苦瓜植株不同组织中降糖血糖多肽活性成分的RT_PCR分析

312 食品与药品 Food and Drug 2011年第 13卷第09期 heparins on tissue factor-mediated activation of platelets: flow cytometric analysis[J]. Clin Appl Thromb Hemost, 2006, 12(3): 311-317. [13] Presta M, Oreste P, Zoppetti G, et al. Antiangiogenic activity of semisynthetic biotechnological heparins: low-molecular- weight-sulfated Escherichia coli K5 polysaccharide derivatives as fibroblast growth factor antagonists[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2005, 25(1):71-76. [14] Vicenzi E, Gatti A, Ghezzi S, et al. Broad spectrum inhibition of HIV-1 infection by sulfated K5 Escherichia coli polysaccharide derivatives[J]. AIDS, 2003, 17(2):177-181. [15] Sava I G, Zhang F, Toma I, et al. Novel interactions of glycosaminoglycans and bacterial glycolipids mediate binding of Enterococci to human cells[J]. J Biol Chem, 2009, 284(27):18194- 18201. [16] Gusils C, Moreta V, Gonzalez S. Determination of bacterial adhesion to intestinal mucus[J]. Methods Mol Biol, 2004, 268:411- 415. 苦瓜植株不同组织中降糖血糖多肽活性成分的RT-PCR分析 宋还雷1，谢先文2，顾红艳2，任大云1，王富军3，赵 健1* （1. 华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；2. 浙江日升昌药业有限公司，浙江 东阳 322100；3. 上海中医药大学，上海 201203） 摘 要：目的 研究苦瓜降糖活性多肽P在苦瓜不同组织器官中的分布。 方法 用改良Trizol一步法提取苦瓜不同组织的总 RNA，采用RT-PCR方法扩增降糖多肽P基因，分析其表达。结果 成熟果实的种子和果肉中均可明显检测到降糖多肽P基因 的表达，其他组织中则未能检测出。结论 苦瓜降糖多肽P活性成分主要在苦瓜果肉和种子中表达，这2种组织是苦瓜降血 糖作用的主要药用部位。 关键词：苦瓜；RNA提取；RT-PCR；降糖多肽P表达 中图分类号：S642.5 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2011）09-0312-04 收稿日期：2011-05-03 基金项目：国家科技支撑子课题（No.2006BAI06A16-01） 作者简介：宋还雷（1985-），男，山东临沂人，研究方向为分子生物学及生化药物 *通讯作者：赵健，女，教授，硕士生导师，Tel：021-64252257，E-mail：zhaojian@ecust.edu.cn。 RT-PCR Analysis of Hypoglycemic Polypeptide Components from Different Tissues of Momordica charantia SONG Huan-lei1, XIE Xian-wen2, GU Hong-yan2, REN Da-yun1, WANG Fu-jun3, ZHAO Jian1* (1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; 2. Zhejiang REACHALL Pharmaceutical Co., Ltd., Dongyang 322100, China; 3. Shanghai University of Chinese Traditional Medicine, Shanghai 201203, China) Abstract: Objective To investigate the distribution of hypoglycemic polypeptide P in different tissues of Momordica charantia (MC). Methods The improved one-step Trizol extraction method was used for the isolation of total RNA from different tissues of MC. A RT-PCR method was used for analyzing the expression patterns of the hypoglycemic polypeptide P gene in MC. Results The RT-PCR analysis results showed that the expression of hypoglycemic polypeptide P