骨质疏松模型大鼠骨磷、骨钙含量测定

490 主垦量星堕鳖盘查垫!!至!旦筮!!鲞筮!塑璺墅!』Q!!!!P!竺!：!!!!垫!Q：!!!!!：堕!：! 里!!!i!!!!!!!!!!竺!竺：!!!垒!g!苎!：!!型：!!!尘；!!：!!!14：i!!!：!塑!立!!!：!!!Q：!!：塑! 骨质疏松模型大鼠骨磷、骨钙含量测定 孙炜赵效国 李小玲 中图分类号：R332文献标识码：A 文章编号：1006-710812010)07-0490-03 摘要：目的 建立骨质疏松模型大鼠骨磷含量测定的钼酸铵紫外分光光度法和骨钙含量测定原子吸 收法。方法通过维甲酸诱导大鼠骨质疏松模型。实验结束后处死大鼠，取左侧股骨，高温灰化后， 用硝酸对样品消解，再以钼蓝比色法进行骨磷含量测定，原子吸收法测定骨钙含量。结果样品消解 完全，样品骨磷含量为139．1—173．9mS／g，回收率在97．8％一100．2％(RSD=1．13％)，样品骨钙含 量为87．0—228．7mg／g。结论该方法操作简单、快速、准确，可用于对骨质疏松模型大鼠骨磷、骨钙 含量的测定。 关键词：骨质疏松；骨磷；骨钙 DeterminationofthecontentofbonephosphorusandcalciuminosteoporoticratmodelSUNWei， ZHAOXiaoguo，LIXiaoling．CollegeofPublicHealth，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054，China Correspondingauthor：ZHAOXiaoguo，Email：xjzxg@sohu．com Abstract：ObjectiveToestablishmolybdenumbluecolorimetricmethodtodeterminethecontentofbone phosphorusandatomicfluorescencespectrometrytOdeterminethecontentofbonecalciuminosteoporoticrat model．MethodsRetinoicacidoninductionofosteoporoticmodelinrats，whentheexperimentW88 concluded，theratswereputtodeath，removetheleftfemurs，afterhightemperatureashedthesamples， thenusingnitricaciddigestedofsamples．thecontentofbonephosphoruswasdeterminedbymolybdenum bluecolorimetriemethod，thecontentofbonecalciumwagdeterminedbyatomicfluorescencespectrometry． ResultsThesamplesweredigestedcomplete。thecontentofbonephosphorusis139．1—173．9ms／g，and thesamplerecoveryis97．8％一100．2％(RSD=1．13％)．Thecontentofbonecalciumis87．0—228．7 mg／g．ConclusionsThemethodwagsimple，rapidandaccurate．Thereforeit canbeusedfor determinationofthecontentofbonephosphorusandcalciuminosteoporoticratmodel． Keywords：Osteoporosis；Bonephosphorus；Bonecalcium 骨质疏松是以骨量减少和骨组织显微结构受 损，继而引起骨脆性和骨折危险性增加为特征的系 统性骨骼疾病¨⋯。目前是世界公共卫生关注的重 要课题，因此建立骨质疏松动物模型来研究该病的 发病机理，寻找有效的防治方法尤为重要。骨中的 无机盐称之为骨盐，其种主要成分为了磷酸钙盐，主 要是钙和磷共同形成骨的磷灰石结晶，占骨盐成分 的84％，所以钙、磷是骨矿物质的主要成分¨⋯。骨 量是骨质疏松危险程度的重要决定因素”1，故骨 钙、磷含量的测定是综合骨质疏松模型复制成 功的重要指标之一。本次试验通过维甲酸诱导大鼠 作者单位：830054乌鲁木齐，新疆医科大学公共卫生学院(孙 炜、赵效国)；新疆医科大学第二附属医院(李小玲) 通讯作者：赵效国，Email：xjzxs@sohu．corn ·论著· 骨质疏松，采用钼蓝比色法进行骨磷含量测定，原子 吸收法测定骨钙含量，为大鼠骨质疏松模型的指标 检测提供操作简单、快速、准确的测定方法。 l材料 1．1实验动物 8一10周龄SD雌性大鼠16只，体重225g～ 295g(由新疆医科大学实验动物中心提供)，适应性 喂养1周后，随机分为正常组和模型组，每组各8 只。 