磷酸肌酸对低温储存皮肤活力的影响

第 3l卷第 4期第 463页 2002年 8月 华 中科技 大学 学报 (医学版 ) J Huazhong Univ Sei Teeh I-Health Sc0 Vo1． 3l No． 4 P． 463 Aug． 2002 ， ” ” 。、 ；经验交流 ： 、 _． -． -． -． ．． -． ． ， 磷酸肌酸对低温储存皮肤活力的影响 谢 卫 国 易传 勋。 武汉市第三医院烧伤科 ，武汉市烧伤研究所 ，武汉 430060 华中科技大学同济医学院附属协 和医院整形科，武汉 430022 摘要 将新鲜离体皮片置人含磷酸肌酸 (PCr)的储存液 中 4 C储存，以琥珀酸脱氢酶 (SDH)及氧耗测定法动态 观察皮片活力 。结果发现 ，含 PCr的实验组皮片活力下降速度慢于不含 PCr的对照组 。提示 ：PCr对于防止储存皮肤活 力下降有一定作用 ，将 PCr与常规保存液 中的有效成分结合 ，有可能找到更为简便有效和经济实用的皮肤保存液 关键词 磷酸肌酸； 皮肤储存 ； 皮肤活力 中图法 分 类号 Q571 Effecfcs of Ph0sph0creatine on the Viabil ity of Human Skin Preserved at 4 ℃ Xie W eiguo ， Yi Chuanxun Department of Burn，Wuhan Third Hospital，Burn Institute of Wuhan，Wuhan 4 30060 。Department of Plastic Surgery，Xiehe Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022 、 Abstract The effects of phosphocreatine(PCr)on the viability of the human skin preserved at 4 C was evaluated by succinic dehydrogenase (SDH)assay and oxygen consumption．The results showed that the de— creased rate of the viability of the stored skin in the PCr group was slower than in the control groups．It was suggested that PCr might play some roles in preventing the decrease of the stored skin viability． Key words phosphocreatine； skin preservation； viability assay 皮肤移 植术 是全 层皮肤 缺损修 复 的重要手 段 ， 广泛应 用于整形 、烧 伤及创伤外科等领域 。不论 是 自体皮肤移植还是同种异体或异种皮肤移植 ，都常 常需要将离体皮肤在人工环境下加以储存以供随时 取用。离体皮肤储存的关键是防止其活力的下降。本 文研 究了外源性磷 酸肌酸 (Phosphocreatine，PCr)对 4 C储存 的皮肤 活力 的影响 ，以期 为筛 选低温组 织 储存液有效成分提供科学依据，探索简便有效的皮 肤储存 方法 。 1 与方 法 1．1 皮 肤来 源及 处 理 死亡后 3～6 h的成人尸体皮肤 ，厚约 0．3～ 0．5 mm，于下列几组储存液中储存 ：①磷酸缓冲液 组 (PBS)：0．01 mol／l PBS溶液；② 磷酸肌酸组 谢卫国 ，男，1959年生 ，博士研究生 ，主任医师 (PCr／PBS)：0．1 mol／I PCr，溶 于 pH 为 7．4的 PBS中；③ RPMI组：RPMI一1640培养液；④ PCr／ RPMI组 ：含 0．1 mol／I PCr的 RPMI一1640溶 液。各 组 均 含 1000 U／ml青 霉 素 及 1000 ttg／ml链 霉 素 。 RPMI一1640含 1O 小牛血清及 Hepes。临用前 加入 PCr，0．2／zm微孔滤器 过滤除菌 。每 3 d更换 1次储 存 液 ，维持 pH 7．2～7。4。 1．2 皮 肤活 力测定 从取得新鲜标本的当时起 ，每隔 1 d用圆形取 样器 取直径为 6 mm 的小块 皮 片 ，万分之一 电子天 平称重后分别行琥珀酸脱氢酶 (Succinic Dehydroge— nase，SDH)测定 及 氧耗量测定 引。所 得数据行方 差分析 。 2 结果 新鲜皮肤活力测定值 (n一20)：SDH测定法为 (0．019 0±0．