HPLC-ELSD法测定甘露醇的含量 (1)

定〔１２〕，采用乙腈：０畅５％磷酸流动相，对流动相比例１０∶９０）到７∶９３）进行比较，发现比例在８∶９２）时，保留时间适合，分离度也较好，因此选择８∶９２）作为流动相比例。参考文献〔１〕卫生部药典委员会畅卫生部药品中药成方制剂〔Ｓ〕畅第十三册畅１９９７，１５９畅〔２〕罗晶，李景辉畅车前草中有机酸的含量测定〔Ｊ〕畅药物研究，２０１０，１１：３４３５畅〔３〕焦坤，陈佩东，和颖颖，等畅白茅根研究概况〔Ｊ〕畅江苏中医药，２００８，１：９１９３畅〔４〕匡轩，匡芮，朱海涛畅玉米须的化学成分及药理保健功能〔Ｊ〕畅中国食物与营养，２００７，４：４６４８畅〔５〕赖海标，梅金喜，范文昌畅石韦的化学成分、药理作用和临床应用研究进展〔Ｊ〕畅中国医药导报，２０１０，７９１１畅〔６〕沈奇，顾龚平，张卫明，吴国荣畅植物绿原酸的研究动态〔Ｊ〕畅中国野生植物资源，２００５，２６６）：１３畅〔７〕邓良，袁华，喻宗沅畅绿原酸的研究进展〔Ｊ〕畅化学与生物，２００５，７：４６畅〔８〕罗思齐畅中草药活性成分含量测定概述〔Ｊ〕畅中草药，１９８９，２０９）：１９２６畅〔９〕国家药典委员会编畅中国药典〔Ｍ〕畅２０１０年版一部畅北京：中国医药科技出版社，２０１０，１０９７畅〔１０〕陈华龙，谭小勇，谭莉萍畅结石通片质量标准的研究〔Ｊ〕畅中国实验方剂学杂志畅２０１０，１６８）：７７８０畅〔１１〕兰小艳，张学俊，龚桂珍畅杜仲叶中绿原酸的研究进展〔Ｊ〕畅中国农学通报，２００９，２５２１）：８６８９畅〔１２〕国家药典委员会编畅中国药典〔Ｍ〕畅２０１０年版二部畅北京：中国医药科技出版社，２０１０，８３畅ＨＰＬＣＥＬＳＤ法测定蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉末胶囊中甘露醇的含量刘怀永１，黄宏南２，李晓明３，周芬霞３１畅福建医科大学福州３５０００４；２畅福建省疾病预防控制中心福州３５０００１；３畅福建中医药大学福州３５０１０８）摘要：目的　建立一种快速简便的蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉末胶囊中甘露醇的含量测定。方法　样品用水超声振荡提取过柱后再过膜进样，采用ＨｙｐｅｒｓｉｌＮＨ２柱４畅６ｍｍ×３００ｍｍ，５μｍ）为色谱柱，以乙腈∶水＝８５∶１５为流动相，流速为１畅０ｍＬ·ｍｉｎ－１，蒸发光散射检测器测定虫草中甘露醇的含量。结果　甘露醇在０畅２５０１畅５００ｍｇ·ｍＬ－１范围内线性关系良好ｒ＝０畅９９９２，ｎ＝５），收率为９９畅２％，ＲＳＤ为３畅５１％ｎ＝３）。结论　该方法选择性高、重现性好，可用于保健食品中甘露醇的含量测定。关键词：ＨＰＬＣＥＬＳＤ；蝙蝠蛾被毛孢菌丝体；甘露醇；固相萃取中图分类号：Ｒ９２７畅２　文献标识码：Ｂ　文章编号：１００６３７６５２０１３）１０００７９０２作者简介：刘怀永，男。学历：硕士研究生。研究方向：保健食品药品中有效成分研究。Ｅｍａｉｌ：８２６９９８５０５ｑｑ畅ｃｏｍ通讯作者：黄宏南，男。学历：博士。职称：主任技师。研究方向为营养与食品安全研究。Ｅｍａｉｌ：ｈｈｎ６６６６６６１６３畅ｃｏｍ　　蝙蝠蛾被毛孢即冬虫夏草Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）为我国名贵中药，生长于青藏高原及四川、云南等地的高寒灌丛草甸土壤。对其化学成分分析明，冬虫夏草中含有大量的甘露醇〔１〕。