避光储存。Ficoll-Plaque PLUS中泛影酸钠的作用是提供了为有效去除淋巴细胞中其它细胞所必需的最佳的 密度和渗透压。 Ficoll-Paque PLUS以瓶装、橡胶隔片密封的无菌溶液的形式供应。为保持其无菌， 抽取溶液时应采用无菌技术，其不应移开橡胶隔片。Ficoll-Paque PLUS应避光储存 于 4-30 ˚C中。对未打开的瓶装 Ficoll-Paque PLUS的储存可增加其储存期。Ficoll- Paque PLUS变质表现为澄清溶液中出现黄色或微粒样物质。如发现 Ficoll-Paque PLUS有此类变质，应将其丢弃。 分离原理 Ficoll-Paque PLUS对淋巴细胞的分离是利用通过Bøyum (1,2,3) 和我们实验室进行 的广泛调查研究上建立起来的方法。自1968年Bøyum先驱工作成果发表以来，由 Ficoll PM400和一碘化密度梯度介质 (如泛影酸钠) 的混合物构成的分离介质已被广 泛用于纯化人淋巴细胞。 进行淋巴细胞分离时，采用等量的平衡盐溶液对去纤维蛋白或抗凝血剂处理后的血 液进行稀释，并将其装入离心管中在Ficoll-Paque PLUS (未混合) 之上进行小心的分 层处理。在室温下进行短时离心 (一般是400 g离心处理30-40分钟) 后，可于Ficoll- Paque PLUS与样品层之间的界面处收获淋巴细胞、单核细胞及血小板。然后，将 该物质置于平衡盐溶液中再离心两次，以洗涤淋巴细胞并去除血小板。 6 手册 18-1152-69 AC 2007-05 该分离成功与否受诸多因素的影响。离心处理时，血液样品中的细胞沉淀于血/ Ficoll-Paque PLUS界面处，在该处，这些细胞与Ficoll-Paque PLUS中的Ficoll PM400 接触。在室温下，该试剂可有效的凝集红细胞。这种凝集增加了红细胞的沉淀速度， 这些红细胞在离心管底部形成一个沉淀，使其能够很好地从淋巴细胞中分离出来。 粒细胞也沉淀到Ficoll-Paque PLUS层的底部。它们与轻微高渗的Ficoll-Paque PLUS 的接触增加了其密度，而该密度的增加使该过程更容易实现。因此，离心结束时， 在离心管底部可同时发现粒细胞和红细胞，它们都处于Ficoll-Paque PLUS的下方。 而淋巴细胞、单核细胞及血小板密度不够大，所以无法穿透Ficoll-Paque PLUS层。 因此，这些细胞在原血液样品和Ficoll-Paque PLUS之间的界面上形成一集中带，便 于收集。该区带的形成使采用少量此类细胞和Ficoll-Plaque PLUS介质混合后高产回 收淋巴细胞成为可能。然后，对收获的细胞进行洗涤和离心，以去除血小板、所有 的Ficoll-Paque PLUS及血浆。由此得到的细胞悬浮液就只含高度纯化的各种淋巴细 胞和单核细胞，适合进一步的研究。 推荐标准方法 可在大体积的血液样品量中采用Ficoll-Paque PLUS对淋巴细胞进行纯化。依靠其高 产特性，该方法适用于对极少血液量的处理，比如，从小孩身体里获取的少量血液。 为确保分离细胞的最大增殖性能，建议采用标准操作。我们实验室已对以下操作进 行了评估，并建议将其用于Ficoll-Paque PLUS对正常血液样品的分离。对其进行简 单的改变后可适用于特殊的离心系统。 为对技术进行标准化，应首先对离心管的血液量和直径进行选择。这些因素可确定 血液样品在离心管中的高度，因此可确定其对应的离心时间。增加血液样品在离心 管中的高度可增加红细胞的污染。然而，分离不会受到离心管直径改变的影响。因 此，如果保证血液样品在离心管中的高度及其分离时间恒定，则更大体积的血液就 可采用直径更大的离心管以相同的纯化度进行分离。 淋巴细胞纯度和产量在相当大程度上依赖于对红细胞去除的有效性。 当全血中的红细胞发生凝集时，一些淋巴细胞陷入红细胞凝块中，并和红细胞一起 沉淀。可通过稀释血液减少淋巴细胞的这种自陷趋向。