军团菌检测方法概述

军团菌检测方法概述 1976年在美国费城第56届美国退伍军人年会上发生肺炎流行，与会149人中有34人死亡。1977年美国疾病预防控制中心CDC的McDade等[1] 从死亡者的肺组织中分离到该病的病原菌,并于1978年在军团病国际学术讨论会上定名此菌为嗜肺军团菌（Legionella pneumophila ,Lp）。这种疾病在世界上广泛存在，目前已确认军团菌属有50个种 ,共70个血清型[2]，能引起人类疾病的约有20种 ,其中与人类疾病关系最密切的是嗜肺军团菌（Lp），而在Lp血清1～15型中79%为血清1型(Lp1)，Lp6次之。在美国，90%的军团病由嗜肺军团菌引起，我国在1982年康晓明等首次报道一例[3]后，已有小规模爆发及散发病例。目前,除西藏自治区外所有的省、市、自治区（包括台湾省）均有军团菌病报道[4]。 军团病(legionnaires disease)主要是嗜肺军团菌引起的一种细菌性呼吸道传染病，临床上分为肺炎型和Pantiac热型。由于军团菌肺炎与其他肺炎不易区别，病程进展快，常被误诊误治，免疫功能低下者、老年人容易受到侵犯，病死率可高达15%～20%,且易暴发或流行。 军团菌广泛分布于天然淡水环境或人工水域中，人类是由于使用淋浴喷头、空调系统、温水浴飞沫、热水管龙头时吸入了其所产生的气溶胶而被感染。军团菌病作为一种“城市文明病”,已经成为现代化城市发展中所面临的一个重要公共卫生问，我国及其它许多国家已将军团病列为需要重点防治的一种新发传染病。因此早期快速的检测方法对诊断军团菌尤为重要，本文就对军团菌的检测方法作简要综述。 1 细菌培养 军团菌为革兰阴性杆菌，兼性胞内寄生菌。在含2.5%～5.0%的CO2环境中生长很好, 厌氧条件下不生长。最适温度为35～36℃，具有一定的耐酸性和耐热性[5]。在含a-酮戊二酸、L-半胱氨酸和三价铁离子的BCYE-a培养基上生长良好，菌落一般呈灰白色、紫色、蓝色或绿色，而在普通血平板、普通琼脂、巧克力琼脂上不生长。 培养的敏感性为50%～80%，特异性为100%[6]，且能检出所有的种，是军团菌检测的“金” [7]。培养法可对各种生物样品包括痰液、支气管肺泡灌洗液、肺组织、胸水、血液、粪便和各种环境水样、中央空调通风口、水龙头、淋浴喷嘴等的涂抹物进行检测。有些样品（如水样痰）需经热和酸预处理[8、9]，处理后的样品立即接种GVPC选择性培养基上，对疑似军团菌菌落进行革兰染色，并将革兰染色阴性的疑似菌落接种在BCYE-a和BCYE-Cys琼脂平板上。37℃温箱培养2d，凡是在BCYE-a培养基上生长而在BCYE-Cys培养基上不生长的菌落即可认为是军团菌。如在BCYE-a琼脂中加入0.01%溴甲酚紫和0.001%溴酚蓝，可用来鉴别和初步鉴定军团菌种[6]。 BCYE-a培养基是目前公认的一种较好的军团菌培养基。但军团菌生长缓慢(3～5d)、培养过程中很容易被杂菌掩盖,对实验人员技术要求又比较高，难以在临床普及。 2 血清学检测 检测患者血清中抗军团菌IgM及IgG抗体是检测军团菌感染的临床常用手段，可以做出特异性诊断，敏感性为70%～80%[10]。常采用的方法有间接免疫荧光抗体试验（IFA）、间接血凝试验（IHA）、微量凝集试验（MAT）、试管凝集试验（TAT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、Dot-ELISA方法等。 军团菌感染一般1周左右可在血清中检测出特异性IgM抗体,特异性IgG抗体在2周左右可检测到，1个月左右达到高峰，并在体内可持续数月。军团菌抗体水平诊断,双份血清效价呈4倍增长。单份血清效价,间接荧光法达1:128或以上；试管凝集试验达1:320或以上；微量凝聚试验达1:32或以上才有诊断意义。因大多数患者住院时间较短,未能收集到恢复期血清，即使收集到的双份血清又在时间间隔上偏短,故影响其血清学诊断。另外据报道,20%～30%的军团病患者无抗体滴度升高,血清学试验与其他微生物如支原体、结核杆菌、脆弱拟杆菌、铜绿假单胞菌等有交叉反应。且0～25%的健康人中,可能有嗜肺军团菌血清I型抗体水平增高,故检测单份血清中的IgG抗体难以区分是即往得病还是现症患者，缺乏早期诊断意义。