1．2仪器与试剂 骨密度测量仪(法国DMS公司，Lexxos)；紫外 分光光度计(日本岛津公司，uV一2550)；原子吸收光 谱仪(美国Varian公司，240FS)；分析天平 (Sartofius，BSll0S，d=0．1mg)；快速混匀器(金坛 万方数据 ±垦置重堕鳖壁查!!!!至!旦筮!!鲞筮!塑垦!地』鱼!!!!巴竺!：』!!!垫!!：!!!!!：塑!：! 市医药仪器厂，SK．1)；电热恒温水浴锅(上海精宏 实验设备有限公司，DK-$22)。 维甲酸(陕西森弗生物技术有限公司，纯度 99．12％，批号081210)；钙标准品(国家标准物质中 心，批号GSBG62024-90)；磷酸二氢钾(天津市福晨 化学试剂厂，优级纯)；抗坏血酸(天津市天新化学 厂，分析纯)；钼酸铵(金堆成钼业科技有限责任公 司，分析纯)；酒石酸锑钾(天津市化学试剂三厂，分 析纯)。 2方法与结果 2．1骨质疏松模型复制 模型组用维甲酸80mg／(kg·d)灌胃，正常组 用同等体积蒸馏水灌胃，连续灌胃3周后停药，实验 第4周将所有大鼠用10％水合氯醛0．3ml／100g 麻醉后四肢展平置于骨密度仪上通过计算机软件系 统测量每只大鼠左侧股骨骨密度(bonemineral density，BMD)。 2．2样品预处理 分离大鼠左侧股骨，剥净软组织，放入干燥箱 中，温度(1IO。C)烘干2h后用分析天平称干重(精 确至0．1mg)。在电炉上炭化后置马福炉中800。C， 灰化2h，冷却至室温，放置于干燥器中后用分析天 平称灰重。 2．3钼蓝比色法测定骨磷含量 2．3．1溶液的配制：抗坏血酸溶液：称取10g抗坏 血酸溶于水中，并用水稀释至100ml过滤后储存于 棕色容量瓶内。 钼酸盐溶液：分别将13g钼酸铵和0．35g酒石 酸锑钾各溶于100ml水中，在不断搅拌下，将钼酸 铵溶液缓缓加入到300ml硫酸(1+1)溶液中，再将 酒石酸锑钾溶液加入混匀。 磷对照品储备液：精密称取0．1g磷酸二氢钾， 加入80ml水再加入2．5ml硫酸(1+1)溶液，最后 用水定容至100ml，作为磷对照品储备液。 2．3．2样品测定：称取0．05g骨灰加入3％硝酸溶 液lOml移至25ml的比色管中，室温下放置48h， 样品消解呈无色透明溶液。吸取样品消解液1ml 加水稀释至10ml，精密吸取该溶液300斗l，加水稀 释至25ml，加入1ml抗坏血酸溶液，混匀，再加入2 ml钼酸盐溶液，充分混匀。在90。C水浴中加热20 rain，取出后流水冷却。在708am波长处，以水为空 白对照，测定吸光度旧1。 2．3．3最大吸收波长的测定：精确吸取磷对照品储 491 备液125¨l，加入水稀释至25ml，加入1ml抗坏血 酸溶液，混匀，再加入2ml钼酸盐溶液，充分混匀。 在90℃水浴中加热20min，取出后流水冷却。用 mm比色皿，以水为空白对照，从200nm至900am 处测定吸光度，结果证实在708am处吸光度最大， 故本试验选择708nm为最大吸收波长。 2．3．4标准曲线的绘制：分别精密量取磷对照品储 备液25斗l、50斗l、100Izl、150p．1、175斗l、200pl，加 入水稀释至25ml，得磷浓度为0．228mg／L、0．456 mg／L、0．912mg／L、1．368mg／L、1．596ms／L、1．824 mg／L的系列标准溶液，在系列标准溶液中，分别加 入1ml抗坏血酸溶液，混匀，再加入2ml钼酸盐溶 液，充分混匀，在90℃水浴中加热20min，取出后流 水冷却在708am处测定吸光度，绘制标准曲线。以 磷的浓度(x)对吸光度(Y)进行直线回归，得到回 归方程：Y=0．44068X+0．03563，r=0．9998。 2．3．5精密度试验：精密吸取同一个样品消解液1 ml加水定容至10ml。精密吸取该溶液300“l，加 人蒸馏水定容至25ml，按标准曲线项下操作步骤测 定吸光度。该实验平行测定5份，计算相对标准偏 差。 表1精密度试验结果 2．3．6加标回收率试验：吸取已知浓度的样品消解 液1ml，加水稀释至10ml，作为样品供试液。分别 量取磷对照品储备液3ml、4ml、5ml加水定容至10 ml，作为低、中、高三个浓度的磷对照品溶液。分别 吸取磷对照品溶液150斗l，加入样品供试液150肛l， 加水定容至25ml，作为三个浓度的样品溶液。按标 准曲线项下的操作测定吸光度，每个样品溶液做三 份，每份样品测定三次。 表2回收率试验结果 2．3．7重复性实验：取同一个样品的骨灰，分别称 取0．05g骨灰配置成6个相同的样品溶液，测定吸 光度，从回归方程中求出磷的含量。 万方数据 492 袭3重复性试验结果 2．3．8显色时间与稳定性：磷钼蓝溶液在室温下显 色时间延长，在90。C水浴中加热20min后流水冷 却‘”，取出后开始计时测定放置不同时间的吸光 度，水浴加热后，在120min内吸光度变化不大。 表4稳定性试验结果 2．