稀释提供了更高的淋巴细胞 产量，且减小了红细胞凝块的大小。在较高温度 (37 ˚C) 下，红细胞凝集效应会被 加强，这将降低淋巴细胞的产量。然而，在相对较低的温度 (4 ˚C) 下，凝集速度 减慢，分离时间增加，这也会降低淋巴细胞的产量。在温度为 18 -20 ˚C时才能获 取淋巴细胞最佳产量。 手册 18-1152-69 AC 2007-05 7 所需设备和溶液 1. 为每一待处理血液样品准备两支 10 ml玻璃试管。应对试管进行硅化处理 (见第 11页的“注意事项”）。 2. 平衡盐溶液。至少为每一待处理样品准备20 ml。可采用两种原液A和 B来制备 平衡盐溶液。 3. 巴斯德吸管 (3 ml)。为每一待处理血液样品准备一支。应对这些吸管进行硅化处 理 (见第 11页的“注意事项”)。 4. 低速离心机。 5. 玻璃离心管。为每一待处理血液样品准备两支离心管。内径约1.3 cm，容量为15 ml。应对离心管进行硅化处理 (见第11页的“注意事项”)。对于更大或更小的样 品，见第11页的“注意事项”中的说明。 6. Ficoll-Paque PLUS。为每一待处理样品准备3 ml。对于更大或更小的样品，见第 11页的“注意事项”中的说明。 7. 带注射针头的注射器。在无菌条件下从瓶里抽取 Ficoll-Paque PLUS时需要。 样品制备 应使用新鲜血液，以确保分离淋巴细胞的高活力。在 18-20 ˚C下制备样品。 1. 在一10 ml试管中加入2 ml去纤维蛋白或抗凝血剂治疗后的血液和等量的平衡盐 溶液 (最后总体积为 4 ml)。 2. 用巴斯德吸管抽出和滴入血液和缓冲液进行混合。 淋巴细胞分离操作 1. 移去 Ficoll-Paque PLUS瓶上的蓝色盖子 (图 1)。 2. 将Ficoll-Paque PLUS瓶来回倒置几次，以确保其混合均匀。使用带注射针头的注 射器刺穿隔片，倒置Ficoll-Paque PLUS瓶并抽取需要量的 Ficoll-Paque PLUS (每 8 手册 18-1152-69 AC 2007-05 溶液 A 浓度 (g/l) Anhydrous D-glucose 5.5 ´ 10-3 M (0.1%) 1.0 CaCl 2 ·2H 2 O 5.0 ´ 10-5 M 0.0074 MgCl 2 ·6H 2 0 9.8 ´ 10-4 M 0.1992 KCl 5.4 ´ 10-3 M 0.4026 TRIS 0.145 M 17.565 溶于约 950 ml 蒸馏水中，加入浓盐酸 (HCl)，使其 pH值为 7.6，然后调整其体积，到 1 L。 溶液 B 浓度 (g/l) NaCl 0.14 M 8.19 制备平衡盐溶液，将1份量的溶液A与9份量的溶液B混合。应每周对该溶液重新制备。也可使用其它 无菌标准盐溶液。 图 3. 图 4. 图 5. 图 1. 图 2. 血液样品 Ficoll-Paque PLUS 血浆 血小板 淋巴细胞 Ficoll-Paque PLUS 粒细胞 红细胞 移去上层液体 淋巴细胞 Ficoll-Paque PLUS 粒细胞 红细胞 一离心管3 ml) (图 2)。如果使用该方法，则将从每一只瓶中抽取出至少 100 ml Ficoll-Paque PLUS。 3. 将 Ficoll-Paque PLUS (3 ml) 加入离心管中。 4. 轻轻加入稀释血液样品 (4 ml)，使其置于 Ficoll-Paque PREMIUM层上 (图 3)。 重要提示：加入稀释血液时，尽量使样品与Ficoll-Paque PREMIUM分层，二者不 得混合。 5. 在 18-20 ˚C下，离心 400 ´ g 30-40分钟。 6. 使用无菌的巴斯德吸管抽出上层液体，使淋巴细胞层在界面处保持原状 (图 4和 图5)。应注意别将淋巴细胞层搅乱。包含血浆的上层液体可储存好以被稍后使用。 