002 1)OD／mg，氧耗 量 测 定 值 为 维普资讯 http://www.cqvip.com ·464· 华中科技大学学报 (医学版) 2002年 8月第 3l卷第 4期 (12．98±1．69)kPa。从 1、2可见 ，随着 时间的推 移各组储存的皮片活力均呈不同程度的下降，但含 PCr的两组活力下降速度慢于各 自对照组。 3 讨论 PCr是机体内能量的贮存形式。在机体正常代 谢情况下，体内ATP可将高能磷酸键 (～P)转 给 肌酸 (Creatine，Cr)生成 PCr，后 者所含高 能磷酸 键 不能被直 接利用。在机体 消耗 ATP过多而致 ADP增加时，PCr将其所含高能磷酸键转给 ADP 生成 ATP，再 供耗能反应使 用r33。过 去曾认 为 PCr 这种对机体能量代谢的调节作用主要存在于骨骼 表 1 4 C 储存皮 肤 SDH 活力测定值 (OD／mg皮 重 ， =20) 与 同一时 问 PBS组 比较 P<0．05， 一 ，<0．01；与 同一时 间 RPMI组 比较 ，<0．05 表 2 4 C储存人体 皮肤 氧耗量测定值 (kPa， 一20) 与 同一 时间 PBS组 比较 ’P<0．05， 一 <0．01；与 同一 时间 RPMI组 比较 广<0．01 肌、心肌及大脑等组织中。现已证实其在哺乳动物 的皮肤组织 中也起着一定作用I4]。由于 PCr的这种 重要作用 ，不少研究者认为其可能在改善缺血缺氧 组织的能量代谢供应 中具有应用前景。Okada等发 现 PCr能延长离体脑组织的存活时间l_5]。Parrat等 也证实 了 PCr对缺氧的离体心肌组织具有保护作 用I6]。Cuono等将 PCr用于缺血的皮瓣组织 ，发 现 能使缺血的皮瓣存活面积得到扩大I4]。本研究发现 外源性 PCr对防止储存皮肤的活力下降有较明显 作用。这一结果与前述文献中报道的 PCr对脑、心 等组织的保护作用有类似之处。分析其作用机制可 能主要有以下几点 ：① 通过将 PCr所含高能磷酸键 转给ADP而维持低温储存皮肤的能量供应，避免由 于能量耗竭而致的细胞损害；② 维持适当的 ATP／ ADP比值，避免因 ATP／ADP比值倒置而引起的多 种 ATP依赖酶功能障碍；③ 通过维持一定的 ATP 水平而发挥膜保护作用，减轻因膜损害而致的细胞 活力 下降 。 给保存组织提供必需的能量供应 ，保证其基本 代谢需求 ，是防止储存组织活力下降的重要途径之 一 。 在早期的皮肤储存实践中，保存液仅为含抗生 素的生理盐水 ，置普通 4lC冰箱内活力可保存 1周 左右。由于生理盐水缺乏营养成分及酸碱缓冲能力 ， 储存后皮肤活力下降很快。为了延长保存时间，有 人采用 了 1O 9，6血清生理盐水 、10％ Gargle溶液 、生 理盐水氨基酸溶液及一些复合细胞培养液等，都取 得了一定效果 。Cram等将用于细胞培养的 RPMI一 1640用于皮肤储存 ，使储存时间明显延长I7]。在本 研究 中，含 RPMI一1640的两组 多数时 间点 活力 明显 高于 PBS组 ，这 与其 他 研究 者 的结 果 一致 。加入 PCr后 RPMI对储存皮肤活力保存的效果有了进一 步提高 ，其作用随着时间的推移而渐趋明显 。本研 究观察的时间仅为 8 d，PCr对于储存皮肤活力的这 种保护作用是否会随着储存时间的延长而更加明 显 ，有待进一步研究。 目前用于临床的皮肤保存液配方多种多样 ，比 较常用的是含多种营养及添加成分的复合储存液 ， 但迄今对这些保存液的作用 尚无统一认识，对其中 包括血清在内的一些成分的作用还有争议。由于这 种多因素研究本身的复杂性以及研究对象、方法的 多样性，很多有关理论都还有待进一步研究证实。筛 选保 留有效成分 ，去除作用不明确的成分 ，仍是今 后研究工作的重要方向。PCr作为单一的添加成分， 其作用在本研究中得到了肯定 。将 PCr与 RPMI一 1640等其他保存液中的有效成分结合 ，有可能找到 更为简便有效和经济实用的皮肤保存液。 (下转 第 470页) 维普资讯 http://www.cqvip.com ‘ 470。 华中科技大学学报 (医学版) 2002年 8月第 3i卷第 4期 ND：未检测 出病毒或细胞病 变；Sindbis病毒的单位为 PFu／ml，HIV一1病毒的单位为 TCID 。／ml 3 讨 论 Sindbis病毒 和 HIV一1病毒 对 照 的病 毒滴 度分 别 为 1O ～1O 。，过滤前样 品病 毒滴 度较病 毒对 照有不同程度的下降，这是由于低 pH IVIG本身抗 病毒谱广 ，对病毒有中和作用 ，其低 pH也可灭活病 毒 。