CXCR4_在肺癌转移中的作用及其机制研究

· ll9O· 匡堂盘盍 生 旦筮堕鲞筮 !塑 丛 丛 11 ， 2005．Vol 85．N 17 CXCR4在肺癌转移中的作用及其机制研究 苏丽萍 张进平 徐焕宾 陈晋 王缨 储以微 熊思东 【摘要】 目的 探讨CXCR4在肺癌转移中的作用及其机制。方法 将CXCR4不同达水平 的肺癌细胞(95C、95C-pC、95C-X4、95D、95D-pC、95D-ASX4)接种于裸鼠皮下并其转移能力。分 别通过趋化侵袭实验、明胶酶谱法、黏附实验、RT-PCR法 CXCR4／SDF-1对肺癌细胞迁移、基质 金属蛋白酶(MMP-2)活性、黏附能力、生长相关癌基因-ot(GRO-a)表达的调控；通过流式细胞术和共 聚焦显微镜观察肺癌细胞内纤维肌动蛋 白的合成和聚合情况；Western印迹分析 CXCR4／SDF．1对 ERK1／2磷酸化的影响。结果 CXCR4不同表达水平的肺癌细胞在裸鼠体内具有不同的转移能力， 95D．ASX4组有2／5的小鼠发生了转移，其肺转移结节的数目明显少于95D、95D-pC组(P=0．044)。 CXCR4特异配体 SDF．1ot可以诱导肺癌细胞的迁移和细胞骨架蛋 白纤维肌动蛋 白的合成和聚合； SDF．1et促进肺癌细胞 MMP-2活性、黏附能力和 GRO-a表达的增加；CXCR4中和抗体可以在一定程 度上抑制这些作用。SDF．1a可以诱导 ERK1／2的磷酸化。结论 肺癌转移在一定程度上依赖于 CXCR4／SDF．1的相互作用，他们通过调控肺癌细胞的运动性、MMP活性、黏附能力及 GRO-a的表达 参与肺癌的转移。 【关键词】 肺肿瘤； 肿瘤转移； 受体，CXCR4 The role of CXCR4 in lung~811o~r metastasis and its possible mechanism SU H-ping．ZHANG Jin- ping，XU Huan-bin，CHEN Jin，WANG Ying，XIONG Si-dD， Department of Immunology，Shanghai Medical College ofFudan University，Shanghai 20032，China Corresponding author：XIONG Si-dong 【Abstract】 0bjc~2tive To investigate tlle role of CXCR4 in tlle metastasis of human lung cancer and its possible mechanism．Me~ods Lung cancer cells of tlle lines 95C and 95D witll hish or low metastatic ootendal were transfeted witll CXCR4 antisense plasmid pcDNA-ASX4，whole length eukaryotic expression plasmid pcDNA-CXCR4(95D-ASx4 and 95C-x4 cell lines)，and corresponding plasmid pcDNA3(95C-pC and 95D．pC cell lines)．95C，95C-pC，95C-x4，95D，and95D-pC cells were i~ected subcutaneously into Balb／c nu／nu mice．4～5 mice in a group．The mice were observed twice a week．Ten weeks later tlle mice were killed and tlle tumor in situ and tlle lungs were taken out to undego histological examination．Th e effect of CXCR4 expression on tlle cell migration，MMP-2 activity，adhesion and GRO-a expression of lung cancer cells were detected by chemotaxis and chemoinvasion assay，zymography，adhesion assay and RT-PCR respectively． I e polymerization of F-actin was measured by FACS and confocal microcopy．