血液细胞冷冻干燥保存的研究进展

血液细胞冷冻干燥保存的研究进展 周新丽 综述 陈光明 张绍志 审校 国外医学输血及血液学分册 2005年第 28卷第 5期 【摘要】 血液细胞的冷冻干燥保存与传统的常温保存和低温保存相比，具有储存期限长、储存运输方 便、输注安全等优点。本文从血液细胞冷冻干燥保存的细胞学基础，血小板、红细胞、脐带血冷冻干燥保存 的现状 ，发展血 液细胞 冷冻干燥保存技术需要解决的关键问题等几个方面进行综述 。 【关键词】 血液细胞 ； 冷冻干燥 ； 海藻糖 随着我国I 床用血的快速增长和无偿献血的 实施，血液的供需矛盾 日趋突出，迫切地需要延长血液 细胞 的保存期限。深低温保存法以甘油或二甲基亚砜 做低温保护剂 ，将血液细胞在一8O C或 一196 C冰冻保 存 ，该方法可以延长保存期限，但是在储存和运输过程 中需要特殊 的低温设备，并且在细胞复温后需要大量 的冲洗程序 以除去低温保护剂 。冷冻干燥法是将含水 物质在低温下冻结 ，然后在真空条件下通过对冻结物 质加热 ，使其中的水分直接升华 、解吸而获得干燥物质 的一种技术。它为血液细胞 的长期保存提供了一种选 择 ，经冷冻干燥 的血液细胞能够在环境温度下长 时间稳定储存 ，并且容易重新复水而恢复活性 ，大大减 少 了储存和运输的不便。近年来 ，冷冻干燥技术已经广 泛应用于各种生物材料的长期保存 ，但是 由于血液细 胞具有复杂的结构和功能 ，其冷冻干燥保存一直是一 个难题 ，本文对这一领域的现状进行 回顾 。 1 血液细胞冷冻干燥保存的细胞学基础 1．1 细胞冻干损伤的机理 冷冻和干燥过程剧烈的环境变化通常会产生多种 应力 ，对细胞膜和胞内物质造成大规模损伤 ，最终导致 细胞死亡或失去生物功能 。冷冻过程对细胞的损伤主 要是 由溶质效应和机械效应引起 。当细胞溶液的温度 降到其平衡冻结点以下并达到一定的过冷度后 ，细胞 外溶液首先结晶，水的冻结使细胞问隙内的液体逐渐 浓缩 ，电解质浓度显著增加。如果冷却速度较慢 ，细胞 会因为长时间暴露于高浓度的溶液中而产生蛋白质变 性和脱水性死亡 ，这就是所谓的溶质效应 。机械效应是 由于细胞 内外 的冰晶生长而对细胞膜、细胞器官产生 的机械剪切破坏。冷却速率越快，机械损伤就越大 。干 燥过程造成细胞损伤的两大根源是膜的融合与脂质的 相转变。在正常的生理环境下 ，细胞膜中磷脂的极性基 室 作者单位：310027杭州，浙江大学制冷与低温研究所低温生物实验 · 综 述 · 团通过与水分子的结合而在空间上相互隔开 ，但是当 水分子被除去后 ，极性基团的聚合密度增大 ，产生分子 间的强相互作用 ，它们用极性基 团问的氢键结合来弥 补损失的与水分子的氢键结合，导致细胞问及细胞器 官问的相互融合。这种强相互作用导致的另一个后果 是使烃链 由凝胶相融化形成液 晶相的温度 ，即相转变 温度 (Tm)增加。例如 ，卵磷脂在完全水合时的相转变 温度约为一7 C，而在完全脱水时就升高至约 70 C。这 样 ，干脂膜在室温下处于凝胶相 ，很容易发生不可逆的 相分离_】]。此外 ，在复水过程中，处于凝胶相的脂膜会 经历向液晶相 的相转变 ，造成膜的通透性暂时性地增 加，使细胞内外物质自由地双向交换，导致细胞代谢紊 乱。 1．2 冻干保护剂及其保护机理 生物学家们对 自然界 中存在的、能够在低温和脱 水状态下存活的有机体进行 了大量 的研究 ，发现它们 在生物化学方面的共同特点是其细胞内聚集 了大量 的 双糖 ，其 中最常见的是海藻糖和蔗糖_2]。基于冷冻和干 燥过程都涉及到细胞脱水 的现象 ，他们提 出了“水替 代”假说来解释双糖 的保护机理。该假说认为当生物大 分子失去结合水膜后 ，双糖分子中的羟基能在其失水 部位 以氢键形式与之连接 ，及时形成一层新 的保护膜 以代替原先失去的结合水膜 ，使生物分子在物理状态 上保持与结合水存在时相似 ，从而保持了生物分 子的 高级结构和功能。这种观点二十多年来得到了大量 的 实验验证 ，已经作为生物材料干态保存 的主要机理被 广泛接受。此外，他们还认为双糖的存在有利于降低脂 质的相转变温度。例如 ，卵磷脂在蔗糖或海藻糖存在的 条件下干燥，Tm降低到一20 C，比完全水合的卵磷脂 的 Tm低 10 C，比没有海藻糖干燥的卵磷脂 的 Tm低 90 Cl】]。