据临床报道甘露醇对多种疾病都有一定疗效，是虫草的主要有效成分之一〔２〕。甘露醇含量现已作为某些人工发酵虫草的质控指标之一，测定方法主要有薄层层析法、分光光度法、高效液相色谱法等〔３５〕。蒸发光散射检测器作为一种通用型检测器，具有灵敏度高，对流动相系统变化不敏感，可进行梯度洗脱等优点〔６〕。由于虫草化学成分非常复杂，用化学方法分析时干扰难消除，误差较大且操作较为繁琐。用高效液相色谱法测定虫草中甘露醇准确度较高，但样品处理较为复杂，本实验研究了不同类型的固相萃取小柱，进行样品的预分离，然后进行高效液相蒸发光检测甘露醇的含量，取得了满意的结果。1　实验部分1畅1　仪器和试剂　Ｗａｔｅｒｓ２６９５型高效液相色谱仪；ＡｌｌｔｅｃｈＥＬＳＤ８００蒸发光散射检测器；美国ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＤｉｒｅｃｔＱＵＶ超纯水系统；ＢｅｃｋＭａｎ离心机；超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司）；数显恒温水浴锅上海申胜生物科技有限公司）；甘露醇含量≥９９％；中国药品生物制品检定所）；蝙蝠蛾被毛孢菌丝体智得冬虫夏草真菌开发有限公司）；乙腈Ｆｉｓｈｅｒ公司）。1畅2　溶液制备　对照品溶液制备：精确称取甘露醇标准品０畅１０００ｍｇ配置浓度为１０畅００ｍｇ·ｍＬ－１标准储备液，储存于４℃冰箱中待用。用前稀释储备液作为标准使用液浓度５畅０００ｍｇ·ｍＬ－１）。②供试品溶液制备：精确称取胶囊内容物１畅０００ｇ，置２５ｍＬ离心管中，加入超纯水，摇匀，定容至１５ｍＬ。室温超声６０ｍｉｎ，超声功率２５０ｗ，然后１００００ｒ·ｍｉｎ－１，离心５ｍｉｎ，取上清液过０畅４５μｍ滤膜，进样检测。1畅3　色谱条件　色谱柱：氨基柱ＨｙｐｅｒｓｉｌＮＨ２４畅６ｍｍ×３００ｍｍ，５μｍ），流动相：乙腈水８５∶１５）；流速：１畅０ｍＬ·ｍｉｎ－１；柱温：３０℃；漂移管温度为７０℃，载气Ｎ２）流速为２畅７３ｍＬ·ｍｉｎ－１，进样量２０μＬ。在上述色谱条件下进行测定，·９７·ＳｔｒａｉｔＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌＶｏｌ２５Ｎｏ畅１０２０１３万方数据甘露醇标准品和供试品溶液色谱图见图１、２）。图１　标准品溶液色谱图图２　供试品溶液色谱图2　结果2畅1　线性关系和检测限　精确吸取“１畅２”中的标准使用溶液液０畅５０、１畅００、１畅５０、２畅００、３畅００ｍＬ于１０ｍＬ容量瓶中，加水稀释至刻度。以峰面积对甘露醇标准品的浓度绘制标准曲线，计算得归方程ｙ＝２３８３６ｘ－９１０畅４６ｒ＝０畅９９９２）。结果表明：甘露醇标准品溶液在０畅２５００１畅５００ｍｇ·ｍＬ－１范围内具有良好的线性关系。当信噪比为３时，甘露醇的检测限为１５０μｇ·ｍＬ－１。2畅2　精密度实验　精密称取胶囊内容物１畅０００ｇ，平行操作６份，进行测定。甘露醇ＲＳＤ＝３畅３５％结果表明该方法精密度良好。2畅3　重复性实验　取同一批次样品精密称取６份，按上述测定方法，进行６次平行实验测得甘露醇平均含量为９９畅２％，ＲＳＤ为１畅３４％，结果表明，方法重复性符合分析要求。2畅4　稳定性实验　取制备好的提取溶液，常温放置，每个４ｈ测定１次，平行操作３次，每个提取液做３个平行样，测得甘露醇ＲＳＤ＝１畅３７％，说明该提取液在２４ｈ内含量稳定。