Western blotting was used to detect the phospharylation of ERK1／2 in 85D cells Results Metastasis was not found in the Il1ice iniected witll 95C and 95C．pC cells，and was seen in 2／5 ofthe mice injected with 95C-x4 cells，3／4 0ftlle mice injected witll 95D and 95D．pC cells，2／5 of tlle mice i~ected with 95D-ASx4 cells，however， tlle number of metastatic nodes in tlle lun gs of 95 D．ASX4 group was significantly less than tllose in tlle 95 D and 95D．pC groups(P=0．O44)．SDF-1a，aCxCR4 specific hgand，inducedthemigratory responseand F- actin"polymerization in tlle lung cancer cells：SDF．1 a promoted tlle MMP-2 activity，tlle adhesion to vasc~ endothelial cells and GRO．a expression：and neutralizing CXCR4 antibody inhibited these effects to some degre e_Moreover．SDF．1a induced tlle phosphorylation of ERK1／2 in human lung cancer cells．Conclusion Metastasis of human lun g cancer depends on，to some degee，tlle interaction of CXCR4 and SDF-1 that are involved in t}Iis proeess by regulating the active locomotion，MMP-2 activity，adhesion ability or GRO-a expression． 【Key words】 Lung neoplasms； Neoplasms metastasis； Receptors，CXCR4 基金项目：国家教育部科学技术重点资助项目(O3o63)；国家杰 出青年科学基金资助项目(39925031) 作者单位：200032复旦大学上海医学院免疫系 教育部分子医学 重点实验室 上海基因免疫和疫苗研究中心 通讯作者：熊思东 ． 论 著 ． 趋化因子是一大类具有趋化作用的细胞因子， 根据其 N端前两个半胱氨酸(Cys)的数目和排列方 式不同分为 CC、CXC、C和 CX3C四个家族，相应地 趋化因子受体依据结合的趋化因子类型不用，划分 维普资讯 http://www.cqvip.com 生 旦 旦筮堕鲞筮 !期 丛 May 11，2005，V。1 85 ． N。．17 为 CCR、CXCR、XCR和 CX3CR L1]。CXCR4是近年 来倍受关注的一个受体，除了在造血生成、机体发育 和HIV感染中发挥着重要作用外，最近的研究显示 CXCR4与其配体SDF一1的相互作用与某些肿瘤的 进展和抑制有关 。我们已有的工作发现CXCR4 在发生转移的肺癌组织中高表达，同时在不同转移 潜能的肺癌细胞株中也发现CXCR4的差异表达，这 均提示了CXCR4与肺癌转移有关 J。本研究借助 于裸鼠人肺癌皮下移植瘤 自发转移模型研究了 CXCR4表达对肺癌细胞转移能力的影响并对其参 与肺癌转移的相关机制进行探讨。 