昆明医学院学报2005。(4):2I~23
AcadeIlIicJo啪lalofKu眦虹llgMedicalCo¨ege
CN53一1049/R
蒸簇鬻鬻誉藜
等位特异PCR
检测IL一6基因启动子区一634C/G多态性
安新焕¨,宋滇平¨。王玉明2’
(I)昆明医学院第一附属医院糖尿病科;2)检验科,昆明650032)
[摘要]目的:应用等位特异PCR法检测IL一6启动子区一634位C/G变异,以探讨贼R应用的可行
性.方法:应用AsPCR法和PCR一融?LP法同时检测10l例研究对象IL一6启动子区一634位C/G变异的多
态性,并对二者的结果进行比较研究.结果:(1)除一个Cc基因型结果不一致外,其余的0G、GG和CC基
因型两种方法的结果都一样;(2)ASPCR在单点突变多态性的检测中,具有省时、快速和成本低等优点,结
论:APCR方法检测基因的已知突变,具有快速、准确、省时、价格低等优点,在满足引物模板间碱基错配
能阻止引物延伸的条件下,可优先选用此法.
[关键词]等位特异P(、R;白介素6基因;多态性;聚合酶链反应限制性片断长度多态性
[中图分类号](175[文献标识码]A[文章编号]1003—4706(2005)04一0021—03
AlleleSpecificPCRMethodDetecting
theP01)1【norphismofIL一6GenePrImloterR℃gion一634C/G
AN)(jn-huan¨,SoNDDian—ping¨,wANGYu—r11in孑’
(1)I砌.o厂D池施舀;2)D班.盯L砌嗍删,1k15£蛳妇删H0咖越谚K“n碱咏M反i碰僦比ge,
K孔九"矗7曙650032,Cm竹口)
[Abstract]0bjective:Todetectthe—ymorphismofIL一6genepronloterregion一634c/Gbyallele
specificPCRmethcHd.Methods:nlepolymorphismofIL一6genepromoterregion一634C/Gin101sub—
jectswhosegenotypesweredetectedbyPCR—RFLPweredetectedbyallelespecificPCRmethod,theresults
ofthetwomethodswereteStedandvedfiedwitheachother'andthetwomethodswereaSSessed.ReSults:
(1)ThereSultsofCG、GGand(℃genotypeswereidemicaJexceptonecaseofCCgenotypeinthetwometh—
odS.(2)~lelespecificPCRmethod、^mspeedyandaccuratewithaklwc∞t.C钿clusion:Whendetectinga
known嘶ntmutationofcertaingene,alldespecificPCRmethodwillbe西venpd谢tyoverPCR—RFLP
methodifrnjsmatchingofbaseandprimerS∞uldpreventprimereXtension.
[Keywords]~lelespecificPCR;IL一6鲫e;POIyTnorp}1iSm;PCR—RFLP
等位特异PCR(ASPCR)方法是检测DNA
片段是否存在已知位点变异的常用方法,具有快
速、省时、价格低廉、检出率高¨j等优点,分别
使用与突变位点碱基相匹配的引物同时进行两个
P(、R扩增,扩增产物电泳后,根据条带的有无来
判断相应的基因型.现用ASPCR方法对IL一6—
634C/G多态性进行检测,与PCR—RFLP所得的
结果互相验证,并比较两种方法的优劣,为以后
的科研工作提供更多的方法学的参考.
1材料与方法
1.1研究对象
选取研究对象共101例,其中正常对照组43
例,糖尿病组58例.这些研究对象均已用PCR
[基金项目]云南省教育厅基金资助项目(042021c)
[作者简介]安新焕(1969~),女,河南洛阳人,主治医师,医学硕士,主要从事糖尿病及其并发症的相关研究
和临床工作.现在广东省中山市人民医院内分泌科工作.
万方数据
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昆明医学院学报 第26卷
一RFLP方法检测过其IL一6—634C/G基因型.
