中药独活保护血管性痴呆模型大鼠自由基的实验研究_翁姣

第 30 卷 第 4 期 2 0 1 2 年 4 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 4 Apr． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 899 学 刊 中药独活保护血管性痴呆模型大鼠自由基的实验研究 翁姣，王彩霞，杨微微 (辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847) 摘 要:自由基损伤在血管性痴呆发生、发展的过程中起着关键的作用，因此选取最具有代表性的 SOD 和 MDA作为检测指标。本实验从湿痰入手，选用既能祛湿又能轻身延年的独活为干预中药，并观察各组大鼠血清 中 SOD和 MDA的表达，进一步阐明血管性痴呆的发病机制，并为临床上治疗血管性痴呆提供新的思路。 关键词:血管性痴呆;独活;自由基损伤 中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1673 － 7717(2012)04 － 0899 － 02 Experiment Research on Protective Effect of Duhuo on Free Radical of Rats with Vascular Dementia WENG Jiao，WANG Cai-xia，YANG Wei-wei (Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China) Abstract:Free radical injury plays a key role in the occurrence and development of vascular dementia，thus the most representative free radical including SOD and MDA were chose as measuring indicators． This experiment was based on damp phlegm． Duhuo which can eliminate dampness and prolong life was selected as the intervention medicine，and the serum SOD and MDA expressions were observed． It is further clarified the pathogenesis of vascular dementia and provides new ideas for clinical treatment of vascular dementia． Key words:vascular dementia;Duhuo;free radical injury 收稿日期:2011 － 11 － 26 作者简介:翁姣(1982 －) ，女，辽宁辽阳人，硕士研究生，研究方向: 中医药延缓衰老的机理研究。 通讯作者:王彩霞(1963 －) ，女，辽宁沈阳人，教授，博士研究生导 师，研究方向:中医药延缓衰老的机理研究。 血管性痴呆(vascular dementia，VD)现在已经发展为常 见病、多发病，中医界多认为本病病位在脑，与肾关系密切， 病性属本虚标实，本虚指阴阳气血的不足，标实指湿邪、痰 浊、瘀血滞留体内。并且，其发病率随着人口老龄化和疾病 谱的变化有逐年升高的趋势，因此受到社会和医学界的极大 重视。血管性痴呆是脑血管疾病和心血管疾病后引发的获 得性智能损害综合征，是威胁中、老年人群身体健康的重要 疾病，主要表现为认知、记忆、语言能力、视觉功能、情商或人 格等方面的改变，尤以记忆丧失、高级认知功能减退为主。 1 实验材料 1． 1 实验动物 健康 Wistar 雄性大鼠 63 只，4 月龄，清洁 级，体重为(320 ±20)g，购于辽宁中医药大学实验动物中心。 1． 2 实验药品及制备 独活颗粒剂 购于辽宁省中医院 药局(江阴制药厂生产，批号:0908115) 尼莫地平 购于辽宁省中医院药局(正大青春宝药业 有限公司生产，批号:0904009) 1． 3 主要试剂 SOD测定试剂盒，MDA测定试剂盒，南京 建成科技有限公司。 1． 