这样 ，干膜脂质在室温下是液晶相 ，避免了相 分离的发生，且在复水过程 中不会经历相转变和双分 子层的泄漏。 近十年来 ，一些研究者基于海藻糖和蔗糖在低水 分 含量时形成玻璃 的事实 ，提出了冻 干保护 的”玻璃 维普资讯 http://www.cqvip.com 国外医学输血及血液学分册 2005年第 28卷第 5期 化”假说。该假说认为玻璃化是在冻干过程中保护生物 材料的唯一要求。首先，玻璃化能够在冻结过程中避免 结晶，而冻结损伤都是直接或间接地由结晶引起的，因 此玻璃化可以避免冻结损伤；其次，处于玻璃态的物质 具有极高的黏度 ，一般为 1O ～1014Pa·S，当玻璃化 的保护剂包围在生物分子的周 围时 ，大分子物质 的分 子运动和分子变性反应变得非常微弱，膜 融合等 由分 子扩散运动造成 的损伤受到阻止。“玻璃化”假说给我 们如下启示 ：为了减小细胞在冷冻干燥过程中的损伤 ， 应保证细胞在整个冷冻干燥过程中始终处于玻璃态。 这就要求细胞溶液的最低冻结温度低于其玻璃化转变 温度 ，实现玻璃化冻结 。此外 ，在一次干燥 、二次干燥 以 及储存过程中，细胞温度应始终低于系统的玻璃化转 变温度。从这一点考虑，具有较高玻璃化转变温度的糖 类如海藻糖和蔗糖 ，以及高聚物如羟乙基淀粉(HES)、 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、白蛋 白、葡 聚糖等都是 良好的冻干保护剂，它们可 以防止在室温 下发生反玻璃化转变而导致细胞损伤 。 Crowe等口 对“玻璃化”假说进行 了验证 ，指出“玻 璃化”假说与“水替代”假说并不相互排斥 。玻璃化虽然 是在干态下稳定生物材料 的必要条件 ，但其 自身并不 足以实现这种保护功能，氢键的直接作用和玻璃化都 是必需的。一个典型的例子是 ：具有较高玻璃化转变温 度的羟乙基淀粉(HES)和能够与膜基团直接相互作用 的葡萄糖 ，单独使用均不能阻止干态下膜系统的泄漏 ， 但两者的组合使用能有效地保护膜系统r4]。目前，大部 分学者赞同这种观点，在血液细胞的冷冻干燥保存中 采用双糖和高聚物的组合作为冻干保护剂。 2 血液细胞冷冻干燥保存 的研究进展 2．1 血小板的冷冻干燥保存 1995年 ，Read等 用多 聚甲醛固定 的方 法提高 血小板在冻干过程中的渗透稳定性。洗涤后的人血小 板用 1．8 的多聚甲醛孵化 1h，重悬 于含 5 白蛋 白 的柠檬酸缓冲液中，在一2O C～4O C冻干 24h，然后保 存在一8O C低温冰箱中，冻 干血小板用咪唑缓冲液复 水。用电镜观察冻干复水后的血小板超微结构保存完 整，用流式细胞术测定表面受 体表达与正常血小板相 似，输注给狗和 鼠模型后能够 附着于内皮 下并在其表 面传播 ，但在体外对 ADP离体模拟时不能正常聚合。 这种方法的主要缺点是多聚甲醛与膜和蛋 白质会发生 不可逆的交联作用 ，改变血小板的化学结构 ，削弱正常 的止血作用并导致免疫反应 。此外这种冻干血小板必 须反复冲洗 以除去毒性 固定剂 ，这会导致大量的恢复 损失 ，因此这个方法 目前还不能用于临床 。 2001年 ，Wolkers等[6]在冻干血小板 的研究 中取 得了突破性 的进展 。他们发现血小板在 37 C时 ，能通 过液相内吞作用将不可渗透的海藻糖从细胞外环境有 效地载人到细胞 内部 ，4小时内海藻糖 的载入效率就 超过 5O 。将载人海藻糖浓度大于 I5raM 的血小板重 悬于含海藻糖和白蛋 白作冻 干保护剂 的缓冲液中，冻 干至残余水含量为 3 ～5 。经水蒸气预水合及复水 后 的血 小板恢 复率达 到 85 ，对凝血酶(IU／m1)、胶 原 蛋 白 (2~g／m1)、ADP(20／~mo1)和瑞 斯 托 菌 素 (1． 6mg／m1)的收缩反应 与对 照组 的新鲜血小板几乎相 同。傅立叶变换红外光谱学分析表明冻干复水后血小 板 的膜 以及膜 蛋 白成分 与新 鲜血小 板相似 。目前 ， Wolkers等r7 已经将冻干复水的血小板浓度提高到 1 ×1O。血小板／ml，体 积扩 大到血库 中血袋 的单 位 ，冻干的血小板在室温下至少保存 6个月，复水后得 到大于 85 的恢复率 。 冻干保存的血小板复水后 ，在动物模 型的体内实 验 中也表现 出令人鼓舞的结果 。