4原子吸收法测定骨钙含量 2．4．1原子吸收工作条件：波长422．7nm，狭缝 0．5nm，空气流量13．50L／min，乙炔流量2．00L／ mino 2．4．2标准曲线的绘制：取浓度为1000mg／L钙标 准储备液配制10．0、15．0、30．0mg／L的钙标准溶 液，按原子吸收工作条件分别测定其吸光度。 表5钙的标准曲线 进行曲线拟合，样品浓度(mg／L)与吸光度(A) 的线性关系方程式为： 4浓度2=百瓦面下了i蒜瓜百j而 2．4．3样品测定：分别称取0．1g骨灰加入5％硝 酸溶液10ml移至25ml的比色管中，室温下放置 48h消解，溶液呈无色透明。取消解液，测定吸光 度，同时作试剂空白，由标准曲线求出样品中钙含 量。 2．5数据分析 采用SSPS13．0软件对数据进行统计分析，计 量资料用元4-s表示，满足正态性资料用采用单因素 方差分析组间比较，检验水准：a=0．05。 2．6大鼠左侧股骨BMD、骨钙、磷含量的变化 模型组大鼠左侧股骨BMD与正常组比较明显 减少，差异有统计学意义(P<0．05)，低于2．5个标 准差，提示大鼠有骨质疏松症，模型复制成功；骨钙、 磷含量明显低于正常组，差异有统计学意义(P< 0．05)，表明模型组大鼠骨磷含量明显减少。 表6大鼠左侧股骨BMD、骨磷、骨钙含量测定结果(霉4-5) 3讨论 骨密度(BMD)指骨胳单位面积中矿物质含量， 是诊断骨质疏松的最重要指标。本次实验表明，模 型组大鼠与正常组大鼠比较，BMD明显减少，而骨 磷、钙含量的测定与BMD的检测结果一致，反映出 骨矿含量的具体变化。通过本次试验结果进一步证 实，采用钼酸铵紫外分光光度法和原子吸收法测定 骨质疏松模型大鼠骨磷、钙含量，精密度和准确度都 很高，操作简便。 【 参 考 文 献 】 [1]刘忠厚．中国人原发性骨质疏松诊断标准(试行)[J]．中国骨 质疏松杂志，1999，5(1)：1． [2]WHOStduyGrop．Assessmentoffractureriskanditsapplication toscreeningforpostmenopausalosteoporosis．WorldHealthOrg TechRepSer，1994。843：5-6． [3]吴波．骨质疏松动物模型研究的现状与展望[J]．药学学报， 1996，31(4)：316-320． [4]张月峰．骨质疏松动物模型研究进展[J]．动物医学进展， 2005。26(3)：8-11． [5]KanisIA，MeltomU，3rd，ChristiansenC，eta1．Thediagnosisof Osteoporosis[J]．BoneMINERRes，1994，9(8)：1137—1141． [6]潘平，康清蓉，李晓．分光光度法测定土壤中总磷[J】．光谱实 验室，2003，20(5)：697-699． [7]李山，刘丹．磷钼蓝分光光度法测定水中磷的改进[J】．化工环 保，2006，26(1)：78-80． (收稿日期：2010-04-01) 万方数据 骨质疏松模型大鼠骨磷、骨钙含量测定 作者： 孙炜， 赵效国， 李小玲， SUN Wei， ZHAO Xiaoguo， LI Xiaoling 作者单位： 孙炜,赵效国,SUN Wei,ZHAO Xiaoguo(新疆医科大学公共卫生学院,乌鲁木齐,830054)， 李 小玲,LI Xiaoling(新疆医科大学第二附属医院) 刊名： 中国骨质疏松杂志 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF OSTEOPOROSIS 年，卷(期)： 2010,16(7) 参考文献(7条) 1.刘忠厚 中国人原发性骨质疏松诊断标准(试行)[期刊论文]-中国骨质疏松杂志 1999(01) 2.WHO Stduy Grop Assessment of fracture risk and its application to screening for postmenopausal osteoporosis 1994 3.吴波 骨质疏松动物模型研究的现状与展望 1996(04) 4.张月峰 骨质疏松动物模型研究进展[期刊论文]-动物医学进展 2005(03) 5.Kanis JA;Meltom LJ 3rd;Christiansen C The diagnosis of Osteoporosis 1994(08) 6.潘平;康清蓉;李晓 分光光度法测定土壤中总磷[期刊论文]-光谱实验室 2003(05) 7.李山;刘丹 磷钼蓝分光光度法测定水中磷的改进[期刊论文]-化工环保 2006(01) 本文读者也读过(1条) 1. 陈治卿.CHEN Zhiqing 骨质疏松与质子泵抑制剂相关性探讨[期刊论文]-中国骨质疏松杂志2010,16(7) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zggzsszz201007007.aspx