对 Sindbis病毒 和 HIV一1的过滤 ，可使其滴度下 降 1O 以上 ，说 明对大于 40 nlTl病 毒可有效清除 ， 但对小于 40 nlTl病毒的去除作用有待进一步证实。 在除病 毒前后 进行膜完整性 测试 ，确保 了除病 毒过 程 中膜 的完整性 和可靠性 。 Uhipor VF DV 。除 病 毒 过 滤 器 滤膜 是 一 种 新 型 、专用 的聚偏三 氟乙烯 (PVDF)材质 ，它有三层 滤膜结构 ，具有 强的亲水性和最 小的蛋 白吸 附性 ，它 在降低 病毒滴度 的同时保 证 了蛋 白质 的穿透性 ，从 而减少了蛋 白质 的损 失和变性 。实验证 明 ：IVIG 回 收率为 92．88 ～93．87 ，如果加大总的过滤体积 量 ，预计 回收率会 有所增加 。对 于 800 cm 有效过滤 面积 的滤芯而 言 ，12．5～13．0 ml／min的流速 显得 慢 了一 点 ，这可 以在 实际生产过程 中，根据 过滤量 与过滤 时间 的关 系选 择合适 的膜面积 的滤芯加 以解 决 。 Uhipor VF DV 。除 病毒过滤 器过滤 IVIG前 后 样 品的理化性质及 生物学活性无显著性差异 ，说 明 该滤器对样品质量无影响；该滤器的滤芯可耐受重 复高 压消毒 或 125 C在 线蒸汽消毒 ，从 而保 证了制 品的无菌性 ；该 滤芯符 合制药 “P”的质量 ，因 而保证 了生物安 全性和无 热原性 。过滤后 样 品的无 菌试验、热原质试验及安全试验均证明了此点。 总 之 ，Uhipor VF DV 。除病毒 过 滤 器对 IVIG 而言 ，既能有 效去除病毒 ，又对 蛋 白活性没有大 的 影响 ，如选 择适 当的膜面积能达 到规模 生产的要求 。 参 考 文 献 1 卫 生 部 生 物 制 品标 准 化 委 员 会编 ．中 国生 物 制 品规 程 (--部 )．北京 ：中 国人 口出版 社 ，1996．2O7～ 213 (2001—09—26 收 稿 ) (上接 第 464页) 参 考 文 献 1 Kearney J N ，W’heldon L A ，Gowland G．Cryopreserv— tion of skin using a murine model validation of a progno~ tic viability assay．Cryobiology，1 990，27：24 2 Zieger M A J，Trdget E E ，McGann L E．A simple of effective system fOr a~essing viability in split—thickness skin with the use of oxygen consumption．J Burn Care Rehabil，1993． 14： 310 3 Bessman S P，Carpenter C L． The creatine-creatine phosphate energy shuttle．A nn Rev Biochem ，1985，54： 831 4 Cuono C B．Cortes A ，M arquetant R et a1．Augmenta— tion of experimental skin flap survival via postoperative phosphocreatine replacement．Surgery，1987， 102：263 5 Okada Y ．Yoneda K．Effects of accumulation of phos— phocreatine on the survival of thin hippocampal slices from the guinea pig during deprivation of both oxygen and glucose．Neuromience Letter， 1983， 41： 119 6 Parrat J R，Marshall R J．The response of isolated car— diaC muscle to acute anoxia：protective effect of aden(>- sine and creatine phosphate．J Parm Pharmacol，1 974， 26： 427 7 Cram A E．Domayer M A．Short—term preservation of human autografts．J Trauma，1983，23：872 8 吴振忠 ，刘俊文 ，胡嘉念等．氢化可的松、地塞米松 、三 磷酸腺苷和 L一谷氨酰氨对 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