Read等 将冻干复水 后的狗血小板用荧光染料 (PKH26)进行标记 ，并输注 给正常狗和患 yon Willebrand病 的狗 ，在受体 动物体 内没有明显的血液学改变 ，被标记的血小板在 4h内聚 集在创 口边缘 此外 ，给患血小板减少症的老鼠输注冻 干复水后 的人血小板 ，使其脚趾的止血时间从输注前 大 于 15min缩 短到输 注 后 的 0．5min～ 3min。Bode 等_8 将冻干复水后的人血小板输注到免疫抑制的血小 板缺少的兔模型体 内，在输注 1h后进行止血时间和体 内循环回收率的。实验结果表明输注冻干复水后 的人血小板 1h后 的止血时间为 252s，与输 注同样数 量的新鲜人血小板 1h后的止血时间 203s没有统计学 的差别。然而输注冻干复水后的血小板 1h后体内循环 的回收率 为 43 ～61 ，低于同样条件下新鲜血小板 77 的恢复率。之后 ，他们又用这种模型测定 了大容量 单采采集的，用 1．8 多聚甲醛固定 40min~60min的 冻干人血小板复水后的功能_g]。输注冻干复水后的人 血小板 30min后的止血时间为 372s，比前期检测 的止 血时间长，但在输注 3h后 ，止血时间依然保持在 600s 以内。冻干复水后的血小板输注 30min后体 内循环的 回收率为 5O ，3h后为 22 。这些结果表明冻干复水 后人血小板在体内循环过程中依然保持了部分功能。 2．2 红细胞的冷冻干燥保存 1989年到 1995年 间，GoodrichDo-lz3连续报道 了 用含高聚物、碳水化合物和聚阴离子化合物的溶液作 低温保护剂冻干红细胞 的实验结果 ，验证了不同种类 、 不 同分子量、不同浓度的保护剂的保护效果。细胞悬液 在温度一56C，压力小于 13Pa的条件下 ，冻干 6小时 维普资讯 http://www.cqvip.com 到 24小时使残余水分含量小于 3 。在 37 c 用含 25．5 蔗糖 的磷 酸缓 冲盐溶液 复水 ，细胞恢 复率 达 65 ，冻干复水后代谢酶维持正常的活性 ，血色素也维 持正常的生理功能，与新鲜 的红细胞类 似。1999年 ， Rindler等[1 a,t4]探讨了冻结速率 、干燥温度 以及保护剂 对红细胞冻干存活率的影响。他们采用 HES和麦芽糖 作保护剂 ，冻干搁板 温度控制在一5 C到 一65 C之间， 结果发现在一35 C冻干效果最好 ，麦芽糖 的保护效果 比海藻糖 、蔗糖和葡萄糖好 。冻干复水后 的最高恢复率 达到 47．9 。2000年 ，Bakaltcheva等u 使用可逆 的 交联剂DTBP结合 CO处理来稳定红细胞的结构和功 能，增加红细胞的渗透稳定性。经 Co预处理的红细胞 用 5mM 的 DTBP交联 3h，然 后用含 500mM 葡萄糖 的溶液孵化 24h，在含 15 白蛋 白的介质中冻干至残 余含水量 为 10％～15 ，经蒸馏水复水后 ，用游离血 红蛋白的百分比计算的细胞恢复率达 95％，随着残余 含水量的降低，恢复率会有所降低。2004年，Satpathy 等 ¨将红细胞在 800ram 海藻糖溶液中 37 C孵化 7小 时，利用细胞 内外海藻糖浓度差所产生的驱动力以及 红细胞膜在 37 C会发生磷脂相转变 ，使红细胞内部载 入 30mM～40mM 的海藻糖。将 载人海藻糖 的红细胞 冻干至残余含水量为 4 ～5％，用溶血率计算复水后 红细胞的恢复率达到 4O ，且复水后红细胞保持 了较 高的 ATP和 2，3一DPG水平 。关于冻干保存的红细胞 复水后 的人体输注实验 ，Weinstein等 作 了初步报 道 。他们采集 4名健康志愿者的静脉血 400ml，4 C存 放过夜 ，然后冷冻干燥保存 。给献血者回输 的当天将冻 干红细胞复水 ，用放射性同位素 Cr标记红细胞后 ，取 20ml在 5min内输完。结果表明，冻干复水后的红细胞 回输后未见临床 不 良反应 ，24h后红细胞体 内回收率 为 85．2±2．79 ，红细胞半寿期为 31．0±8．19d。虽然 关于红细胞的冻干保存 已经做了很多研究 ，但是因为 不 同研究者对冻干复水后细胞恢复率的判断标准不 同，到 目前为止还没有得到公认的结果。 2．