手册 18-1152-69 AC 2007-05 9 洗涤淋巴细胞以使其与血小板脱离 1. 采用一无菌的巴斯德吸管将淋巴细胞层移入一清洁的离心管中。在最小量的情况 下移出界面处所有的物质至关重要。移去多余的Ficoll-Paque PLUS会导致粒细胞 污染；而移去多余的上清液则会引起血小板污染。 2. 向装有淋巴细胞的试管中加入至少 3倍体积 (6 ml) 的平衡盐溶液。 3. 用巴斯德吸管轻轻地将细胞吹吸，使其悬浮。 4. 在 18-20 ˚C下，以 60-100 ´ g速度离心 10分钟。 5. 丢弃上清液。 6. 用巴斯德吸管轻轻地将淋巴细胞吹吸，使其悬浮于 6-8 ml的平衡盐溶液中。 7. 在 18-20 ˚C下，离心 60-100 ´ g10分钟。 8. 丢弃上清液。至此，淋巴细胞应悬浮于适合应用的培养基上。 实验室典型结果 淋巴细胞： 原血液样品中的淋巴细胞回收率为 60 ± 20%。 在淋巴细胞中的 95 ± 5%的细胞是单核白细胞。 活力 > 90% (使用台盼蓝排除法进行测量)。 其他细胞： 粒细胞：3 ± 2%。 红细胞：5 ± 2%。 原血液样品中总血小板含量：< 0.5%。 10 手册 18-1152-69 AC 2007-05 注意事项 玻璃器皿的准备：所有与样品接触的玻璃器皿在使用前都应进行硅化处理。玻璃器 皿应浸泡于1%的硅酮溶液中保留10秒 (厂家不推荐在该溶液中进行任何特殊包衣 操作)，用蒸馏水彻底冲洗，并置于恒温箱中烘干。最佳的硅化用液为那些可溶于 有机溶剂的二甲基二氯硅烷溶液。 组织培养用塑料器具可作为代替品使用。 抗凝血剂：肝素、依地酸 (EDTA)、枸橼酸盐、枸橼酸葡萄糖 (ACD) 及枸橼酸磷酸盐 葡萄糖 (CPD) 可被用作血液样品的抗凝血剂。去纤维蛋白血液不需要抗凝血剂。然 而，去纤维蛋白会导致淋巴细胞的低产量，也可能增加红细胞污染 (3)。它也可引 起单核细胞的选择性丢失。Bøyum发现，纯度稍高的淋巴细胞的制备可采用依地酸 (EDTA) 而非肝素作为抗凝血剂来实现 (3)。另外，也应注意，在来自外周血之外的 其他来源的淋巴细胞的纯化中，加入肝素可能会导致细胞悬浊液发生胶凝现象。 大量血液样品: 在保证Ficoll-Paque PLUS和血液样品的高度与上述标准方法中的高 度大约相同 (分别为 2.4 cm和 3.0 cm) 的情况下，可通过增加离心管的直径对大量 血液进行处理，以获取相同的分离效果。增加离心管直径并不影响所需的分离时 间。 小量血液样品: 小量血液可采用Bøyum (5) 所描述方法的改进方法进行快速地处理。 样品储存：应在采集后尽可能快地对血液样品进行处理，以确保能够获取最佳结 果。据报道，室温下储存24小时可降低淋巴细胞的产量，表面标志表达的改变，以 及降低对促细胞分裂激素 (6) 的应答。 病态血液样品：为纯化从正常、健康人供体中获取的外周血中分离出来的淋巴细 胞，发展了上述标准方法。从受感染或有其他病理改变 (如癌症) 的供体身上采集 的样品中，可能会得到不同的结果 (见第 13页的“Ficoll-Paque PLUS的进一步应 用”)。 血小板去除： 该标准方法中所描述的洗涤操作在多数情况下可有效地将淋巴细胞 中混合的血小板去除。如果这样做有困难，在可能会采用在Ficoll-Paque PLUS之上 的4-20%蔗糖梯度分层进行离心的方法来去除血小板 (7)。作为备选，也可在 分离淋巴细胞前，通过与二磷酸- 5'-腺苷 (ADP) 发生凝集反应来去除血小板 (8)。 手册 18-1152-69 AC 2007-05 11 问题解决不完全履行 如按照推荐标准操作使用Ficoll-Paque PLUS，则预期可在无任何问题的情况下实现 人外周血中的淋巴细胞分离，获得第10页中“实验室典型结果”下显示的结果。然 而，某些实验参数的偏差可能会导致出现糟糕的结果，这里问题解决图表旨在帮助 对导致增殖性能降低的问题进行快速鉴定和纠正。 