材料与方法 一 、材料 逆转录酶(MBI)，TaqDNA多聚酶(Biostar，加拿 大)；Fibronectin、Matrigel、TRITC—phalloidin(Sigma， 美国)；SDF．1 (Cytolab，以色列)；CXCR4抗体 (MAB173)(R&D，美国)；ERK1／2和 P—ERK1／2抗 体(Cell Signaling，美国)；6～8周龄雄性BALB／c裸 小鼠购自中科院上海动物实验中心。高、低转移潜 能肺癌细胞株95C、95DL6' 由本校分子遗传室提 供。95D．ASX4和95C．X4分别为转染 CXCR4反义 质粒 pcDNA．ASX4和全长真核表达质粒 pcDNA— CXCR4(图 1)，并经 G418筛选而获得的稳定转染细 胞株，95C．pC和 95D—pC为其相应的 pcDNA3转染 质粒对照细胞株，以上细胞株均由本室建立。 二、方法 1．RT．PCR：(1)细胞制备：将95D细胞按 5× 10 ／孔预先接种在6孔板中，加入新鲜的无血清培 养基，培养24 h后，加入终浓度 100 rig／ml SDF一1 ， 分别于0⋯1 3 6 h后收集孔内细胞，然后提取细胞 总RNA，进行GRO．仪表达分析。(2)RT—PCR：采用 异硫氰酸胍．酸性一步法提取细胞总RNA，按说明 B 进行 cDNA第一链的合成。然后以cDNA为进 行 PCR。根据 GeneBank中 CXCR4、GRO． 的基因 序列 设 计 引 物，CXCR4上 游：5 AATCTI'CCT． GCCCACCATCT 3 ，下游：5 GACGCCAACATAGAC． CACCT 3 ，产物大小为 367 bp。GRO． 上游：5 GCCCAAACCGAAGTCATAG 3 ，下 游：5 TAA GCGATGCTCAAACACATFA 3 ，产物大小为249 bp。 同时 以人 GAPDH 为 对 照，上 游：5 CTGCAC． CACCAACTGC，rrAG 3 ，下游 ：5 CCACTGACACGTo TGGCAGTG 3 ，产物大小为 275 bp。PCR产物采用 凝胶图象扫描仪拍照并进行条带灰度分析(天能 UV一2000，上海)，以与 GAPDH的比值表示其相对 含量。 2．流式细胞术分析细胞表面 CXCR4表达：用 抗CXCR4抗体孵育细胞，4℃孵育30 min，PBS洗3 遍，加入荧光素异硫氰酸酯(FITC)．羊抗鼠IgG，4℃ 孵育30 rain，PBS洗3遍，流式细胞仪分析。设置同 型对照。 3．细胞体内转移能力测定：收集处于指数生长 期 的 95C、95C—pC、95C—X4、95D、95D-pC和 95D— ASX4细胞，以8×10。／400 接种于裸小鼠肩胛部 皮下，每组4～5只，每星期观察2次，10周后统一 处死。分离裸小鼠原位肿瘤和肺脏，解剖显微镜下 观察肺转移情况，然后将肿瘤和肺脏固定于中性缓 冲福尔马林液中，制成 5 m厚的石蜡切片，HE染 色。 4．趋化侵袭实验：用48孔趋化小室，参照文献 [4]。抑制实验时，细胞分别与 CXCR4中和抗体 (50 g／m1)37~C孵育30 min，然后按文献方法作趋 化侵袭试验。每组设置3个复孔。趋化膜固定后行 HE染色，计数光学显微镜下 5个视野(×100)的细 胞数。 5．明胶酶谱实验：将 5×10 ／孔细胞预先接种 图1 CXCR4反义和全长表达质粒图谱 A．CXCR4反义表达质粒；B．CXCR4真核全长表达质粒 于96孔板中，加入新鲜的 含有或不含有 SDF一1 (1130 ng／m1)无血清培养基，继续 培养 24 h，收集细胞上清， 根据细胞计数调整各组细 胞培养上清液中的蛋白浓 度。参照文献[8]检测细胞 明胶酶活性。 6．黏附实验：将 ECV一 304细胞预先接种于96孔 板中，加入100 含SDF— 维普资讯 http://www.cqvip.com 生 旦 旦筮堕鲞筮 !翅 丛 ，May 11，2005．V。1 85．N 17 let(100 ng／m1)新鲜培养液，于室温下作用20 min。 洗涤备用。收集95D细胞，按4×10 ／ml悬浮于1 ml RPMI一1640培养液 中，加入 5 (10 mg／m1) calcein AM，于37℃孵育30 min后，洗涤3次，分别 于每孔中加入100 l，每组3个复孔，37oC、5％CO 孵箱中孵育20 min后，轻轻洗去未黏附细胞。