3 脐带血的冷冻干燥保存 脐带血中含有丰富的造血细胞，是除骨髓、外周血 外 的第三种造血干细胞的来源。脐带血造血干细胞的 移 植有希 望成为异基 因骨髓移 植 的一种 替 代方法。 2004年 ，上海理工大学的肖洪海一 ]首次实现了脐带血 全血和单个核细胞的冻干保存。在 以 4O PVP+20 蔗糖 +10Vo甘露醇作保护剂时 ，冻干全血的细胞数 目 恢复率达到 38．9 ，细胞活性恢 复率 达到 89．18 ， CD34+细胞恢复率达到 64．29 ；冻干单个核细胞复 水后细胞数 目恢复率达到 75 ，细胞 活性恢复率达到 69．37 ，CD34+细胞恢复率达到 68．42 。比较脐带 国外医学输血及血液学分册2005年第 28卷第 5期 血全血和分离单个核细胞 的冻干结果 ，发现分离的单 个核细胞的冻干效果较好。因此 ，保存脐带血中的造血 干细胞应 以分离好的单个核细胞进行 ，不宜直接进行 全血冻干。 3 发展血液细胞冻干保存技术存在的问题及展望 3．1 将海藻糖引入细胞内部 大量的实验证明细胞 内的海藻糖能够在冻结和干 燥过程 中保护细胞 ，但是 由于一般情况下细胞膜对海 藻糖是不可渗透的，如何克服细胞膜对海藻糖的不可 渗透性，使细胞内达到一个较高的海藻糖浓度是个难 题 。 目前 为解决这个 问题 已有 的方法包括 ：① Beattie等 o]利用细胞膜在发生相转变时其通透性 的 短暂 增 加，将 海 藻 糖 引 入人 胰 岛 细 胞 内；② Eroglu 等 妇利用重组成孔溶血蛋 白，a一溶血素产生穿越细胞 膜 的通道 使海 藻糖进 入 两类 哺乳 动物 细胞 ；⑧ Guo 等 ]将海藻糖合成所用的基因通过腺病毒传递到人 包皮纤维原细胞内；④Oliver等 以及 Wolkers等 通过细胞的液相内吞作用将海藻糖引人人叶间干细胞 和血小板 ；⑤Shirakashi等【2 利用电脉冲改变细胞膜 的通透性将海藻糖引入 鼠骨髓瘤细胞。上述方法在实 验室 中都取得 了一定的成果 ，但对于不同种类的细胞 不具有通用性 ，而且考虑到冷冻干燥过程的实际操作 ， 大规模的临床应用还有一定的困难。 3．2 冻干工艺的优化 影响血液细胞冻干存活率的因素包括细胞的种类 和初始浓度、保护剂的种类和浓度、冻结速率、冻干过 程参数 (温度、压力、持续时间)、残余水分含量 、复水条 件等。对于不同种类 的细胞 ，需要探索其优化的冻干工 艺以提高冻干细胞的恢复率 。目前 ，关于血液细胞冻干 工艺的研究重点是组合冻干保护剂配方的选择 。除了 常用 的糖类和高分 子聚合物组合外 ，Conrad等 和 0htake等 分别发现硼 酸盐 和海藻糖 、磷 酸盐 和蔗 糖的组合对膜系统有较好的保护效果。随着人们对血 液细胞在冻干和储存过程 中保护 机理理解的深入 ，会 寻找到更有效 的保护剂组合 。此外 ，冻干过程参数 ，特 别是冷却速率、干燥温度、真空度等对细胞冻干存活率 也有很大的影响 ，它们涉及到冻结过程 中玻璃化的形 成和干燥过程中水蒸气穿过细胞膜升华的传热传质过 程 ，可以通过建立细胞冻干过程 的数学物理模型对冻 干过程参数加以优化 ，目前有关方面的研究较少。 血液细胞的冷冻干燥保存 有着美好的应用前景， 为了加快血液细胞冻干保存的应用和推广 ，需要运用 生物学、血液学、工程学等多学科知识 ，从理论分析和 实验研究的角度取得更大的突破 。 维普资讯 http://www.cqvip.com 国外医学输血及血液学 分册 2005年第 28卷第 5期 4 参考文献 1 Crowe JH，()liver AE，Tablin F． Is there a single biochemical adaptation to anhydrobi0sis?Integrative and Comparative Biology， 2002，42：497-503． 2 Crowe JH，Crowe LM ，()liver AE，et a1．The trehalose myth revisited：Introduction to a symposium on stabilization of cells in the dry state．Cryobiology，2001，43：89—105． 3 Crowe JH，Carpenter JF，Crowe LM．