_型胶原蛋白复合碱性成纤维细胞因子海绵的研制

立 7150 (日本) ; 核酸扩增仪 ; PE公司 9600 (美国) 。 　 1 献血者人群中 TTV2DNA 检测结果 n TTV2DNA 阳性数 阳性率 ( %) 有偿献血者 275 26 914 无偿献血者 289 17 519 合计 564 43 716 　　χ2 = 2155 　P > 0105 　表 2 　　献血者 ALT水平与 TTV2DNA 检测结果相关性 n TTV2DNA 阳性数 阳性率 ( %) 单一 ALT异常无偿献血者 123 13 1016 ALT正常无偿献血者 257 11 412 　　χ2 = 5156 　P < 0105 　表 3 　　　不合格献血者中 TTV2DNA 检测结果 n TTV2DNA 阳性数 阳性率 ( %) HBsAg 阳性献血者 36 4 1111 抗2HCV 阳性献血者 24 3 813 单一 ALT异常献血者 123 13 1016 　　χ2 = 01027 　P > 0105 2 　结 　果 564 份职业献血者和无偿献血者血清标本中 , TTV2DNA 阳性率为 716 % (43/ 564) ; 123 份 ALT 异常血清标本中 , TTV2DNA 阳性率为 1016 % (13/ 123) 见表 1～3。 3 　讨 　论 　　最初报道[1 ] TTV 是应用代表性分析法 (DNA) 从 1 例 非甲～庚型病原不明输血后肝炎病人血清中发现大小为 500 bp 的产物 , 经提取纯化、转化和克隆 , 获得 DNA 序列 , 该 病毒克隆称N22 , 由于N22 克隆来源于 1 例名为 TT的病人 , 且与经输血传播病毒 (Transfusion transmitted virus , TTV) 巧 合 , 所以暂称为 TTV。我们选用保守区设计两对引物 , 采 用套式 PCR 法对有偿献血者、无偿献血者的血标本进行检 测 , 献血者人群的总阳性率为 716 % , 有偿献血者、无偿献 血者的 TTV2DNA 阳性率分别为 914 %和 519 %。结果证明了 广州地区献血者人群有 TTV 感染存在 , 但低于国内外报道 的献血者人群 TTV 感染率 [2 ,3 ] 。有偿献血者中的阳性率高 于无偿献血者 , 但无统计学差异 ( P > 0105) 。提示有偿献 血者可能为 TTV 感染的高危人群。也有报道称正常人群中 的感染率如此高 , 可能预示 TTV 的感染只是一过性而已 , 它的致病性值得怀疑 [4 ] 。 TTV 感染后致病强度尚少见报道 , 据观察 TTV 的致病 性较弱 , 而且愈后较好[5 ] 。但一些研究资料表明 , TTV2 DNA 的检出往往与 ALT增高相关。在不明原因 ALT升高的 献血者中 TTV2DNA 阳性率为 30 % , ALT 正常的献血者中 TTV2DNA 阳性率为 1618 %[3 ] 。本文结果显示 , ALT 升高组 的 TTV2DNA 阳性率明显高于 ALT正常组 ( P < 0105) 。这提 示 TTV 可能有致肝脏损伤的作用 ; 同时还表明 TTV 感染途 径是各方面的 , 感染率也是多样化的 , 除 TTV 与 HBV 和 HCV可能存在重叠感染外 , 可能还存在着“无症状携带 者”。这就给保证输血和使用血制品的安全提出新的课题 , 即如何切断 TTV 血源传播途径 , 尤其是对 TTV 携带者可能 带来的危险因素 , 应给予足够的重视。 参 考 文 献 1 　Nishizawa T , Okamoto H , Konishi K, et al1Novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in post2 transfusion hepatitis of unknown etiology1Bioche Biophys Res Commun , 1997 , 241 (1) ∶921 2 　Desia S M , muerhoff A S , Leary T P , et al1prevalence of TT virus infection in US blood donors and populations at risk for ac2 quiring parenterally transmitted virus1J Infect Dis , 1999 , 179∶ 12421 3 　周育森 , 何忠平 , 董京芳 , 等 1 中国人 TTV 部分基因克 隆及序列测定 1 军事医学科学院刊 , 1998 , 22 (2) ∶ 1071 4 　