收集 细胞，用流式细胞仪检测。 7．细胞骨架蛋白含量和聚合分析：将95D细胞 按5×10 ／孔接种在 0．01％多聚赖氨酸处理或未处 理的6孔板中，加入新鲜的无血清培养基，继续培养 24 h，加入终浓度 100 ng／ml SDF—let，作用 5～15 min后，参照文献[4]进行纤维肌动蛋白检测。 8．Western印迹检测 ERK1／2磷酸化：将 95D 细胞预先接种于6孔板中，于无血清培养液中过夜 培养，加入 100 ng／ml SDF—let，分别在 0、5、15 min 于每孔中加入 200 上样缓冲液，收集细胞裂解 物，样品定量后，沸水煮5 min，然后用 10％ 十二烷 基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分离后 电转移至硝酸纤维素膜，5％脱脂牛奶室温封闭1 h， 弃去封闭液，加入1：1000稀释的兔抗人ERK1／2和 磷酸化ERK1／2，4~C反应过夜，TBST漂洗3次。加 入羊抗兔IgG—HRP(1：50稀释)，室温作用1 h，TBST 漂洗3次。加入 DAB显色液，等阳性区带显色清晰 后，于 PBS缓冲液终止反应，拍照记录。 9．统计学 分析：数据 以 -4-s表 示，应 用 SPSS10．0统计软件进行数据分析。多组间均数检 验采用q检验，两组间均数检验采用 t检验。 结 果 1．流式细胞仪检测不同细胞株 CXCR4的表 达 ：95C、95C—pC、95C—X4、95D—ASX4、95D和 95D— pc细胞表面CXCR4表达水平不同，CXCR4在高转 移潜能肺癌细胞株95D的表达(49．38％)高于95C (21．94％)；95C、95D细胞转染空质粒 pcDNA3后， 均不影响其表面 CXCR4的表达；95C细胞转染 CXCR4全长真核表达质粒 (95C—X4)后，其表面 CXCR4表达(49．50％)显著升高，达到95D细胞水 平；相反地，95D细胞转染 CXCR4反义真核表达质 粒(95D—ASX4)后，表面 CXCR4表达(20．83％)显 著降低。 2．不同细胞株体内接种后肿瘤转移能力分析： 将上述CXCR4不同表达水平的肺癌细胞分别接种 至裸鼠肩胛部皮下后发现，多数裸小鼠在3周左右 于接种部位皮下长出肿瘤，并逐渐增大，10周后，各 组肿瘤细胞在裸鼠体内具有不同的转移能力。 95C、95C—pC组裸鼠体内未见转移，而95C．X4组有 2／5的小鼠发生了转移(图2)；95D、95D—pC组的裸 鼠分别有 3／4的小鼠发生了转移，而 95D—ASX4组 有2／5的小鼠发生了转移，而且其肺转移结节的数 目明显小于95D、95D—pC组(P=0．044)(图3)。 3．CXCR4／SDF一1对 MMP_2活性的调控：未经 SDF—let活化 的 95D分泌一定活性的 MMP_2，经 SDF—let刺激24 h后其 MMP-2活性高于前期活性 (P=0．0072)，而CXCR4中和抗体在一定程度上可 以抑制这种作用(P=0．0075)。 4．CXCR4／SDF一1对肺癌细胞运动能力 的调 控：与对照组相比，SDF—let可以诱导细胞发生迁移、 侵袭，而抗CXCR4中和抗体可以明显抑制这种作用 (图4)。SDF—let刺激后，细胞内纤维肌动蛋白含量 由10．55％上升至55．56％，提示 SDF—let可以诱导 细胞纤维肌动蛋白的合成。进一步通过激光共聚焦 显微镜观察发现细胞内肌动蛋白排列方式发生了显 著改变，在无血清培养液中过夜培养的细胞，其肌动 蛋白排列紊乱，而SDF—let作用后，纤维肌动蛋白的 合成增加，表现为细胞内纤维肌动蛋白聚合重排，排 列有序呈束状(图5)。 5．CXCR4／SDF一1对肺癌细胞黏附能力的调 控：与对照组相比，ECV~04细胞经 SDF—let处理 后，95D细胞与其相对黏附率由22．4％4-1．3％升 至50．9％-4-2．6％(P<0．01)。肺癌细胞与CXCR4 图2 不同细胞株体内转移能力分析 2A．95C、95C-pC组裸鼠肺组织未见转移结节 HE×100； 2B．2C．95D、95D．pC．95D．ASX4和95C-X4组裸鼠肺组织，有明显转移灶(箭头) HE×100 中和抗体预先孵育后，与 SDF—let处理后的血管内皮 细胞的黏附率明显降低(P = 0．