4 主要仪器及设备 紫外可见光分光光度计:北京普析 通用仪器有限公司;台式低速自动平衡离心机:L42B 沈阳 杰龙仪器有限公司;全自动酶标仪 anthos 2010:莱卡公司; HH． W21 － CR600 恒温水浴箱:北京长安科学仪器厂;各式 微量加样器及枪头，离心管，手术器械，酒精灯，天平等。 2 实验方法 2． 1 分组 根据随机原则，按照体重随机分为 5 组。分组 如下:第 1 组:空白对照组(10 只)第 2 组:假手术组(10 只) ;第 3 组:模型对照组(13 只)第 4 组:西药对照组(15 只) ;第 5 组:中药实验组(15 只)。 2． 2 VD动物模型的建立 模型对照组、中药实验组、西药 对照组、假手术组大鼠术前 12h 禁食，4h 禁水。用 10%水 合氯醛(0． 3mL /100g体重，腹腔注射)麻醉，确保手术进行 期间实验大鼠有自主呼吸。实验大鼠取仰卧固定，颈前部 按照手术规范备皮消毒，沿颈正中线纵向切开约 1． 5cm，钝 性分离双侧颈总动脉，注意避免损伤颈部的交感神经和迷 走神经，双重手术线结扎。术中大鼠肛温维持在 36． 5℃ ～ 37． 5℃。假手术组大鼠麻醉后进行颈前切开，钝性分离双 侧颈总动脉而不结扎。手术后动物均肌注青霉素以防感染 并送至通风良好，温度适宜的动物房饲养，每天给予充足的 饮食、饮水，一周后进行水迷宫测试。 2． 3 给药剂量 依据等效剂量换算直接计算法，把成人临 床的用药的剂量与大鼠的用药剂量进行换算，大鼠的等效剂 量是成人每日用药量的 6． 25倍。中药实验组每日灌服独活 颗粒剂 3． 125g /kg，西药对照组每日灌服尼莫地平 3． 125mg / kg，将中药配成 1g /mL，西药配成 1mg /mL的溶液。 2． 4 给药方法 中药实验组每日将独活以上述浓度灌 胃，0． 3125mL /100g /天。西药对照组用尼莫地平以上述浓 度灌胃，每日 0． 3125mL /100g /d。假手术组以生理盐水灌 胃，每日 0． 3125mL /100g。持续灌胃 28 天。 3 独活对各组大鼠血清中 SOD和 MDA的影响 如表 1 和图 1 所示，独活对各组大鼠血清中 SOD 的影 响，模型对照组与空白对照组、假手术组比较 SOD 活性明 显降低(P ＜ 0． 01) ，说明双侧颈总动脉持久结扎会引起大 鼠血清中 SOD活性的降低。西药对照组、中药实验组与模 型对照组进行比较 SOD的活性明显增高，中药实验组与模 型对照组比较 P ＜ 0． 05，西药对照组与模型对照组比较 P ＜ 0． 01，提示独活和尼莫地平对大鼠血清中 SOD的活性有 非常好的促进作用。中药实验组与西药对照组进行比较， 大鼠血清中 SOD的活性差异不显著(P ＞ 0． 05) ，说明两种 998 第 30 卷 第 4 期 2 0 1 2 年 4 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 4 Apr． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 900 学 刊 药物在促进 SOD的活性方面疗效相近。 表 1 独活对各组大鼠血清中 SOD和 MDA 的影响(n = 10 ，珋x ± s) 组别 SOD(U /mL) MDA(nmol /mL) 空白对照组 167． 61 ± 10． 23 4． 97 ± 1． 52 假手术组 168． 08 ± 10． 30 5． 84 ± 1． 86 模型对照组 121． 26 ± 18． 65◆◆ 14． 70 ± 2． 73◆◆ 中药实验组 137． 76 ± 18． 67★★▲ 12． 13 ± 2． 67★★▲ 西药对照组 143． 13 ± 16． 14★★▼▼ 11． 54 ± 2． 12★★▼▼ 注:与空白对照组、假手术组比较◆◆P ＜ 0． 01;与空白对照 组、假手术组比较★★P ＜ 0． 01;与模型对照组比较▼▼ P ＜ 0． 01; 与模型对照组比较▲P ＜ 0． 05;与西药对照组比较▲P ＞ 0． 05。 图 1 独活对各组大鼠血清中 SOD和 MDA的影响 独活对各组大鼠血清中 MDA 的影响，模型对照组与 空白对照组、假手术组比较 MDA 的表达增高(P ＜ 0． 01) ， 说明双侧颈总动脉持久结扎会引起大鼠血清中 MDA 表达 的增高。西药对照组、中药实验组与模型对照组进行比较 MDA的表达降低，中药实验组与模型对照组比较 P ＜ 0． 05，西药对照组与模型对照组比较 P ＜ 0． 01，提示独活和 尼莫地平对大鼠血清中 MDA 的表达有抑制作用。中药实 验组与西药对照组进行比较，大鼠血清中 MDA 的表达差 异不显著(P ＞ 0． 