Fukuda Y, Nakano I , Kumada T , et al1Virus ( TTV) is not associated with acute sporadic hepatits1Infection , 1999 , 27∶ 1251 5 　Miyasakd A , Suzuki K, Abe K, et al1 High prevalence of TT virus (TTV) in patients with non A to non Gfulminant hepatitis ∶differences of clinical features and prognosis between TTV posi2 tive and negative patients1Nippon Rinsho , 1999 , 57∶13391 (收稿 : 2002 - 09 - 23) ·实验研究· Ⅰ型胶原蛋白复合碱性成纤维细胞因子海绵的研制 邹海燕 　叶春婷 　彭燕豪 暨南大学医学院第四附属医院广州市红十字会医院创伤外科研究所 (广州 　510220) 　　摘 　要 　以猪筋腱为主要原料提取和纯化 Ⅰ型胶原蛋白 , 并对其理化性质进行分析 , 包括 SDS - PAGE 蛋白质凝 胶电泳、氨基酸成份分析、紫外最大吸收光谱等。经过鉴定 , 证实所提取的是高纯度的 Ⅰ型胶原蛋白。在 Ⅰ型胶原蛋 ·36·广 　州 　医 　药 　2002 年第 33 卷第 6 期 白溶液中加入重组的人碱性成纤维细胞生长因子 (rhbFGF) , 经冷冻干燥成为海绵状的终成品 , 研制成为一种新型的 生物医学。 关键词 　Ⅰ型胶原蛋白 　碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 　海绵 　研制 Preparation of Collagen Compound bFGF Sponge Zou Haiyan , Ye Chunting , Peng Yanhao1 GuangZhou Red Cross Hospital , The Fourth Affiliated Hospital , Medical College ofJinan U2 niversity , GuangZhou 510220 , Abstract　Type Ⅰcollagen was extracted and purified from swine’s tendon1 The chemical and physical properties , included SDS2PAGE electrophoresis , composition of amine acid test and ultraviolet maximal absorption spectrum test were analyzed1 Type Ⅰcol2 lagen protein we made was confirmed with high purity1 bFGF solution was put into purified collagen solution , then becoming sponge by freezing drying , The collagen compound bFGF sponge was a new biomaterial for medical and research use1 Key words 　Type Ⅰcollagen protein ; Basic Fibroblast Growth Factor ; Sponge ; Preparation 　　纤维状的胶原蛋白是重要的结构蛋白 , 是体内含量最 多的蛋白质 , 达总蛋白量的 20 % , 在创伤修复中起着重要 的作用[1 ,2 ] ; 碱性成纤维细胞生长因子 (Basic Fibroblast Growth Factor , bFGF) 是一种重要的促有丝分裂原 , 在创伤 愈合中通过趋化作用、促增殖分化作用以及促合成分泌作 用等促进创面的愈合 [3 ] 。以这两种促创伤愈合的物质为原 料 , 研制一种新型的生物医学材料供临床和科研应用。 1 　材料与方法 111 　Ⅰ型胶原的制备 : 以猪筋腱为主要原料 , 利用 20 %的盐水脱脂、去血清 等成份 , 捣碎 , 然后用 015 mol/ L 的醋酸和胃蛋白酶溶解 , 盐析 , 再酸溶 , 用水透析至中性备用。蛋白质含量测定采 用羟脯氨酸测定法 [2 ] 。 