gene could only be detected in seeds and fruit pulp of mature MC. Conclusion The hypoglycemic polypeptide P mainly expresses in seeds and fruit pulp of MC. These two tissues are the main medicinal parts for hypoglycemic therapy of MC. Key Words: Momordica charantia; RNA extraction; RT-PCR; expression of hypoglycemic polypeptide P 苦瓜系葫芦科苦瓜属植物，性苦寒，具有多种药 理作用，自古以来为民间（印度等部分亚洲国家）广 泛食用的具有药理价值的植物。苦瓜的不同部位（果 肉、苦瓜籽、叶子及全果），不同提取物（水提取 食品与药品 Food and Drug 2011年第 13卷第09期 313 物、醇提取物、醚提取物以及四氯化碳提取物等）都 具有不同程度的抗糖尿病作用。据报道，现已从苦瓜 中分离出多种降血糖物质，包括多肽、甾苷、皂苷、 脑苷、生物碱、萜类等[1]。其中苦瓜多肽是苦瓜中含 量最多、降糖效果最为显著的成分，目前已知的苦瓜 多肽有多肽P，多肽K，PA等[2-4]。 自上世纪80年代Khanna等从苦瓜籽提取物中分离 出相对分子质量约为11×103的多肽P蛋白以来，随后 的发现证实苦瓜籽中有多种类胰岛素化合物存在[5]。 为进一步分析明确苦瓜降血糖多肽P在不同组织中分 布，以便有效地利用苦瓜中药用有效成分，我们研究 了苦瓜植株不同部位中降血糖多肽P的分布，通过分 离提取苦瓜植株不同组织器官中的总RNA[5-8]，采用 RT-PCR方法分析了不同组织器官中多肽P的表达，从 mRNA水平检测苦瓜植株不同组织器官中降血糖多肽 P的分布。 1 与方法 1.1 实验材料 苦瓜成熟植株采于当地蔬菜种植基地，挑选无 病，生长健康的新鲜植株为实验材料。 pMD18-T克隆试剂盒（Takara公司）；Taq 酶，T4 DNA 连接酶（Fermentas公司）；Trizol试剂 （Invitrogen公司）；其它生物学试剂（上海生工生 物工程公司）；DNA纯化回收试剂盒（Generay公 司）。移液器吸管头，离心管等塑料器皿在0.1 % DEPC水中浸泡24 h以上，121 ℃高压灭菌30 min；研 钵及玻璃器皿等用锡箔纸包好180 ℃烘烤8 h以上；所 有试剂均用0.1%DEPC处理过的水配置。 1.2 实验方法 1.2.1 Trizol一步法 相关试剂为MD公司产品，实验 操作步骤如下：（1）取0.2 g新鲜苦瓜组织样品（种 子预先于液氮中冷冻3~5 d）放入研钵，多次少量加 入液氮，保持低温迅速将组织研磨成均匀的粉末； （2）将样品粉末移入预冷的1.5 mL离心管，迅速加 入1 mL Trizol 试剂，剧烈混匀15 s，室温放置5~10 min， 再向管中加入200 μL的氯仿，放置10 min；（3）4 ℃， 12 000 r/min离心10 min，将上层水相移至另一干净离 心管中，向管中加入200 μL的氯仿，混匀；（4）4 ℃， 12 000 r/min离心10 min，上清转入新的1.5 mL离心 管，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10 min； （5）4 ℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清。用1 mL 75 %乙醇（0.1 % DEPC处理）洗1遍，7 500 r/min离 心5 min，小心倾去上清，必要时重复1遍。（6）用 移液器小心吸去多余液体，晾干RNA；（7）溶于适 量体积（约30~50 μL） RNase-free 水中，－80 ℃低 温保存。 1.2.2 RNA纯度及完整性检测 总RNA的电泳检测采 用1.0 %琼脂糖凝胶电泳，电泳槽洗净后用3 %双氧水 溶液（现配）浸泡30 min以上，并用0.1 %处理过的 DEPC水冲洗以确保无RNase污染，电泳结果用凝胶 扫描系统观察，记录。 取2 μL总RNA用DEPC水稀释1 000倍后，用紫外 分光光度计测定A260和A280的值。 1.2.3 RT-PCR及PCR扩增序列鉴定 按照试剂盒提供 的（Fermentas，#K1621）进行逆转录。根据 已知序列蛋白基因的正向引物和反向引物。PCR 反应程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃ 复性30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min，PCR产物经1.0 %琼脂糖凝胶检测，回收试剂盒 回收目的片段，连接克隆载体pMD18T，取5 μL连接 产物热激法转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布于含有 Amp的LB固体平板上，37 ℃培养过夜，挑选菌落1 个，置于含Amp的LB液体培养基，37 ℃ 180 r/min振 荡培养12~16 h，碱抽法提取质粒，酶切质粒，1.0 % 琼脂糖凝胶检测。检测正确的阳性重组克隆，由生工 测序公司测定序列，分析结果。 2 结果与分析 2.1 分光光度法检测不同组织总RNA的纯度 采用紫外分光光度法分析测定表明苦瓜植株不同 组织提取的总RNA纯度较好，A260/A280接近2.0，基本 满足实验要求。 