药物长期毒性试验血液和生化指标的统计处理

Ch inese Jou rnal ofN ew Drugs 2010, 19 ( 4) 270 中国新药杂志 2010年第 19卷第 4期 [作者简介 ] 张晓冬,男, 讲师, 主要从事新药临床前药理毒理学研 究。联系电话: ( 021) 81871035, E-m ai:l xdzhang@ smm u1 edu1 cn。 [通讯作者 ] 袁伯俊,男, 研究员,博士生导师, 主要从事新药临床前 药理毒理学研究。联系电话: ( 021 ) 81871036, E-m ai:l new drug@ smm u1 edu1 cn。 #新药研发论坛# 药物长期毒性试验血液和生化指标的统计处理 张晓冬, 宗 英,陆国才,黄 矛, 袁伯俊 (第二军医大学基础部新药评价中心, 上海 200433) [摘要 ] 目的:探讨药物长期毒性试验血液和生化指标的统计处理。:长期毒性试验血液和 生化指标错误的统计处理, 为药物的临床前研究提供合适的统计方法。结果:应用 t检验进行啮齿类长期毒 性试验多个样本间的两两比较,会加大犯 I类错误的概率。非啮齿类长期毒性试验中血液和生化指标是重 复测量的,应先用球对称检验判断资料之间的相关性,然后用重复测量的方差分析进行组间和不同时间 点的比较。结论: 啮齿类长期毒性试验多个样本间的两两比较应采用方差分析。非啮齿类长期毒性试验中 血液和生化指标应用重复测量的方差分析较为合适。 [关键词 ] 统计; 长期毒性; 方差分析 [中图分类号 ] R96511 [文献标志码 ] B [文章编号 ] 1003- 3734( 2010) 04- 0270- 04 Statistics for hematological and serum biochem ical param eters in chronic toxicity studies of drug safety evaluation ZHANG X iao-dong, ZONG Y ing, LU Guo-ca,i HUANG M ao, YUAN Bo-jun (C enter forN ew Drug Evaluation, Institute of BasicM ed ica l Science, Second M ilitary M ed ical University, Shangha i 200433, China ) [Abstract] Objective: To study the stat istica lmethod in chronic tox icity stud ies of drug safety evalua tion1 M ethods: We ana lyzed the m istakes in statist ics for hem atological and serum b iochem ica l parameters in chronic tox icity studies, and offered a proper statisticalmethod for preclin ica lm edic ine researchers1 Results: Type I erro rs in comparing differences among groups in chronic tox icity studies of roden ts w ere increased when t test w as used1 The hemato log ica l and serum biochem ical parameters in chronic tox ic ity studies of nonroden ts are repeatedly meas- ured data1 For these data, M auchlycs test of spheric ity w as used to judge whether there w ere relat ions1 Then, re- peatedm easures analysis of variance w as used to compare differences among g roups and in differentmeasure t ime1 Conclusion: Ana lysis o f variance should be taken fo rmultip le comparisons in chronic tox icity stud ies of rodents1 R epeated measures analysis of variance is su itab le fo r variance ana lysis o f hematolog ical and serum b iochem ica l pa- rameters in chronic tox icity stud ies of nonrodents1 [K ey words] statistics; chron ic tox icity; analysis of variance 新药临床前毒理学评价是新药研究的核心内容 之一,如何科学评价临床前毒理学研究结果,对保证 患者的安全有重大意义。因此, 根据结果的数据类 型采用合适的统计方法、作出相应的统计判断、找出 规律性的结论对临床前毒理学研究具有重要的 意义。 