The role of vitrification in anhydrobi0sis．Annu Rev Physiol，1998，60：73 1O3． 4 Crowe JH，Oliver AE，Hoekstra FA，et a1．Stabilization of dry membrane by mixtures of hydroxyethyl starch and glucose：the role of vitrification．Cryobiology，1997，35：2O一30． 5 Read MS， Reddick RL， Bode AP， et aI． Preservati0n 0f hemostatic and structural properties of rehydrated lyophilized platelets：potential for long—term storage of dried platelets for transfusion．Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92：397—401． 6 Wolkers W F，Walker NJ， Tablin F，et a1． Human platelets loaded with trehalose survive freeze drying．Cryobiology，2001， 42：79-87． 7 Wolkers W F，W alker NJ，Tamari Y，et a1．Towards a clinical application of freeze—dried human platelets． Cell Preservation Technology，2003，1：175 188． 8 Bode AP，Blajchman MA， Bardossy L，at a1． Hemostatic properties of human lyophilized platelets in a thrombocytopenic rabbit model and a simulated bleeding time device．Blood，1 994， 84(Suppl 1)：464a 9 Bo de AP， Read MS． Lyophilized platelets： continued development．Transfus Sci，2000，22：99—1O5． 1 0 Goodrich RP，Williams CM ，Franco RS，et aI．Ly0philizati0n 0f red blood caIls．US Patent，1989，4：874—690． 1 1 Sowemimo—Coker SO， Goodrich RP， Zerez CR， et a1． Refrigerated storage of lyophilized and rehydrated， lyophilized human red cells．Transfusion，1993，33：322—329． 12 Goodrich RP， Sowemimo—Coker SO， Zerez CR， et a1． Preservation of metabolic activity in lyophilized human erythrocytes．Proc Natl Acad Sci U S A，1995。89：967 971． 13 Rindler V，Luneberger S，Schwindke P，et a1．Freeze drying of red blood cells at ultra—low temperatures．Cryobiology，1999，38： 2—15． 14 Rindler V，Heschel I，Rau G．Freeze drying of red blood cells： ·431· How useful are freeze／thaw experiments for optimization of the cooling rate．Cryobiology，1999，39：228—235． 