112 　Ⅰ型胶原的理化性质检测 : 11211 　氨基酸成份分析 : Ⅰ型胶原蛋白溶液用 6 mol/ L HCl 水解氨基酸处理后 , 经 Waters 氨基酸自动分析仪测定氨基 酸含量。 11212 　SDS2PAGE电泳 : 采用 Tris2甘氨酸不连续分离系统 , 浓缩胶 C = 5 % (pH618) , 分离胶 C = 6 % ( PH818) , T = 1∶ 29。 11213 　紫外最大吸收光谱的测定 : 采用 Pekin Elrnerλ25 型 紫外分光光度计 , 胶原蛋白溶液浓度为 1153 g/ L。 113 　bFGF复合 Ⅰ型胶原海绵的研制 : 基因重组的人碱性成纤维生长因子 ( rhbFGF) 来自暨 南大学生物工程研究所 , 用无菌蒸馏水配制成母液。称取 上述已制备好的 Ⅰ型胶原溶液 , 与 bFGF溶液混合。冷冻干 燥制成海绵状成品。 2 　结 　果 211 　Ⅰ型胶原的氨基酸成份分析结果如表 1。其中甘氨酸 ( Gly) 占 33182 % ; 丙氨酸 (Ala) 占 10166 % ; 脯氨酸和羟 脯氨酸 (Pro + HyPro) 占 19175 %。 212 　Ⅰ型胶原蛋白的 SDS - PAGE 电泳图谱共有三条带 : 由一条二聚体β带和两条不同氨基酸组成的单链α带 (α1 和α2) 组成。 213 　紫外最大吸收光谱如图 1 所示。 图 1 　Ⅰ型胶原紫外吸收光谱 (λmax = 22615 nm) 3 　讨 　论 利用猪筋腱为主要原料提取 Ⅰ型胶原 , 材料来源丰富 , 猪与人的同源性也较高 ; 另一方面 , 利用筋腱来提取 Ⅰ型 胶原与采用皮肤为原材料相比∶皮肤中的胶原成份是 Ⅰ和 Ⅲ 型胶原的混合物 , 而筋腱中仅为 Ⅰ型胶原成份 , 纯度更高 ; 而且用皮肤作为原材料经过脱毛的步骤 , 操作较烦锁。 　　表 1 Ⅰ型胶原氨基酸成份分析表 mmol/ L 代码 含量 代码 含量 代码 含量 代码 含量 代码 含量 代码 样品 ASP 01851 GLU 11282 SER 01857 GLY 61650 HIS 01060 ARG 11081 THR 01446 ALA 21097 PRO 3 21245 TYR 01082 VAL 01437 MET 01335 ILE 01211 LEU 01550 PHE 01322 LYS 01519 HYPRO 3 11639 　　3羟脯氨酸和脯氨酸之比为 0173 ·46· 广 　州 　医 　药 　2002 年第 33 卷第 6 期 　　Ⅰ型胶原在正常生理条件下属不溶性胶原 , 难以用化 学方法提取[1 ,2 ] 。本文在酸性条件下用胃蛋白酶处理 , 将 Ⅰ 型胶原两端的非螺旋结构的端肽部分切除 , 使之变为可溶 而又不影响胶原分子的螺旋结构。从氨基酸成份的检测与 紫外最大吸收光谱的结果中可以看到 , 本法制备的样品为 高纯度的 Ⅰ型胶原。在氨基酸成份分析中 , 本样品的羟脯 氨酸和脯氨酸之比为 0173 , 紫外最大吸收峰在 22615 nm处 , 特征性的氨基酸组成如甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和羟脯氨 酸的含量 , 以及蛋白质的电泳图谱均与参考文献的图 谱和参考值一致[1 ,2 ] , 符合 Ⅰ型胶原的特征。 胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质 ; 也是细胞间质的重要成份 , 在溶解状态下胶原蛋白可形成 一种胶状溶液 , 可以刺激细胞分裂 , 并有利于细胞爬行至 伤口部位修复缺损 ; 胶原的降解产物可被细胞利用合成新 的基质[1 ] 。另外 , bFGF本身也是很好的促创伤愈合细胞因 子 , 对创面的愈合、血管和神经的再生有强的促进作 用[3 ,4 ] 。利用所提取的 Ⅰ型胶原加入 bFGF 溶液 , 在真空冷 冻干燥下冻干成 bFGF 胶原海绵 , 这样有利于保留胶原和 bFGF的活性 , 二者结合能更好地发挥其促进伤口愈合的作 用。 参 考 文 献 1 　李玉端 , 主编 1 细胞外间质的生物化学及研究方法 1 北 京 : 人民卫生出版社 , 198811 - 601 2 　永井裕 , 藤本大三郎 , 编著 1 胶原蛋白实验方法 1 上海 : 上海中医学院出版社 , 199211 - 761 3 　李斯明 , 邹海燕 1 多肽生长因子在软组织创伤愈合中的 作用 1 广州医药 11998 , 29 (2) ∶11 4 　陈鸿辉 , 唐 　毅 , 李斯明 , 等 1bFGF 对跟腱成纤维细胞 创伤愈合影响的体外研究 1 中国矫形外科杂志 , 2000 , 7 (5) ∶4561 (收稿 : 2002 - 08 - 21) 1 　硕士研究生 , 现在广州市儿童医院工作 早期营养干预对 SGA 大鼠体格生长的影响 邓会英1 　丘小汕 中山大学附属第一医院儿科 (510080) 　　摘 　要 　目的 : 了解生后早期营养干预对 SGA 大鼠体格发育的影响。