1.2材料
主要仪器:PE9600基因扩增仪(美国Perkin
EImer公司);P0werPac3000型电泳仪和Gd
【)0c1000紫外图像分析系统和配套的分析软件
(美国BIO—RAD公司).
主要试剂:自行设计三条引物上游引物5’一
GCAGGCCAACC唧CTAAG一37,下游两条引
物分别为5乞TGGCTC姗TGAGG一37和
57~TGGCTCTl姗G,rGAGC一37,上下游引物
分别组成C、G两个反应体系.TaqDNA聚合酶、
dNTP和100bp递增的DNA分子量标记(Mark.
er)均购于华美生物工程公司;Naa、Ka、Mg—
C12、Tns、EDTA和SDS均为国产分析纯.
实验方法:模板、Dr姐的抽提:用酚/氯仿法提
取正常人外周血白细胞中基因组Ⅸ蛆12]为模板.
PCR反应体系:模板1止,其余组分的最终
浓度分别为dNTP167肚mol/L,引物(一对)
0.3肛mol/L、TaqDNA聚合酶1.5U'10倍的反应
缓冲液5肛L,镁离子1.5m01/L,加双蒸水至
50肛L.
PCR循环程序:95℃预变性5rIlin,然后
94℃变性45s,61℃退火45s,72℃延伸60s,
共33个循环,终未延伸72℃5l】1in.
PCR扩增产物的分析及基因型结果的判断:
制备2%琼脂糖凝胶(含0.5肚∥n1L溴化乙锭),
取PCR产物10弘L与Marker3弘L分别加样,在
80V电压下电泳30min,电泳结束后在&lD0c
1000紫外检测系统观察电泳结果.根据C、G两
个反应体系扩增产物的有无即可判断基因型.
DNA测序:为鉴定由电泳图形推断扩增产物
及基因型是否正确,选取CC、GG基因型的PCR
产物进行双向测序.
2结果
2.1 PcR扩增产物及检测基因型的结果
PCR扩增的目的片段长度为161bp,CC基
因型的电泳谱为只有G的反应体系有161bP片
段.CG基因型的电泳谱为CG两反应体系均有
161bp片段,GG基因型的电泳谱为只有C反应
体系有161bp片段,见图1,
1.
c代表c反应体系,G代表G反应体系.1、3、4为
CC基因型,2为GG基因型,5、6为CG基因型。7为阳
性对照,8为阴性对照,M为Dl姐分子量标记
圈1 AsPcR产物琼脂糖凝胶电泳图
F培1Thea舯segeldect姊horesispictureofPCRp尊0duction
表1两种方法所得基因型频率
Tab.1IL一6群md嘲pefre【Iu∞cies谢th“∞methods
2.2 DNA测序结果
CC、GG基因型测序见图2
图2 OC和GG基因型测序图谱
F嘻2These(1uencingpictureof0CandGGgenotype
瓢
万方数据
第4期 安新焕,等.等位特异PcR方法检测IL一6基因启动子区一634dG多态性 23
注:图中箭头所指左为IL一6—634位点C右为IL一6—634位点G
通过与&nebank序列相对比,可以看出图
中箭头所指为IL一6—634位点碱基,利用双向测
序,既可证实所扩增产物的正确性,又可证实由
扩增产物有无来判断基因型的正确性.
2.3两种方法所得基因型结果
由表1可见:CG和GG基因型两种方法所得
结果相同,CC基因型只有1例误判为CG基因
型.
