叶绿素荧光仪

便携式调制叶绿素荧光仪及其便携式调制叶绿素荧光仪及其 应用应用 上海交通大学分析测试中心上海交通大学分析测试中心 提提 纲纲 •• 植物光合作用机理植物光合作用机理 •• 光合作用过程中能量、电子传递光合作用过程中能量、电子传递 •• 叶绿素叶绿素 •• 叶绿素荧光动力学参数的定义叶绿素荧光动力学参数的定义 •• 叶绿素荧光技术叶绿素荧光技术 •• 叶绿素荧光仪简介叶绿素荧光仪简介 •• 研究运用研究运用 一一..光合作用机理光合作用机理 光合作用的是能量及物质的转化过程。首光合作用的是能量及物质的转化过程。首 先由叶绿素将光能转化成电能，经电子传先由叶绿素将光能转化成电能，经电子传 递产生递产生ATPATP和和NADPHNADPH形式的不稳定化学能，形式的不稳定化学能， 最终转化成稳定的化学能储存在糖类化合最终转化成稳定的化学能储存在糖类化合 物中。物中。 1.1.光反应：吸收光能，合成一些如光反应：吸收光能，合成一些如ATP ATP 、、 NADPHNADPH等等 高能物质，用以维持细胞生长；高能物质，用以维持细胞生长； 2.2.暗反应：利用暗反应：利用ATP ATP 、、NADPHNADPH固定二氧化碳，生成固定二氧化碳，生成 一些列碳水化合物一些列碳水化合物 光系统Ⅰ（PSI）能被波长700nm的光 激发，又称P700 光系统Ⅱ（PSⅡ）吸收高峰波长为680nm，又称P680 NADP NADPH 二二..光合作用过程中能量、电子传递光合作用过程中能量、电子传递 三三. . 叶绿素荧光叶绿素荧光 叶绿素是参与光合作用的主要色素， 吸收红光和蓝光，反射绿光 叶绿素荧光叶绿素荧光 叶绿素分子吸收光量子后，将电子从基叶绿素分子吸收光量子后，将电子从基 态激发到激发态。电子从激发态回到态激发到激发态。电子从激发态回到 基态是一个去激化过程，能量以荧光、基态是一个去激化过程，能量以荧光、 光化学转换（驱动光合成）和热耗散光化学转换（驱动光合成）和热耗散 等三种形式去激化等三种形式去激化 fluorescence + photochemistry + heat = 1fluorescence + photochemistry + heat = 1 叶绿素荧光的研究过程 光合作用是能量及物质的转化过程。首先由叶绿素将光能转化光合作用是能量及物质的转化过程。首先由叶绿素将光能转化 成电能，经电子传递产生成电能，经电子传递产生ATPATP和和NADPHNADPH形式的不稳定化学能，最终形式的不稳定化学能，最终 转化成稳定的化学能储存在糖类化合物中。整个过程包括：转化成稳定的化学能储存在糖类化合物中。整个过程包括： 1.1.光反应光反应————叶绿素吸收光能，经过电子的分离、传递，叶绿素吸收光能，经过电子的分离、传递，合成高能物质如合成高能物质如 ATP ATP 、、 NADPHNADPH等；等； 2.2.暗反应暗反应————利用利用ATP ATP 、、NADPHNADPH固定二氧化碳，生成一系列碳水化合物。固定二氧化碳，生成一系列碳水化合物。 后续反应 叶绿素荧光在光合作用研究中的地位叶绿素荧光在光合作用研究中的地位 ————光合作用的相关过程光合作用的相关过程 反应中心色素 基态捕光色素 激发态 特定波长光能 PSII（700nm）&PSI（680nm） 原初电子分离 热能 产生荧光 P·A→ P*·A → P+·A- 原初电 子受体 接收的光能光反应过程 6 4 0 0 植 物 光 合 仪 研 究 过 程 四四..