另外血清学诊断无法对新出现的血清型进行鉴定，需要制作新的抗体血清。 IFA是最早用于嗜肺军团菌抗体检测的血清学方法,这种方法是1977年由美国CDC建立的,用于对美国费城退伍军人集会时暴发的肺炎患者血清进行检测。虽然IFA法已广泛用于本病的诊断,但抗体滴度达到足以诊断的水平较晚,且有假阳性结果。MAT方法简便 ,对军团菌病可早期诊断，当检测大量标本或检测早期凝集抗体出现时,能检测出血清中相应IgM抗体，其特异性为97%-99%,敏感性为80%[11]。ELISA法检测患者血清中嗜肺军团菌IgG总抗体,其结果判定更加客观、精确 ,适合发展成为自动检测法[12、13]，可用于回顾性诊断和作为军团菌感染的流行病学回顾性调查。Dot-ELISA方法检测军团菌抗体的灵敏度不够，也有出现交叉反应而导致假阳性结果的产生。间接血凝试验可诊断由嗜肺军团菌血清1～4型的抗体[14]。反向免疫电泳和乳胶凝集法也曾用于军团菌检测[15]。 3 抗原的检测 3.1 尿抗原的检测 大多数军团病患者的尿液中可排出一种具有热稳定性和抗胰蛋白酶活性的抗原,其浓度远远高于血清中的浓度。尿抗原主要检测嗜肺军团菌血清1型感染的标本,无法检查Lp其他血清型和非侵肺军团菌种引起的感染。欧美一些国家军团病主要是由Lp1引起的，故检查尿中Lp1抗原对早期诊断是有用的。Kohler等[16]对Lp1感染患者尿中可溶性抗原排出的开始时间和持续时间进行了监测，结果显示：患者发病1～3d尿抗原检出率为88%,4～7d为80%,8～14d为89%,14d以后100%的患者都可以检测到，并可持续300d以上。研究证明将尿标本浓缩后可提高检测的敏感性,特异性不受影响[17]。常用的检测方法有两种[6]：放射免疫检查法（RIA）和酶免疫法（EIA）。前者的特异性及敏感性均较好，但价格昂贵，具有放射性，对人体有害，逐渐被ELISA替代。后者应用广泛，灵敏度虽不高(77%),但特异性高达100%，且不具放射性。近年来发展了1种免疫层析快速定量检测尿液中嗜肺军团菌1型抗原的方法,利用兔抗嗜肺军团菌1型抗体作为捕获成分,兔抗嗜肺军团菌1型抗体结合胶体金作为检测成分,可在15min内得出结果,其敏感性和特异性各达95%[18]。 3.2 直接荧光抗体法(DFA) DFA检测法能快速发现各种被检病理标本或呼吸道分泌物中是否存在军团菌,特异性非常高，在流行环境中很适用。目前主要用于检测Lp,对非嗜肺菌株的检测较少。用DFA法对经培养法证实的军团菌患者的呼吸道分泌物进行检测 ,其阳性率为25%～75%，特异性>99.9 %。但其敏感性低，且与其他革兰氏阴性杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌有交叉反应，因此当标本中军团菌数量较少或病原菌为荧光抗血清未包括的新种(型)时，结果常为阴性。 4 分子生物学检查 4.1　核酸探针技术 现代分子生物学技术越来越广泛的应用在病原微生物的快速诊断中,原位杂交技术可根据军团菌核酸序列合成一段寡核苷酸作为探针对组织细胞进行杂交，以确定有无军团菌感染。这种方法直接使探针与细菌基因组作用，不需从细菌中提取核酸,结果表明具有较高的敏感性和特异性。1995年左培军等人用地高辛标记的特异性探针(870bp)对Lp1～Lp14的标准菌株和临床及环境分离的菌株进行检测,与血清学检查结果相符,灵敏度为1pgDNA。 4.2 PCR技术 自1989年,Starnbach首先采用PCR技术成功检测到水中军团菌DNA以来，此技术得到了很快的发展,以PCR为代表的分子生物学技术可用于军团菌菌株的复核鉴定和嗜肺军团菌种的鉴定，也可用于某些菌落形态难以与其他细菌区分或半胱氨酸生长依赖性试验结果不明显的疑似军团菌的鉴定，具有高度的敏感性和特异性。常用的方法有有常规PCR、套式PCR、半套式PCR、多重PCR、PCR-ELISA法、PCR-探针法等。 4.2.1 常规PCR(Rational PCR) 目前常用引物有用于检测军团菌属特异性的16SRNA和5SrRNA和用于检测嗜肺军团菌种特异性的针对mip基因和染色体DNA的引物LEG。