12 手册 18-1152-69 AC 2007-05 表现偏差 问题的可能来源 注释 增加红细胞和对淋巴细胞 A. 温度太低。 在低温下，Ficoll-Paque PLUS的密度 的污染。 较大，红细胞凝集较少，因此粒细胞 和红细胞被阻止进入 Ficoll-Paque PLUS层。应将温度增加到 18-20 ˚C。 B. 离心速度太慢和/或 必须采用适当的时间和地心引力 离心时间太短。 （g-force），以确保非淋巴细胞完全 沉淀。 淋巴细胞低产量和低 温度太高。 在高温下，Ficoll-Paque PLUS的密度 活力。 较小，一些淋巴细胞可能穿透 Ficoll-Paque PLUS层。因此，细胞成 活力也必然会受到影响。应将温度 降低到 18-20 ˚C。 正常活力的淋巴细胞 未用平衡盐溶液将血液 高细胞密度导致大量的淋巴细胞陷入 产量低。 稀释到 1:1；通常情况 红细胞团块中。应进一步稀释血液 下，红细胞比容较高。 样品。 淋巴细胞低产量和 离心机转子振动，导致 离心机转子振动可能导致淋巴细胞带 粒细胞污染增加。 梯度搅拌。 的增宽，与下层细胞混合。应检查转 子是否已适当平衡。选择合适的转 速，以避免自发共振频率。 淋巴细胞低产量和其他 样品含有非正常密度的细 可能遇到病态血液样品、非人血液样 细胞类型低活力及污染 胞；这些细胞的密度不同 品，或来自外周血之外的来源的样 于那些来自正常人血液中 品。PercollTM 是一用于密度梯度离 细胞的密度。 心的介质，可能比 Ficoll-Paque PLUS 更加适合此类分离。 采用 Ficoll-Paque PLUS 方法分离的淋巴细胞的特性 自从 1968年引进后，Bøyum所描述的淋巴细胞分离方法 (1,2) 已在很多免疫学研 究中被使用。这种普遍使用说明采用此技术可获取最佳结果，同时也可避免损伤淋 巴细胞的功能。尽管如此，也发现了分离操作所产生的一些效应，这些将在下面具 体陈述，对于具有重要意义的效应，就可能引发对相关研究环境的研究。 据报道，采用 Ficoll-Paque PLUS 进行分离会导致嗜细胞 IgG 被单核白细胞所吸收 (9)，从而导致不正确地高估含 Ig的淋巴细胞数量，和低估含Fc受体的细胞数量。该 干扰可通过在分离前使用平衡盐溶液冲洗血细胞来避免，从而去除血浆中引起这些 伪影的 IgG。 据报道，采用标准操作时，会发生与自体红细胞形成簇团的一定数量的淋巴细胞的 选择性丢失 (10,11)，已证实，这是特殊淋巴细胞与红细胞互相作用的结果，并非 一种非特异性俘获 (11)。据我们所知，该数量占血液样品中初始淋巴细胞的6%左 右，可通过对介质中的红细胞团块进行重新悬浮并以稍高于正常情况(如：1.083 g/ ml) 的浓度梯度进行重新离心处理后，几乎能定量的回收 (11)。 据报道 (12)，与在“富含白细胞的血浆”中的淋巴细胞 (未暴露于Ficoll-Paque PLUS 中) 相比，采用Bøyum的操作方法分离的淋巴细胞在混合淋巴细胞培养中表现出加 强的刺激。可能该加强的反应部分依赖于Ficoll-Paque PLUS方法中对混合淋巴细胞 反应有抑制作用的白细胞的去除 (12)。另外，据报道，Ficoll-Paque PLUS分离的淋 巴细胞表现出一升高的“自发”母细胞化水平，通过将3H-胸苷与未经促细胞分裂 剂刺激的培养物混合来对其进行测量，但是未发现导致这种加强的原因 (13)。在一 例报道 (14) 中，与采用离心冲洗方法制备的淋巴细胞相比，Ficoll-Paque PLUS分离 的淋巴细胞对植物血细胞凝集素 (PHA) 的促细胞分裂刺激的反应降低。 Ficoll-Paque PLUS 的进一步应用 自1968年Bøyum所描述的技术被引进以及其后续的广泛使用后，对该方法的大量 修改和延伸也得到应用。