3讨论
ASPCR和PC—RFI,P是检测是否存在DNA
已知位点变异的两种常用方法.利用PCR—
RFIJ方法来检测已知的点突变,需先将待测片
段用适当的引物扩增含有突变点的序列,用特定
的限制性内切酶消化PCR产物,通过电泳图谱直
接判断碱基发生突变与否,如果发生突变的位点
不是某种限制性内切酶的识别位点,则不能用此
方法进行基因多态性及遗传病的检测分析.并且
此种方法耗时较长,价格昂贵【1J.实验中涉及的
因素较多,如果某一环节条件把握不准,就会造
成判断结果的失误.√蟠PCR方法也称为37碱基特
异PCR,是为检测点突变而设计的PCR技术,它
分别在一端设计两条引物,一条是野生型,另一
条为突变型引物,另一端设计一条共同引物,突
变型引物的突变碱基设计在引物的3’端.它利用
Taq酶缺乏3’一5’外切酶活性的特点,在以突变
型引物扩增正常DI她模板时,在其3’端就形成
r错配,延伸反应就会因磷酸二酯键形成困难而
不能进行,也就得不到特异长度的条带,从而表
明模板DNA无此突变,如果PCR结果能得到特
异长度扩增条带,表明模板DNA上具有与引物
3’硷基相应的突变.此种技术也称为扩增受阻突
变体系(删S).野生型引物与突变型模板之
间以及突变型引物与野生型模板之间均可发生扩
增受阻.若将野生型与突变型引物分别用于同一
DI姐样品的扩增。即可根据扩增片段的电泳谱定
出样品的基因型.IL一6—634C/G多态性是p
G突变,所以在扩增片段5’端设计一共同引物,
在37端设计两条引物,此两条引物37末端分别为
C、G,对同一份模板同时进行两次扩增。根据
C、G两反应体系(引物3’末端为C的是C反应
体系。引物3’末端是G的为G反应体系)有无出
现161bp的片段,即可判断基因型,此种方法可
由凝胶电泳结果直接做出基因型的判断。省去了
任何形式的DNA探针分子杂交或限制性内切酶
酶切,也不需要标记引物[3I.但这一方法在目前
尚存在引物模板间的某些碱基错配类型不能(或
不能完全)阻止引物延伸.在具体应用时需考虑
到37末端的设计,要避免A:G,G:A。C:C错
配[3|,所使用的DI蛆聚合酶应缺乏3’一5’外切酶
活性.
我们的研究结果表明:用PCR—RFLP方法
确认是CG和GG基因型的41例中,A卵CR方
法也得到r同样的结果,只有1例CC基因型结
果判断可疑,在C反应体系中也出现161bp的片
段,使我们误判为CG基因型.
对IL一6基因启动子区域一634c/G多态性
的检测,我们同时运用A卵CR和PCR—I疆LP方
法,并且得到了一致的结果,这就为后期得出准
确而科学的结论奠定了基础.
AsPCR方法检测基因的已知突变,具有快
速、准确、省时、价格低等优点,在满足引物模
板间碱基错配能阻止引物延伸的条件下,可优先
选用此法.PCR—RFLP方法耗时较长,价格昂
贵,但具有较高的特异性,重复性好.适当的条
件下可选用此法.
[参考文献]
[1] 朱志刚,张秀珍.00LI趾基因Spl结合位点多态
性与原发性骨质疏松症[J].国外医学内分泌学分
册,2004,24(4):236
[2]段勇,王玉明,赵淮,等.从血细胞快速抽提
研蛆的方法探讨[J].昆明医学院学报,1998,
19(2):28
[3] 张维铭.现代分子生物学实验手册[M].北京:
科学出版社,2003.305
(2005—09—18收稿)
万方数据
等位特异PCR方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性
作者: 安新焕, 宋滇平, 王玉明, AN Xin-huan, SOND Dian-ping, WANG Yu-ming
作者单位: 安新焕,宋滇平,AN Xin-huan,SOND Dian-ping(昆明医学院第一附属医院糖尿病科,昆明
,650032), 王玉明,WANG Yu-ming(昆明医学院第一附属医院检验科,昆明,650032)
刊名: 昆明医学院学报
英文刊名: ACADEMIC JOURNAL OF KUNMING MEDICAL COLLEGE
年,卷(期): 2005,26(4)
参考文献(3条)
1.朱志刚;张秀珍 COLIAI基因Spl结合位点多态性与原发性骨质疏松症[期刊论文]-国外医学(内分泌学分册)
2004(04)
2.段勇;王玉明;赵淮 从血细胞快速抽提DNA的方法探讨 1998(02)
3.张维铭 现代分子生物学实验手册 2003
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