多组均数比较应采用方差分析,如果采用 t检 验做两两比较, 犯假阳性错误的概率增大,结论的可 靠性低 [ 1]。非啮齿类动物长期毒性试验资料中多 数为重复测量的资料,应用重复测量的方差分析, 可 避免人为割裂资料的相关性。 Ch inese Jou rnal ofN ew Drugs 2010, 19 ( 4) 271 中国新药杂志 2010年第 19卷第 4期 1 单次测量的方差分析 大鼠长期毒性试验是新药临床前毒理学研究中 重要的研究内容之一。通过观察供试品对大鼠产生 的毒性反应及其严重程度,为非啮齿类动物长期毒 性试验和临床设计人用剂量和主要观察指标提 供参考。 通过对清华同方学术期刊数据库 2007~ 2009 年大鼠长期毒性试验的检索,有 19篇文章明确描述 所采用的统计方法,其中 10篇应用 t检验进行统计 处理, 9篇用方差分析 ( ANOVA ), 应用方差分析进 行统计处理的试验不到 50%。而大鼠长期毒性试 验一般设计有对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量 组。无论是试验组与对照组的比较,还是多组之间 的两两比较,都应用方差分析加多重比较进行统计 处理。 如 1所列数据, 某受试药物对大鼠血液学指 标红细胞计数 ( red b lood cell count , RBC )的影响。 如果应用 t检验进行比较, 结果见表 2。高剂量与对 照组的 P值为 01024,小于 0105,得出的结论是高剂 量组与对照组相比具有统计学意义, 即高剂量组 RBC与对照组相比显著降低。如果用方差分析进 行统计, F值为 21391, P值为 01065,大于 0105。因 此, 4个试验组 RBC的总体均数没有统计学意义, 即各试验组 RBC与对照组相比无显著差异。 表 1 某受试药物对大鼠血液学指标 RBC的影响 ( @ 1012# L- 1 ) 对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 鼠号 RBC 鼠号 RBC 鼠号 RBC 鼠号 RBC 7 7140 6 6163 < 2 7166 3 6193 11 7111 8 7142 15 6152 9 6108 12 7117 14 7110 19 7104 16 7118 28 7181 18 7129 26 6175 17 6121 39 6193 27 6182 36 7115 20 6138 表 2 表 1数据应用 t检验进行两两比较的 P值 P值 对照组 低剂量 中剂量 高剂量 对照组 ) 01302 01321 01024 低剂量 01302 ) 01911 01091 中剂量 01321 01911 ) 01143 高剂量 01024 01091 01143 ) 两种统计方法产生不同结果的原因, 是因为误 用 t检验进行多个样本均数的比较。首先与原试验 设计不符,割裂了整体设计。其次重复运用 t检验 对 4个组的均值进行两两比较,共需要 6次比较,增 加了犯假阳性错误的概率 [ 2] , 1 - ( 1 - 0105 ) 6 = 01265。而用方差分析, 在 A= 0105的情况下,犯假 阳性错误的概率即为 0105。如果控制犯假阳性错 误的概率仍为 0105,用 t检验进行比较, 就要调整 A 水准,即 1- ( 1- A) 6 = 0105, A= 01008 51, 高剂量 与对照组的 P值为 01024,大于 01008 51, 得出的结 论是高剂量组与对照组相比没有统计学意义,与方 差分析得出的结论相同。 2 重复测量的方差分析 通过对清华同方学术期刊数据库 1999~ 2009年 非啮齿类动物长期毒性试验的检索,也有 19篇文章 明确描述所采用的统计方法, 其中 15篇应用 t检验 进行统计处理, 3篇用方差分析, 只有 1篇用到两个 重复剂量的三因素设计资料的方差分析和两因素析 因设计资料的方差分析。而非啮齿类动物长期毒性 试验一般测试给药前, 给药期不同时间点, 停药时的 各项指标,为典型的重复测量的资料 [ 3]。如表 3某受 试药物对 Beag le犬血液生化指标中丙氨酸转氨酶 ( a lan ine am ino transferase , ALT )的影响,即为重复测 量的资料。 如果用方差分析进行统计处理, 结果见表 4,得出 的结论是给药前各试验组之间无统计学意义, d 90, d 180和 d 270时 P值均小于 0101。进而两两比较得出 的结果是, d 90时低剂量组与对照组相比有统计学意 义 (P < 0105), d 180时低剂量组和高剂量组与对照组 相比有统计学意义 (P < 0105和 P < 0101), d 270时高 剂量组与对照组相比有统计学意义 (P< 0101)。 根据以上统计结果, 得出的结论是低剂量组药 物在 d 90和 d 180时对 ALT有影响, 高剂量组药物 在 d 180和 d 270时对 ALT有影响, 中剂量组药物检 测各时间点均对 ALT无影响。