举例来说，如有需要，单核细胞 (采用该小册子里的标准 操作从淋巴细胞中回收而得) 可在 Ficoll-Paque PLUS上进行分离前通过用铁 (或羟 基铁) 培养血液样品被去除。单核细胞吞噬铁颗粒后，密度增高，结果它们通过 Ficoll-Paque PLUS层在离心管底部的红细胞团块中离心和聚集 (3)。 原始技术一项重要且广泛应用的延伸就是通过与选择性簇团形成 (集聚) 联合后，它 在淋巴细胞亚类分离中的应用。在最常用的情况中，使用标准操作 (有或无单核细 胞去除) 所获得的纯化的淋巴细胞利用一过量的绵羊红细胞 (红细胞与淋巴细胞的 比例至少为50:1) 进行培养，此处，T淋巴细胞与绵羊红细胞自发形成簇团。在Ficoll- Paque PLUS上进行再一次离心处理时，T淋巴细胞簇团会和过量的红细胞一起沉淀 到离心管底部，留下其他 (非簇团) 淋巴细胞在界面处 (3)。 手册 18-1152-69 AC 2007-05 13 14 手册 18-1152-69 AC 2007-05 用于淋巴细胞亚类分离的此类技术以及用于分离整个淋巴细胞数的标准方法已经广 泛应用于与正常对照组对比时疾病状态下的淋巴细胞功能和表面标志的研究。对于 此类对比研究来说，淋巴细胞的纯化方法不引起任何特殊淋巴细胞亚类的择优富集 或丢失，这一点是相当重要的。虽然在早期工作中并未认识到存在 Hokland 和 Heron (10) 所描述的可自体形成团块的淋巴细胞小亚型，但 Häyry et al. (15) 已经 对关于标准Ficoll-Paque PLUS操作可以避免此类变形的证据作了陈述。然而，在将 Ficoll-Paque PLUS技术应用于病态血液样品时，谨慎对待是必要的，因为，据发现， 所获取的淋巴细胞层可受到有某种感染病人 (16) 尤其是癌症病人 (17,18) 的未成 熟粒细胞的污染。在后一情况下，也可能出现单核细胞数量的增多 (19)。然而，在 一有关再生障碍性贫血或急性白血病免疫受损患者的研究中，淋巴细胞的分离在正 常情况下采用Ficoll-Paque PLUS并得到结果，且在联合通过葡聚糖沉淀来纯化红细 胞团块中的粒细胞的情况下，可引起血液样品中的病毒回收率的大幅度增加 (20)。 Ficoll-Paque PLUS已被用于成功地分离非外周血之外的各种来源的细胞，并对血淋 巴细胞分离作了专门的优化。因此，使异常体液或胸水中的癌细胞的和鉴定更 易实现的基于Ficoll-Paque PLUS上的分离可通过使用不同密度的Ficoll-Paque PLUS 的混合物，而非单一密度 (1.077 g/ml) (22,23) 的 Ficoll-Paque PLUS，来进行实施。 据报道，基于Ficoll-Paque PLUS上的分离也可辅助建立对羊水细胞的培养，并使其 随后的细胞形成分析更加容易 (24)。 Ficoll-Paque PLUS也被用于分离除人类之外的其他种属的淋巴细胞。在一些情况下 (如：牛、羊、兔)，改变标准操作以取得好的结果可能是必要的 (3)，应记住，虽然 已针对人淋巴细胞的分离对 Ficoll-Paque PLUS 浓度进行了优化，但 Ficoll-Paque PLUS浓度在用于其他种属的淋巴细胞分离时可能无法获得淋巴细胞的最佳产量和 纯度。然而，采用标准浓度的Ficoll-Paque PLUS的分离方法在鼠 (25)、狗 (26)、猴 (27)、牛 (28,29)、兔 (30)、马 (31)、猪 (31,32)，甚至鱼 (33) 淋巴细胞分离上的 应用已有相关描述。在任何需要使用到不同浓度而非1.077 g/ml浓度的溶液的地方， 使用作为替代品的离心介质Percoll (如有需要，描述了Percoll密度梯度介质的方法 和应用的手册都是可得的) 可能都是非常便利的，因为不同密度的等渗溶液在该介 质中非常容易制备，从而使对特殊分离的优化更易实现。据报道，采用Percoll的分 离在一些情况 (34-36) 下可获取已经改善的淋巴细胞产量和纯度。 