叶绿素荧光动力学参数的定义叶绿素荧光动力学参数的定义 固定荧光（初始荧光），PSII反应中心完全开放时的荧光产量，与叶绿素浓度有关 最大荧光产量，是PSII反应中心处于完全关闭时的荧光产量 任意时间实际荧光产量 任意时间最大荧光产量 FFVV/F/Fmm: PSII: PSII最大光能转换效率，最大光能转换效率， FFVV’’/F/Fmm’’：：PSIIPSII实际光能转换效率；实际光能转换效率； qqpp = (F= (Fmm’’ --F)/(FF)/(Fmm’’--FF00)) ：：PSIIPSII天线色素吸收天线色素吸收 的光能用于光化学电子传递的份额的光能用于光化学电子传递的份额——光化学光化学 淬灭；淬灭； qqNN = (F= (Fmm--FFmm’’)/(F)/(Fmm--FF00) ) ：： PSIIPSII天线色素天线色素 吸收的光能不能用于光合电子传递而以吸收的光能不能用于光合电子传递而以 热的形式耗散光能热的形式耗散光能——非光化学淬灭非光化学淬灭 五、叶绿素荧光技术五、叶绿素荧光技术 •• 叶绿素荧光信号包含了非常丰富的植物光合作用信息叶绿素荧光信号包含了非常丰富的植物光合作用信息,,因因 此叶绿素荧光技术作为快速、无损伤研究光合作用的方法此叶绿素荧光技术作为快速、无损伤研究光合作用的方法,, 被广泛应用于植物研究的各个方面。被广泛应用于植物研究的各个方面。 •• 深入研究荧光动力学的生物学意义（解释不同给光下深入研究荧光动力学的生物学意义（解释不同给光方案下 的荧光动力学曲线，完善光合作用模型：如的荧光动力学曲线，完善光合作用模型：如OJIPOJIP曲线的曲线的 解释）解释） •• 荧光动力学曲线的应用：荧光动力学曲线的应用：OJIPOJIP指纹鉴定技术（不同植物指纹鉴定技术（不同植物 具有不同的具有不同的OJIPOJIP曲线特征）；不同胁迫（光、温、水、曲线特征）；不同胁迫（光、温、水、 气、土等）或者不同病理（病毒感染、采食、其它损伤）气、土等）或者不同病理（病毒感染、采食、其它损伤） 对植物光合作用的影响；对植物生理状态的监测（表面无对植物光合作用的影响；对植物生理状态的监测（表面无 损实际已失活，如轻微烫伤）；其它应用（破解利用植物损实际已失活，如轻微烫伤）；其它应用（破解利用植物 的军事伪装）的军事伪装） •• 调制叶绿素荧光调制叶绿素荧光 调制叶绿素荧光全称脉冲调制叶绿素荧光全称脉冲--振幅振幅--调制调制 （（PulsePulse--AmplitudeAmplitude--Modulation,PAMModulation,PAM）叶绿）叶绿 素荧光，我们国内一般简称调制叶绿素荧素荧光，我们国内一般简称调制叶绿素荧 光，测量调制叶绿素荧光的仪器叫调制荧光，测量调制叶绿素荧光的仪器叫调制荧 光仪，或叫光仪，或叫PAMPAM。。 六、调制叶绿素荧光仪简介六、调制叶绿素荧光仪简介 叶绿素荧光仪测定原理叶绿素荧光仪测定原理 PAM-Control---Pulse Amplitude Modulation Control 运用光电倍增管和几何光学技术的高灵敏度 荧光测定控制仪 LED---light Emitting Diode 提供测量光和光化学、饱和脉冲光的光源 PM---Photomultiplier 超灵敏度的荧光信号器 调制叶绿素荧光仪的一般结构调制叶绿素荧光仪的一般结构 •• 电源电源 •• 光源：测量光源、光化光源、饱和光源光源：测量光源、光化光源、饱和光源 •• 信号探测器信号探测器 滤波器（荧光波段通过）滤波器（荧光波段通过） •• 其它传感器（温度）其它传感器（温度） 输出 滤 波 器 样品 荧光 信号 叶绿素荧光如何测量？叶绿素荧光如何测量？ •• Part 1: Part 1: 测量光闪（测量光闪（Measuring flashMeasuring flash）） •• 光源光源: LED unit: LED unit •• 能量极低，只能轻微的扰动光合结构的氧化还原能量极低，只能轻微的扰动光合结构的氧化还原 状态而刚好不产生电子的分离与传递。状态而刚好不产生电子的分离与传递。 •• 典型光闪持续时间：典型光闪持续时间： 2 2 -- 5 5 µµss •• 典型光强：典型光强： 1010--11 µµE.mE.m--22.s.s--11 •• 波长：蓝光（波长：蓝光（455nm455nm）或红光（）或红光（625nm625nm）） •• Part 2: Part 2: 饱和光闪（饱和光闪（Saturating flashSaturating flash）） •• 光源光源: LED unit: LED unit，，SingleSingle--turnoverturnover •• 携带很高的能量，能够一次翻转所有活化携带很高的能量，能够一次翻转所有活化 的的PSII PSII 反应中心的光化学状态反应中心的光化学状态 •• 典型持续时间：典型持续时间： 2525µµss •• 典型光强：典型光强： 约约200200，，000 000 µµE.mE.m--22.s.s--11 •• Part 3: Part 3: 光化光（光化光（Actinic lightActinic light）） •• 光源光源: LED unit: LED unit •• 持续激发光反应中心持续激发光反应中心 •• 典型持续时间：典型持续时间： secondsseconds •• 光强：光强： 101022 µµE.mE.m--22.s.s--11 •• Part 4: Part 4: 给光方案（给光方案（Protocol wizard Protocol wizard ）） A.A.典型给光方案典型给光方案————满足一般应用满足一般应用 B.B.给光方案的修改给光方案的修改————自定义方案变量自定义方案变量 高级使用者高级使用者 C.C.创新性编写自己的给光方案创新性编写自己的给光方案————深入探索荧光动深入探索荧光动 力学，可与分子生物学结合（检查光合过程中某力学，可与分子生物学结合（检查光合过程中某 个环节关键基因表达产物的功能）个环节关键基因表达产物的功能） 功能示例功能示例 常用的荧光动力学过程常用的荧光动力学过程 •• MeterMeter————检测并调整测量光闪的强度检测并调整测量光闪的强度 •• OJIPOJIP曲线曲线————KautskyKautsky EffectEffect的快速上升部分的快速上升部分 •• Quenching AnalysisQuenching Analysis———— 暗适应下暗适应下 PSPSⅡⅡ 的最大量子产额的最大量子产额 [Fv/Fm=(Fm[Fv/Fm=(Fm--FoFo)/Fm])/Fm]、、 光适应下光适应下 PSPSⅡⅡ 的最大量子产额的最大量子产额[Fv'/Fm'=(Fm'[Fv'/Fm'=(Fm'--FoFo')/Fm']')/Fm']、、 光适应下的光适应下的 PSPSⅡⅡ 反应中心开放的比例反应中心开放的比例[[qpqp=(Fm'=(Fm'--Fs)/(Fs)/(FoFo''-- Fm')]Fm')]、光适应下、光适应下 PSPSⅡⅡ 的实际光化学效率的实际光化学效率 [[φφPSPSⅡⅡ=(Fm'=(Fm'-- Fs)/Fm'] Fs)/Fm'] 和光适应下的非光化学猝灭和光适应下的非光化学猝灭 (NPQ=Fm/Fm'(NPQ=Fm/Fm'--1) 1) 等。等。 •• QAQA--ReoxidationReoxidation •• SS--statesstates 典型的荧光动力学研究典型的荧光动力学研究 ————OIJPOIJP曲线曲线 •• 给光方案：给光方案： •• 先打开测量先打开测量 光光 ，测暗，测暗 适应叶片的适应叶片的 最小荧光最小荧光 FoFo。。 •• 然后打开饱然后打开饱 和脉冲光和脉冲光 测暗适应叶测暗适应叶 片的最大荧片的最大荧 光光FmFm。。 OJIPOJIP曲线的内在意义曲线的内在意义 •• 植物绿色器官在经充分暗适应后，植物绿色器官在经充分暗适应后，PSPSⅡⅡ 的电子受体：的电子受体：QAQA、、QR QR 及及 PQ PQ 等均完全失去电子而被氧化等均完全失去电子而被氧化 。这时。这时 PSPSⅡⅡ的受体侧接受电子的能的受体侧接受电子的能 力最大，处于初始相力最大，处于初始相““OO”” ((FoFo))。。 •• 当对样品照以强光时，当对样品照以强光时，PSPSⅡⅡ 反应中心被激发后产生的电子经由反应中心被激发后产生的电子经由 PheoPheo 传给传给 QAQA，将其还原，生成，将其还原，生成 QAQA--。此时，由于。此时，由于PheoPheo 不能及时不能及时 从从QAQA--接受电子将它氧化接受电子将它氧化 [P680*[P680*→→PheoPheo-- 需要需要 3 3 psps，，PheoPheo-- →→QA QA 需要需要250250～～300 300 psps，而，而 QAQA--→→PheoPheo--需要需要100100～～200 200 μμss ，， 造成造成 QAQA-- 的大量积累，荧光迅速上升至的大量积累，荧光迅速上升至 J J 点点 。。 PheoPheo能够从能够从 QAQA-- 接受电子，形成接受电子，形成 PheoPheo-- ，导致，导致 QA QA 和和 PheoPheo 完全进入还原状态。此完全进入还原状态。此 时时 PSPSⅡⅡ 反应中心完全关闭，不再接受光量子，荧光产量最高，出反应中心完全关闭，不再接受光量子，荧光产量最高，出 现现 P P 点。点。 •• 在电子从在电子从 QAQA--，向，向 PheoPheo 传递过程中出现的传递过程中出现的 I I 点反映了点反映了 PQ PQ 库的异库的异 质性，即电子传递过程中快还原型质性，即电子传递过程中快还原型 PQ PQ 库先被完全还原库先被完全还原 (J(J--I)I)，随后，随后 才是慢还原型才是慢还原型 PQ PQ 库被还原库被还原 (I(I--P)P)。。 •• 但是，也有学者不认同这种观点，而且目前对于但是，也有学者不认同这种观点，而且目前对于 II--P P 荧光上升的过荧光上升的过 程还存在其它一些解释，所以程还存在其它一些解释，所以 I I 点出现的原因需要进一步研究。点出现的原因需要进一步研究。 •• 分析分析OJIPOJIP曲线可获得的参数曲线可获得的参数 JIPJIP--测定测定 ，，VJVJ（反应中心的关闭程度），（反应中心的关闭程度），MoMo（（QA QA 被还原的最大速被还原的最大速 率）率） ，，SmSm（使（使 QA QA 完全被还原所需要的能量），完全被还原所需要的能量），ΦΦPoPo（暗适应后（暗适应后 的最大光化学效率），的最大光化学效率），ψψoo （在反应中心捕获的激子中用来推动电子（在反应中心捕获的激子中用来推动电子 传递到电子传递链中超过传递到电子传递链中超过 QA QA 的其它电子受体的激子占用来推动的其它电子受体的激子占用来推动 QA QA 还原激子的比率，即照光还原激子的比率，即照光2 ms 2 ms 时有活性的反应中心的开放程度）等时有活性的反应中心的开放程度）等 等。等。 •• OJIPOJIP曲线在实际研究中的应用曲线在实际研究中的应用 分析分析 PSPSⅡⅡ 供体侧的变化，分析供体侧的变化，分析 PSPSⅡⅡ 受体侧的变化受体侧的变化 ，分析，分析 PSPSⅡⅡ 反反 应中心的变化应中心的变化 ，其它如物种识别、遗传育种，其它如物种识别、遗传育种 、病虫害防治及污染检、病虫害防治及污染检 测等。测等。 淬灭过程可获取的参数淬灭过程可获取的参数 •• 直接参数直接参数F0F0，，FmFm，，FmFm‘‘ •• 根据获取的参数可以计算暗适应下根据获取的参数可以计算暗适应下 PSPSⅡⅡ 的最大量子产额的最大量子产额 [Fv/Fm=(Fm[Fv/Fm=(Fm--FoFo)/Fm])/Fm]、光适应下、光适应下 PSPSⅡⅡ 的最大量子产额的最大量子产额 [Fv'/Fm'=(Fm'[Fv'/Fm'=(Fm'--FoFo)/Fm'])/Fm']、光适应下的、光适应下的 PSPSⅡⅡ 反应中心开放反应中心开放 的比例的比例[[qpqp=(Fm'=(Fm'--Fs)/(Fs)/(FoFo--Fm')]Fm')]、光适应下、光适应下 PSPSⅡⅡ 的实际光的实际光 化学效率化学效率 [[φφPSPSⅡⅡ=(Fm'=(Fm'--Fs)/Fm'] (Fs)/Fm'] (GentyGenty 等等1989) 1989) 和光适和光适 应下的非光化学猝灭应下的非光化学猝灭 (NPQ=Fm/Fm'(NPQ=Fm/Fm'--1) (1) (DemmigDemmig--Adams Adams 和和 Adams 1996) Adams 1996) 等等 荧光测量系统软件荧光测量系统软件 •• Flourwin3.6Flourwin3.6 七七..