这个结论明显有不 妥之处,首先没有量效关系, 其次低剂量组动物出 现反应时间较高剂量组早,如果仅用ALT作为毒性 Ch inese Jou rnal ofN ew Drugs 2010, 19 ( 4) 272 中国新药杂志 2010年第 19卷第 4期 表 3 某药对 Beag le犬长期毒性试验血清 ALT活性的影响 nmo l# s- 1# L- 1 犬号 d 0 d 90 d 180 d 270 空白对照 a 10 385 391 519 304 a 14 755 777 650 778 a 34 488 460 512 527 a 38 477 436 457 480 ` 5 683 634 671 661 ` 17 627 699 701 716 ` 27 421 311 436 452 ` 31 589 436 537 645 低剂量组 a 6 455 557 545 650 a 8 627 500 617 611 a 12 965 888 990 831 a 36 779 758 858 635 ` 21 806 811 752 956 ` 23 816 890 777 882 ` 33 895 812 890 975 ` 35 601 629 849 776 中剂量组 a 4 455 328 455 529 a 16 399 450 404 541 a 22 879 652 799 972 a 40 502 520 630 813 ` 1 364 314 422 450 ` 13 306 343 398 463 ` 15 752 790 859 761 ` 19 813 753 824 777 高剂量组 a 18 460 494 696 1 042 a 24 674 639 894 1 279 a 26 919 761 882 1 085 a 28 635 636 732 846 ` 7 512 352 711 1374 ` 11 793 425 1 020 1 573 ` 25 521 315 684 863 ` 37 635 571 936 893 表 4 表 3数据方差分析结果 时间点 F值 P值 d 0 21141 01117 d 90 71922 01039 d 180 61060 01003 d 270 111833 01000 指标,很可能把毒性剂量就定到低剂量。仔细研 究结果可见, 低剂量组动物给药前 ALT就较高, 给药后并没有较大变化, 反而是高剂量组动物随 着给药时间延长, ALT显著升高。这说明采用的 统计方法可能不恰当, 应该采用重复测量的方差 分析。产生的原因是因为长期毒性试验通常是 按照体重进行随机分组, 但生化和血液学指标并 不一定会均匀分布到各个试验组中 , 从而导致给 药前指标就有差异。假如采用用单因素方差分 析没有考虑到数据之间的相关性, 有可能得出不 正确的结论。 重复测量数据的方差分析首先进行的是球对称 检验 (M auch lycs Test of Sphericity) ,结果见表 5。可 以看出表 3数据是不满足球对称假设的 ( P < 0101), 说明重复测量数据之间存在高度的相关性, 用单因素方差分析是不妥当的 [ 4- 5]。用重复测量的 方差分析结果见表 6,可见 ALT, 组别和 ALT @组别 的 P值均小于 0101, 说明 ALT在不同时间点以及各 组之间有统计学意义,并且随着分组的不同而不同。 具体结果为 d 90, d 180和 d 270与 d 0比较均有统 计学意义 (P < 0101 ), 低剂量组和高剂量组与对照 组比较有统计学意义 (P < 0101) , 中剂量组与对照 组相比无统计学意义 (P = 01648)。 表 5 表 3数据球对称检验结果 V2值 自由度 P值 Ep silon矫正 G reenhou se-Geisser H uynh-Feldt Low er-bound 231689 5 01000 01622 01736 01333 表 6 表 3数据重复测量的方差分析结果 变异来源 F值 P值 ALT 231875 01000 组别 41950 01007 ALT @组别 101565 01000 进一步进行每个试验组在 4个时间点上的两两 比较,结果见表 7。由表中可见,与给药前相比对照 组和低剂量组在各时间点均无统计学意义。表明低 剂量药物对动物 ALT并没有显著影响。相反,在给 药后 d 270时,中剂量组 ALT与对照组相比显著升 高,高剂量组在给药后 d 90开始,到 d 270与对照组 相比显著升高,并给药随时间延长有增加趋势 (高剂 量组 d 270与 d 180相比, P < 0101)。 (下转第 289页 ) Ch inese Jou rnal ofN ew Drugs 2010, 19 ( 4) 289 中国新药杂志 2010年第 19卷第 4期 er, 1995, 39( 1 ) : 117- 1241 [ 14 ] BAKER DE1 Adefovir d ip ivox i:l focu s on its u se in the treatm en t of chron ic h epatitis B [ J ] 1 Rev G astroen terol D isord, 2005, 5 ( 2 ) : 89- 1001 [ 15 ] RIVK IN AM1 Adefov ir dipivox il in the treatm en t of chron ic hepa- t itis B[ J]1Ann Pha rma cother, 2004, 38( 4 ): 625- 6331 [ 16] SORBERA LA, SERRADELL N, BOLOS J1 Pradefovir m es ilate treatm en t of h epatitis B[ J]1 Drug s Fu ture, 2007, 32 ( 2) : 137- 1431 [ 17] T ILLMANN HL1 P 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