方法 : 正常新生鼠仔和 SGA 鼠仔随机分四 组 : 正常对照组对正常大鼠正常饮食 (CC) 组。SGA 生后初 4 周正常饮食 (SC) 组 , SGA 鼠生后初 4 周低蛋白饮食 (SL) 组及高蛋白饮食 (SH) 组。4 周后各组均予正常饮食喂养。出生、第 1、2、3、4、5、8、12 周各测一次体重、 身长。结果 : (1) SGA 鼠出生体重、身长均显著小于正常鼠。(2) SL 组身长、体重自出生至 12 周均落后于 CC 组 , 有 显著性差异。(3) SC组体重、身长追赶生长 , 于生后第 5 周追至正常组范围 , 12 周时与 CC 组比较无显著性差异。 (4) SH组头 4 周身长、体重追赶生长迅速 , 12 周时身长与 CC 组比较无显著性差异 ; 体重则重于 CC 组 , 有显著性差 异。结论 : 宫内营养不良致 SGA 新生鼠出生体重、身长发育落后 ; 生后早期 (初 4 周) 营养状况对 SGA 大鼠早期体格 追赶生长及成年期能否达正常水平有重要的影响。 关键词 　宫内生长迟缓 　营养 　生长发育 　追赶生长 Abstract 　Objective : To study the effect of early2period nutrients on the development of body in SGA rats1Methods : The pups were divided into CC groups and SC groups (normal2protein diet p20) , SL groups (low2protein diet p10) , SC groups (high2protein diet p30) 1Body weight and length of rats were measured in the end of the first , second , third , fourth , fifth , eighth and twelfth week1Results : The mean values for the birth weight and length were significantly lower in SGA rats compared with normal rats1The body weight and length of SL pups didn’t catch up growth in early period after birth and couldn’t reach the normal adult value in 12th week , while SC pups exhibited catch2up growth and reached the normal adult values1SH pups caught up growth quickly and their length reached the normal adult values , while the weight were higher than CC pups in 12th week1Conclusion : The birth weight and length of body were markedly smaller in SGA pups subjected to nutrition restriction in uterine when compared with normal pups1Nutrition early af2 ter birth has important effect on body growth2development of SGA1 Key words 　Small gestational age rats ; Nutrition ; Body / growth2development ; Catch2up2growth 　　部分小于胎龄儿 (SGA) 生后 1 岁内特别是初 9 个月内 体格出现追赶生长现象 , 最终达正常成年身高水平 , 但仍 有 10 %～20 %个体不能追赶生长 , 持续保持小个体。生后 1 岁内 , 营养对生长起主导作用 , 即生长仍受营养物质 - ·56·广 　州 　医 　药 　2002 年第 33 卷第 6 期