表1 提取的苦瓜不同组织的总RNA纯度检测 A260 A280 A260/ A280 根 0.617 0.344 1.794 茎 0.576 0.312 1.846 叶 0.597 0.313 1.904 花朵 0.621 0.326 1.905 果肉 0.589 0.314 1.879 种子 0.643 0.335 1.919 2.2 提取的总RNA的电泳检测 取根、茎、叶、花朵、果肉、种子的总RNA各 5 μL， 314 食品与药品 Food and Drug 2011年第 13卷第09期 用1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测。 Marker 1 2 3 4 5 6 4500 3000 2000 1200 800 500 200 根 茎 叶 花朵 果肉 种子 图1 提取苦瓜的不同组织器官的总RNA的电泳检测 较好的RNA电泳检测结果应呈现明显的3条带， 28s，18s和5s。且28s和18s条带清晰明亮。实验结果 显示，苦瓜不同组织器官抽提的RNA质量符合电泳 鉴定。 2.3 RNA完整性鉴定 进一步鉴定抽提的总RNA的完整性：进行逆转 录，得到cDNA电泳，结果见图2。结果表明，cDNA 相对分子质量遍布于0.1~5.0 kb 之间，最密集的部分 集中在0.2~2 kb之间，符合植物基因cDNA 的长度范 围，结合紫外分光光度法分析和电泳检测结果表明， 苦瓜不同组织来源的RNA抽提质量较好，可以满足 基因克隆的要求。 cDNA ：1. 根；2. 茎；3. 叶；4. 种子；5. 花朵；6. 果肉 图2 反转录获得的cDNA 2.4 不同组织降血糖多肽P活性成分分析 将苦瓜不同组织抽提的总RNA进行逆转录，以 cDNA为模板，从不同组织中扩增具有降糖功能的多 肽P基因。结果表明，在苦瓜根、茎、叶、花朵中几 乎看不到苦瓜多肽P基因扩增产物存在；而在果肉、 种子中明显看到扩增产物，且种子中降血糖多肽P基 因的表达量最高（图3）。 回收扩增条带，连接T载体进行测序分析。结果 表明，该目的条带确实为苦瓜中的多肽P基因。 3 讨论 Maker；1-6：叶；茎；果肉；花；种子；根的PCR products 图3 苦瓜多肽P基因的RT-PCR产物电泳检测 自1981年Khanna等在从苦瓜籽提取物中分离出 相对分子质量约11×103的多肽P，并发现皮下注射多 肽P可降低啮齿类动物、叶猴和人类血糖以来，对苦 瓜降糖活性成分的研究就一直没有间断，相关研究文 献很多。已知苦瓜降血糖活性成分主要为蛋白质和 皂苷类成分。目前苦瓜多肽P的研究仍停留在从苦瓜 中分离和制备提取物的降血糖作用[9]。为了研究苦瓜 降糖多肽P有效成份的确切分布，本研究从基因的表 达水平着手，抽提新鲜苦瓜各组织的RNA，通过RT- PCR得到cDNA，利用本实验室已经克隆得到苦瓜多 肽P基因序列，设计了专一性引物，通过RT-PCR方法 检测苦瓜不同组织中多肽P基因的表达。研究结果表 明，只有在苦瓜的种子和果肉中才可明显检测出降糖 多肽P基因的表达，在其他组织则未能明显检测出， 说明苦瓜中蛋白多肽类降血糖活性成分可能主要存在 于果肉和种子中。 我国苦瓜种植和药用有着悠久历史。本研究证实 了苦瓜中降血糖多肽的表达主要是在果肉和种子，这 对指导糖尿病患者的苦瓜药疗食用，以及对苦瓜中活 性成分的药用开发研究都具有重要的意义。 参考文献 [1] Kharma P, Jain S C, Panagariya A, et al. 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Methods The human osteosarcoma cell line MG-63 cells were cultured in vitro. The bisphosphonates (10 μmol/L and 50 μmol/L) were taken for the cultured MG-63 cells with negative control. After incubation for 72h, the mRNA and protein expressions of OPG and RANKL were examined by RT-PCR and Western blot, respectively. Results After the treatment with bisphosphonates for the cultured MG-63 cells, the expression of RANKL was down-regulated at both mRNA and protein levels(P<0.05), while the mRNA and protein expressions of OPG were both up-regulated (P<0.05). Conclusion Bisphosphonates can inhibit osteolysis of human osteosarcoma cell line MG-63 cells via regulating the expression of OPG/RANKL axis, and has a potential benefit for the treatment of human osteosarcoma. Key Words: bisphosphonates; human osteosarcoma cell line MG-63 cells; osteoprotegerin (OPG); receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL) [4] Ahmed I, Adeghate E, Cummings E, et al. 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