表１　样品加样收率试验取样量ｇ）甘露醇含量ｍｇ·ｇ－１）加标量ｍｇ）测得量ｍｇ·ｇ－１）收率％）１KK畅００２３弿弿畅４１１ǐǐ畅５３４NN畅６６９８畅７０１KK畅００２３弿弿畅４３３NN畅９６１KK畅００２３弿弿畅４３４NN畅７２１KK畅００２３弿弿畅４２３ǐǐ畅４４７NN畅２１１００畅４３１KK畅００２３弿弿畅４４６NN畅８９１KK畅００２３弿弿畅４４６NN畅９１１KK畅００２３弿弿畅４３５ǐǐ畅２５８NN畅１３９９畅７５１KK畅００２３弿弿畅４６０NN畅１２１KK畅００２３弿弿畅４５７NN畅１１2畅5　加标收率实验　精称取样品１畅０００ｇ，每个平行称取３份，加入甘露醇标准品，按照“１畅２畅２”项下处理后进行测定，计算收率见表１）。3　讨论本实验比较研究了ＨＬＢ、ＷＡＸ、ＳＡＸ和Ｃ１８４种固相萃取小柱对甘露醇纯化的影响，最终确定Ｃ１８小柱对样品的纯化较好。因为ＳｅｐＰａｋＣ１８固相萃取小柱可以预分离蛋白质、脂肪等难溶成分。由于ＳｅｐＰａｋＣ１８为反相柱，以水提取液直接过柱时蛋白质、脂肪等憎水性成分能保留在小柱上，而甘露醇为强亲水性成分，不在柱上保留〔７〕。在ＥＬＳＤ检测器中，漂移管的温度和载气流速是对信号响应有明显影响。在低流速载气时，噪音信号增大；高载气流速时，信号响应降低；漂移管温度低，溶剂挥发不完全；在低流速载气时，噪音信号增大；高载气流速时，信号响应降低；漂移管温度低，溶剂挥发不完全；当设置漂移管温度远大于挥发溶剂和样品温度，会导致样品部分流失，检测信号降低〔８〕。通过实验，在本文所选用的色谱条件下，Ｎ２流速为２畅７３ｍＬ·ｍｉｎ－１时为最佳，最佳漂移管温度为７０℃。本研究建立了一种简便、准确的分离、分析蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉胶囊中甘露醇的ＨＰＬＣＥＬＳＤ方法，为保健食品中甘露醇含量的测定提供依据。参考文献〔１〕中国医学科学院药物研究所畅中草药现代研究：第一卷〔Ｍ〕畅北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，１９９５，９９畅〔２〕陈传盈畅冬虫夏草工业深层发酵研究〔Ｊ〕畅中草药，１９９２，２３８）：４０９畅〔３〕林咸真畅甘露醇分析检测技术研究进展〔Ｊ〕畅河南化工，２０１０，２７２）：５６畅〔４〕李颜，史薇娜，唐庆九，等畅比色法测定冬虫夏草和蛹虫草中多糖和甘露醇的含量〔Ｊ〕畅食用菌学报，２００７，１４３）：５３５７畅〔５〕汤丹瑜，胡秋芬，杨光宇，尹家元畅固相萃取高效液相色谱法测定冬虫夏草中甘露醇〔Ｊ〕畅理化检验化学分册，２００３，３９１０）：５８５５８８畅〔６〕邓海根，曹雨震畅高效液相色谱仪的通用型质量检测器蒸发光散射检测器ＥＬＳＤ）〔Ｊ〕畅药物分析杂志，１９９４，１４３）：６１６３畅〔７〕汤丹瑜，胡秋芬，杨光宇，等畅固相萃取高效液相色谱法测定冬虫夏草中甘露醇〔Ｊ〕畅理化检验化学分册，２００３，３９１０）：５８５５８８畅〔８〕高青，周立春，田静畅ＨＰＬＣＥＬＳＤ法测定复方甘露醇注射液中甘露醇及葡萄糖的含量〔Ｊ〕畅药物分析杂志２００５，２５５）：５７９５８１畅枟海峡药学枠稿件要求表和图　表格采用三线表，两端开口，不用横线、纵线、斜线。上下行数字按个位数对齐，表内数字须与正文相一致，文字能说明问的可不用表和图。文中有表和图的，在文字说明中不要重复其数据。表要有表题，文稿只有一个表图），仍用表１或图１表示。图如果打印，最好用激光机，也可使用高质量的喷墨打印稿或绘图纸，或用碳素墨汁画在硫酸纸上，图下须有图文说明。·０８·海峡药学　２０１３年　第２５卷第１０期万方数据