15 Bakaltcheva I，Leslie S，MacDonald V，et a1．Reversible cross— linking and CO treatment as an approach in red cell stabilization． Cryobiology，2000，40：343—35 9． 1 6 Satpathy GR，T6r6k Z，Bali R，et a1．Loading red blood cells with trehalose： a step towards bi0stabilizati0n． Cryobiology， 2004，49：123—136． 1 7 Weinstein R。Sowemimo—Coker SO，Goodrich RP． Survival of lyophilized and reconstituted human blood cells in vivo．Trans Clin Biol，1995，2：427—432． 18 肖洪海．人脐带血全血和单核细胞冷冻干燥的实验研究：见博士学 位论 文．上海：上海理工大学动力工程学院．2004． 19 Chen T， Acker JP， Eroglu A， et a1． Beneficial effect of intracellular trehalose on the membrane integrity of dried mammalian cells．Cryobiology，2001，43：168—181． 20 Beattie GM ， Crowe JH ， Lopez AD， et a1． Trehalose： a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long—term storage．Diabetes，1997， 46：519-523． 21 Eroglu A，Russo MJ，Bieganski R，et a1．Intracellular trehalose improves the survival of cry0preserved mammalian cells． Nature Biotechnology，2000，18：163—167． 22 Guo N，Puhlev I，Brown DR．et a1．Trehalose expression confers desiccation tolerance on human cells． Nature Biotechnology， 2000，18：168—171． 23 Oliver AE， Jamil K， Crowe JH ， et a1． Loading human mesenchymal stem cells with trehalose by fluid—phase endocytosis．Cell Preservation Technology，2004，2：35—49． 24 Shirakashi R， Kostner CM ， M uller KJ， et a1． Intracellular delivery of trehalose into mammalian cells by electropermeabilization．J Membr Bo il，2002，189：45—54． 25 Conrad PB，Miller DP，Cielenski PR。et a1．Stabilization and preservation of Lactobacillus acidophilus in saccharide matrices． Cryobiology，2000，41：17-24． 26 Ohtake S， Schebor C，Palecek SP，et a1． Effect of sugar— phosphate mixtures on the stability of DPPC membranes in dehydrated systems．Cryobiology，2004，48：8i-89． (收稿 日期 ：2005—02—25) (本文 编辑 ：关德祥 ) 维普资讯 http://www.cqvip.com