0003)。 6．CXCR4／SDF．1对促 血管生成趋化因子 GRO·0【 的调控：与未处理组相比， 在 SDF—let刺激后 1 h时细 胞内GRO—amRNA表达开 维普资讯 http://www.cqvip.com Q 生 旦筮 鲞筮 !期 丛 a，May 11，2005．Vol 85．N。．17 95C 95C——pC 95C-X4 95D 950-pC 95D-ASX4 注：’与95D、95D—pC组比较，P=0．044 图3 不同细胞株体内肺转移结节数目比较 250 200 藿15o 募 授 100 5O O 0 SDF一1Ⅱ CXCR4Ab Isotype 注：’SDF—la组与对照组相比，P<0．01； SDF．1a组与 CXCR4组相比，P<0．01 图4 CXCR4／SDF·1对肺癌细胞趋化侵袭作用的影响 图5 SDF—la诱导肺癌细胞内纤维肌动蛋白聚合 图5A．SDF—la作用前肌动蛋白的排列杂乱 无序；图5B，5C．SDF—la作用后肌动蛋白的排列呈束状 0 5 15 (min) _ 睡 赣 瓣 图6 CXCR4／SDF．1诱导肺癌细胞内ERK1／2磷酸化 始升高，3 h达高峰(P=0．0017)，并持续到6 h。抗 CXCR4中和抗体在一定程度上抑制这种作用，表现 为SDF—lot刺激后，抗 CXCR4中和抗体预先孵育的 细胞内GRO一0【mRNA表达未发生明显改变 (P< 0．01)。这表明 CXCR4／SDF一1可以调控 GRO一0【的 表达。 7．CXCR4／SDF一1诱导肺癌细胞内ERK1／2磷 酸化：SDF—lot作用后 5和 15 min时，ERK1／2均发 生了磷酸化，其中15 min时磷酸化较明显(图6)。 表明SDF一1 0【与肺癌细胞表面 CXCR4的相互作用 可以活化细胞信号传导通路分子MAPK通路。 讨 论 肿瘤转移发生取决于肿瘤细胞特性、宿主特性 以及二者的相互作用，本研究结果显示 CXCR4不同 表达水平的肺癌细胞在裸鼠 体内具有不同的转移能力。 CXCR4介导的肺癌转移需要 其特异性配体 SDF一1浓度梯 度的存在，我们在发生转移的 裸鼠肺淋巴结中检测到较高 水平SDF一1，并证明了人与小 鼠的 SDF一1无论核苷酸序列 或氨基酸序列均高度同源，其同源性达到99％(结 果未显示)。在这种情况下，从原发肿瘤部位脱落 的CXCR4 细胞沿着 SDF一1的浓度梯度发生特定器 官的转移。尽管在裸鼠的肝、骨髓中同样检测到了 较高水平的SDF一1，但肺癌细胞并未发生这些部位 的转移，这可能是肿瘤转移过程中，宿主特定器官内 局部微环境中其他分子如黏附分子、生长因子等并 不支持肿瘤细胞在这些部位的定居和生长。 肺癌的侵袭转移在某种程度上是由于 CXCR4／ SDF一1的相互作用导致，但目前CXCR4／SDF一1参与 肺癌侵袭转移的机制仍未完全阐明清楚。许多研究 表明肿瘤转移和炎症细胞浸润有着相似的形成过 程，如均涉及到细胞滚动、黏附和跨内皮迁移等 J。 趋化因子在炎症细胞活化、迁移和准确定位中的重 要作用，提示趋化因子及其受体可能通过与炎症细 胞浸润相似的机制参与了肿瘤的进展和侵袭转移。 本研究发现CXCR4／SDF一1的相互作用可以触发与 肿瘤转移有关的多个事件的发生，如肿瘤细胞的侵 袭能力、肿瘤细胞的运动能力、与血管内皮的黏附能 力等。 肿瘤细胞转移过程中的一个必需步骤是穿越基 底膜和侵入周围基质。这一过程有许多的蛋白溶酶 参与，基质金属蛋白酶 (MMP)是其中重要的一 加 5 O 赫 姆簿毒睾餐 维普资讯 http://www.cqvip.com 生 旦 旦筮堕鲞筮 !翅 J China，May 11，2005．Vo1 85．Nm 17 种 ⋯¨。CXCR4／SDF一1的相互作用调控了肺癌细胞 MMP-2活性，使得肿瘤细胞易于从原发部位脱落， 侵袭人细胞外基质和血管，发生远处转移。肿瘤细 胞分散后必须获得足够的运动能力才能侵人基底 膜，因此运动性是评价肿瘤细胞体外转移潜能的指 标之 一。本研 究 结 果显 示，SDF—lot可 以诱 导 CXCR4 肺癌细胞发生迁移、侵袭，并能诱导肺癌细 胞内纤维肌动蛋白的合成和重排，表明了CXCR4／ SDF一1的相互作用调控肺癌细胞的运动性，从而参 与肺癌细胞的转移过程。