可用性和储存 Ficoll-Paque PLUS可得的包装尺寸有两种：6 ´ 100 ml (代码编号：17-1440-02) 和 6 ´ 500 ml (代码编号：17-1440-03)。Ficoll-Paque PLUS为一无菌的可用液体，采 用玻璃瓶和橡胶隔片外盖封装。使用的完整说明已包含于每一包装中。Ficoll-Paque PLUS应避光储存于4-30 ˚C之间，在该条件下，它可保持3年的无菌状态和稳定性。 储存于阴冷的地方可延长其储存期。不建议对该产品冷冻储存，但如果只是偶尔冷 冻储存，则解冻后，应反复几次来回倒置玻璃瓶，以确保瓶中液体为均一溶液。 符合 ISO 13485:2003 和(GMP) 的 Ficoll-Paque PREMIUM Ficoll-Paque PREMIUM是一密度梯度介质*，用于人单核细胞的制备。它是从Ficoll- Paque PLUS的基础上发展而来，在同时使用 Bøyum (1) 发展的一简单快速的离心 技术的情况下，可实现人外周血中大量和小量单核细胞的纯化。 Ficoll-Paque PREMIUM与 Ficoll-Paque PLUS的不同之处在 于，它是在符合 ISO 13485:2003和 (GMP) (37) 的受严格控 制的环境下且按照美国药典 (USP) (38) 关于细胞治疗产品 生产的建议进行生产的。ISO 13485:2003 和(GMP) 的依从 性要求严格执行对生产规程的验证和资料文档化。 Ficoll-Paque PREMIUM可提供如下益处： ● 按照GMP和 ISO标准进行生产。 ● 按照美国药典 (USP) <1043> 中关于辅助材料的建议进行生产。 ● 无菌，即用型的试剂。 ● 内毒素水平较低 (< 0.12 EU/ml)。 ● 检测渗透压。 * 仅体外使用。 应用 针对人外周血中的单核细胞分离，已对 Ficoll-Paque PREMIUM进行了优化。另外， 该介质适用于来自其他来源包括脐带血和骨髓的人单个核细胞的分离。推荐实验设 计中对正常人外周血的分离主要会制备得到如下的单个核细胞： ● 分离组分中95 ± 5%的细胞为单个核细胞。 ● 分离细胞的活力为：90%。 ● 原血液样品中单个核细胞回收率为：60 ± 20%。 ● 3 ± 2%粒细胞。 ● 5 ± 2%红细胞。 ● 原血液样品中总血小板含量 < 0.5%。 手册 18-1152-69 AC 2007-05 15 规格 Ficoll-Paque PREMIUM由Ficoll PM400和密度为1.077 g/ml的泛影酸钠混合物组成， 针对人外周血中的单个核细胞分离，已对其进行了优化。Ficoll-Paque PREMIUM为 无菌产品，在建议储存条件下，其稳定性可保持 3年。 密度： 1.077 + 0.001 g/ml 稳定性： 避光储存于 4-30 ˚C，其稳定性可保持 3年 内毒素： 含量 < 0.12 EU/ml 渗透压： 288-310 mOsm/kg 完整的使用说明已经包含于每一包装中。 可用性和储存 Ficoll-Paque PREMIUM 可得的包装尺寸有两种：6 ´ 100 ml和 6 ´ 500 ml，Ficoll- Paque PREMIUM为一无菌的即用液体，采用玻璃瓶和橡胶隔片外盖封装。 Ficoll-Paque PREMIUM应避光储存于4-30 ˚C之间，在该条件下，它可保持3年的无 菌状态和稳定性。储存于阴冷的地方可延长其储存期。不建议对该产品冷冻储存， 但如果只是偶尔冷冻储存，则解冻后，应反复几次来回倒置玻璃瓶，以确保瓶中液 体为均一溶液。 16 手册 18-1152-69 AC 2007-05 手册 18-1152-69 AC 2007-05 17 参考 1. 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