Michio等[19]用5SrRNA与mip基因对27份冷却塔水样进行检测,25份检出军团菌,其中14份为嗜肺军团菌。郭军巧等[20]利用16SrRNA基因引物检测军团菌,敏感性达70.8%。Yamamoto[21]在检测冷却塔水和河水中军团菌时,对直接荧光抗体染色(DFA)和PCR法作了比较检测14件标本,DFA阳性率57%,PCR阳性率93%。因此常规PCR有利于疾病早期诊断,达到特异、灵敏、快速的目的，但在实验过程中,必须小心细致,防止污染,控制假阳性产生[22]。 4.2.2　套式PCR(Nested PCR) 套式PCR(Nested PCR)是常规PCR的发展和完善,是指利用两套PCR引物(巢式引物)对模板进行两轮PCR扩增反应。即后一次PCR扩增引物互补于前一次PCR扩增序列的内侧,从而降低了扩增多个靶位点的可能性,提高PCR检测的敏感性和特异性。鲁晓晴等[23]应用套式PCR和细菌培养法检测中央空调冷却塔水中嗜肺军团菌,结果显示：在所测试水样中40%嗜肺军团菌DNA为阳性,细菌培养法仅20%为阳性,显示了套式PCR检测军团菌的高敏感性和特异性。1997年H Miyamoto等[24]用16SrRNA引物(LEG225)结合其它LEG引物设计半套式PCR,扩增39株军团菌的16SrRNA基因,结果其敏感性为1fgDNA分子,与培养法的检出率79.5%相比半套式PCR的阳性率为91.8%。半套式PCR从重复性、稳定性、特异性、灵敏性等方面均较普通PCR好，特别适用于环境样本的检测。 4.2.3　多重PCR(Multiplex PCR) 多重PCR是在同一反应体系中加入两对或多对特异性核酸引物,如果存在与各引物对特异性互补的模板,可同时扩增出一条以上DNA片段。多重PCR方法优于单引物PCR,在于多对引物同时扩增,未扩增出的片断互为对照,提高检测的灵敏度和特异性，进一步排除了PCR假阳性、假阴性问题[25]。 邱琼等[26]用双重PCR法检测痰和气道灌洗液标本中的军团菌感染的报道中,通过1次PCR反应,不仅能检测嗜肺军团菌,而且能够检测非嗜肺军团菌,最低检出量为2×101cfu/ml，且较多次单引物 PCR 所用试剂少,时间短。应用于临床标本的检测后显示,检测的阳性率高于血清抗体的阳性率。张沪生[27]及金建敏[28]等用同样的方法检测军团菌感染,结果表明具有较好的敏感性、特异性和稳定性。因此该方法简便、快捷,为军团病分子流行病学调查及临床早期诊断提供了有效的检测手段。 4.2.4 PCR-ELISA法 PCR-ELISA是用PCR 扩增军团菌的特异靶序列后,通过和标记生物素的探针杂交,再经底物酶培养后,样品的结果可通过酶标仪来读取。朱利平等[29]将一对嗜肺军团菌引物分别标记有生物素和荧光素FITC,经PCR扩增后,将标记有生物素的PCR扩增产物加入链酶亲和素包被的微孔板中,洗去未结合物后直接加入碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体,待与荧光素结合后,再加入底物产生显色反应, 405nm波长测吸光值。能特异地检出嗜肺军团菌和米克戴德军团菌,检测灵敏度为150fg军团菌基因组DNA。刘广华等[30]针对16SrRNA的军团菌引物,将扩增产物进行微板孔杂交分析，用地高辛标记探针,最后加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,492nm波长测吸光度值。可测得19fg的军团菌基因组DNA。PCR-ELISA已成为近年来的研究热点，具有操作简便、灵敏、特异、易于质控等优点有望发展为临床常规的诊断方法。 4.2.5 PCR-探针法 PCR-探针法是用PCR反应扩增军团菌的特异性靶序列,并结合使用基因探针杂交检测扩增产物,不仅可大大地提高检测的敏感性，还保证其高度特异性。李达[31]建立检测嗜肺军团菌的PCR-探针法中,可测出水标本中35 CFU/ml的嗜肺军团菌。总之,PCR技术与探针杂交、DNA序列分析相结合,不仅可以作为临床常规诊断嗜肺军团菌病,更重要的是可用于军团菌毒力基因的检测,军团菌新变种的鉴定,对军团菌病的发病机理的研究等具有重大的实用价值[32]。