肿瘤细胞到达远处后，最 早期最重要的一个步骤是肿瘤细胞黏附至血管内皮 细胞，近年来越来越多的证据表明转移能力与黏附 力呈正相关 ¨ 。本研究进一步研究结果显示， CXCR4／SDF一1通过调控肺癌细胞与血管内皮细胞 的黏附这一机制而参与了肺癌的侵袭转移。有研究 表明CXCR4／SDF一1通过调控造血干细胞、淋巴细胞 表面的某些黏附分子如 VLA4、VLA-5、LFA一1等的 表达，而介导了他们的归巢和再循环过程 ¨" 。本 研究中 CXCR4／SDF—I相互作用可能是通过调控这 些细胞表面某些黏附分子的表达或者活性，影响了 肺癌细胞与血管内皮细胞的黏附，从而影响了肿瘤 细胞的侵袭转移能力。这也是 CXCR4／SDF一1参与 肿瘤细胞转移的可能机制之一。对于 CXCR4／SDF- 1的相互作用调控了肺癌细胞表面何种黏附分子的 变化及其确切的分子机制仍需进一步深入研究。 研究表 明，CXCR4／SDF一1可 以促血管生成， SDF一1或CXCR4敲除小鼠胃肠血管形成异常，并有 心脏膜性室间隔缺损 。因此 CXCR4／SDF一1可 能通过促进新生血管形成而参与肺癌的转移。肺癌 细胞表达一定水平的GRO一0【，作为ELR+CXC家族 的一员，GRO一 与肿瘤细胞的转化、生长和新生血 管的形成有关 。本研究发现 CXCR4／SDF一1的相 互作用可以调控95D细胞中GRO一0【的表达，这可能 是CXCR4／SDF。1参与肺癌转移的一个新的机制。 SDF一1与T细胞表面的CXCR4结合后，通过激 活ERK1／2分子而介导了细胞迁移 。本研究发 现SDF—lot可以诱导肺癌细胞内ERK1／2分子磷酸 化，提示 CXCR4／SDF一1的相互作用可能通过激活 MAPK通路的机制，从而进一步活化下游分子而参 与了肺癌细胞的侵袭和迁移。 总之，肺癌转移在一定程度上依赖于 CXCR4／ SDF一1的相互作用，他们通过不同机制在多水平上 参与了肺癌侵袭转移的过程，提示了以CXCR4为靶 分子进行干预在肺癌转移治疗中的潜在应用价值。 参 考 文 献 1 Z1otnic A，Yoshie O．Chemokines：a new classification system and their rDle in immunity．Immunity。2000。12：121—127． 2 Aiuti A，Tavian M，Cippo ni A。et a1．Expression of CXCR4，the receptor for stromal cel1．derived factor-1 on fetal and adult human lympho—hematopoietic progenitors．Eur J Immnnol，1999。29：1823— 1831． 3 Feng Y，Broder CC，Kennedy PE，et a1．H1V一1 entry cofacter： functional cDNA cloning of a seven—transInembi~ne。 G protein— coupled receptor．Seience，1996，272：872-877． 4 Muller A。Homey B，Soto H，et a1．Involvement of chemokine rec印 tots in breast can cer metastasis．Natare，20ol。410：50-56． 5 Dunussi—Joannopoulos K，Zuberek K，Rnnyon K，et a1．Effieacious immunomedulatory activity of the chemokine stromal cell-daived factor l(SDF．1)：foeal secretion ofSDF-l at thellllnor site sel-v~∞ T—cell chemoattractant and mediates T-cell-dependent antillmsl~ responses．Blood．20o2．100：1551．1558． 6 Lu XL，Wang J)(，Li XH，et a1．Spontaneous metastasis at elanal 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