研究运用研究运用 1.光系统II反应中心光化学效率的表征 光化学效率（ FV’/Fm’）的变化，反映PSII 反应中心活性的变化，植物正常情况下的 FV’/Fm’一般维持在0.80左右。 FFVV’’/F/Fmm’’降低，说明降低，说明PSIIPSII反应中心受到损伤（光抑制）反应中心受到损伤（光抑制） 原因原因:: I I PSIIPSII天线色素尺寸增大，导致光合效率降低；天线色素尺寸增大，导致光合效率降低； II II PSIIPSII反应中心反应中心D1D1蛋白更新速率降低；蛋白更新速率降低； III III 通过叶黄素循环形成玉米黄质的速率降低；通过叶黄素循环形成玉米黄质的速率降低； IV IV PSIIPSII水分解中心钝化失活水分解中心钝化失活 氧释放降低 2. 2. FFmm’’的变化表征的变化表征State1State1、、State2State2间的转换间的转换 FFmm’’大幅下降，表明光合电子传递由大幅下降，表明光合电子传递由State1State1 转换到转换到State2State2 在在State1State1非循环光合磷酸化表现较高活性非循环光合磷酸化表现较高活性 在在State2State2循环光合磷酸化表现较高活性循环光合磷酸化表现较高活性 集光复合体的磷酸化、去磷酸集光复合体的磷酸化、去磷酸 化作用来调节化作用来调节State1State1和和State2State2的的 转换转换 3.PSII3.PSII光合电子传递效率的表征光合电子传递效率的表征 光化学淬灭（光化学淬灭（qqpp）：反映）：反映PSIIPSII天线色素分子天线色素分子 吸收光能后，用于光化学电子传递的份额，吸收光能后，用于光化学电子传递的份额， 因此也反映了天线色素分子吸收的光能用于因此也反映了天线色素分子吸收的光能用于 光合电子传递的变化；同时，光合电子传递的变化；同时，qqpp 也反映也反映PSIIPSII 初级电子受体初级电子受体(Q(QAA))氧化还原状态的变化。氧化还原状态的变化。 要保持高的光化学淬灭，就要使要保持高的光化学淬灭，就要使PSIIPSII反应中反应中 心处于开放状态心处于开放状态 44..类囊体膜能量状态和光合作用过程中热耗类囊体膜能量状态和光合作用过程中热耗 散的表征散的表征 非光化学猝灭（非光化学猝灭（ qqNN）：）：反映了由于内囊体反映了由于内囊体 膜内基质酸化而引起的内囊体膜能化的能量膜内基质酸化而引起的内囊体膜能化的能量 耗散耗散 能量耗散主要发生在天线色素上能量耗散主要发生在天线色素上 跨类囊体膜质子梯度的形成是引起跨类囊体膜质子梯度的形成是引起qqNN变化变化 的必要条件的必要条件 总总 结结 运用叶绿素荧光技术来表征光运用叶绿素荧光技术来表征光 能的利用、传递、耗散，从而能的利用、传递、耗散，从而 能够很好地研究植物的光合作能够很好地研究植物的光合作 用过程用过程 便携式调制叶绿素荧光仪及其应用 提 纲 一.光合作用机理 三. 叶绿素荧光 叶绿素荧光 叶绿素荧光在光合作用研究中的地位�——光合作用的相关过程 四.叶绿素荧光动力学参数的定义 五、叶绿素荧光技术 六、调制叶绿素荧光仪简介� 调制叶绿素荧光仪的一般结构 叶绿素荧光如何测量？ 功能示例 常用的荧光动力学过程 典型的荧光动力学研究�——OIJP曲线 OJIP曲线的内在意义 淬灭过程可获取的参数 荧光测量系统软件 七.研究运用 2. Fm’的变化表征State1、State2间的转换 在State2循环光合磷酸化表现较高活性 总 结