05) ，说明两种药物在抑制 MDA的表达方 面疗效相近。 4 中药独活抑制自由基损伤对血管性痴呆(VD)的影响 探讨 脑组织中含有大量不饱和脂肪酸，因此最易受到自由 基的攻击，当自由基过多时就会损伤脑组织，使细胞老化， 并损伤生物膜，导致线粒体损伤甚至死亡，最终使脑组织的 功能发生异常，最明显的就是学习、记忆功能的减退。在脑 组织处于缺血缺氧时，就会产生大量自由基，这些自由基会 进一步损伤生物膜，加剧脑细胞的老化，不仅如此，过多的 自由基还可以改变血液流动力学，引发微循环障碍和局部 缺血的发生，导致脑组织神经细胞受到极大程度的损害，最 终导致 VD的发病。 4． 1 对 SOD的干预 超氧化物歧化酶(SOD)存在于一切 生物机体内，其能通过催化超氧阴离子自由基而发生歧化 反应，进而减轻或消除超氧阴离子自由基对人体的损害。 SOD能专一地清除氧化过程中产生的超氧阴离子自由基， 是机体抵挡自由基损伤的第一道防线，对维持体内自由基 产生与清除的动态平衡起着重要的作用［1］。人体所处的 自然环境和社会环境非常复杂，人体内部会经常不断地产 生自由基，特别在病理过程中，超氧阴离子自由基大量产 生，正常人体生理过程中所产生的超氧阴离子自由基是维 持生命必需的，但当其浓度过高时，对机体会造成损害并且 这些超氧阴离子自由基会使病情加重，在这种情况下，SOD 会清除超氧阴离子自由基，阻断自由基连锁反应，使细胞内 钙负荷降低，同时还会增加缺血区域超氧化物歧化酶的活 性和含量，这些是减少脑缺血 /再灌注损伤的关键之一［2］。 所以超氧化物歧化酶在生物体的生命活动中具有重要意 义。很多文献报道，VD患者脑内自由基代谢平衡紊乱，自 由基含量显著增高，并且机体对自由基的防御能力也下降。 而 SOD正是机体新陈代谢中的抗氧化酶，可以防止缺血脑 组织的氧自由基异常，对脑组织起到保护作用［3］。另外， 动物实验也研究发现，衰老大鼠的学习、记忆功能的障碍可 能与机体内自由基数量的增多有关。因此，脑组织或血清 中 SOD下降，大量自由基产生，但机体不能完全的代偿，而 使自由基滞留，逐渐加重了血管内皮细胞和脑组织损害，严 重影响脑功能的发挥，最终导致 VD 的发生。另外，有研究 表明［4］，缺血 － 再灌注的过程中会产生过量的一氧化氮 (NO) ，NO可以通过自由基或其他途径引发神经毒性。并 且，这种神经毒性可以引发缺血后的脑损害痴呆的形成。 SOD可减轻 NO产生的神经毒性，从而对血管性痴呆起到 防治的作用。 本实验研究表明，模型对照组与空白对照组比较血清 中 SOD的活性降低，说明双侧颈总动脉持久结扎所致的 VD动物模型会使大鼠血清中 SOD的活性明显降低。西药 对照组、中药实验组与空白对照组、假手术组、模型组对照 比较，差异显著，说明两药均能促进双侧颈总动脉持久结扎 所致的 VD大鼠血清中的 SOD 的活性。从而，说明中药独 活对 VD的治疗有效。 4． 2 对 MDA 的干预 丙二醛(MDA)是自由基对生物细 胞发生膜损伤之后产生的主要代谢产物，可反映机体组织 中自由基的含量及脂质过氧化的程度，也可反映自由基对 组织的损伤程度。其能致使 DNA 发生突变、生物膜变性、 坏死，蛋白质功能紊乱，从而导致学习忆力能力的下降，因 此，MDA是衡量脑缺血再灌注损伤所致 VD 的重要指标之 一。MDA产生的根源在于神经元谷氨酸，在缺血再灌注过 程中，会产生大量的神经元谷氨酸，并产生 N －甲基 － D － 天冬氨酸，过度增加的神经元谷氨酸通过激活 N －甲基 － D －天冬氨酸受体，使 Ca2 +通道开放，细胞外钙离子不断大 量内流，触发花生四烯酸代谢瀑布，致使产生过多的氧自由 基，其能攻击脑细胞膜，导致脂质过氧化，引发其最终产物 MDA显著增高。 本实验采用双侧颈总动脉持久结扎的方法复制 VD 模 型，模型对照组与空白对照组比较血清中 MDA 的表达升 高，说明双侧颈总动脉持久结扎所致的 VD 动物模型会使 大鼠血清中MDA的表达明显升高。西药对照组、中药实验 组与空白对照组、假手术组、模型对照组比较，差异显著，说 明两药均能抑制双侧颈总动脉持久结扎所致的 VD大鼠血 清中的MDA的表达。这些结论正是说明了，脑缺血再灌注 引发大鼠血清中MDA的含量明显增高，此间，耗氧量增加， 自由基产生过多，脂质过氧化程度加深，导致脑组织的氧化 损伤不断加重。 5 结 论 采用双侧颈总动脉持久结扎的方法塑造慢性脑灌注不 足的血管性痴呆大鼠模型，造模后的模型对照组、中药实验 组、西药对照组大鼠血清中 MDA 表达增高，SOD 的活性下 降，这些可能是血管性痴呆的病理表现。 独活可以抑制大鼠血清中 MDA 的表达，提高 SOD 的 活性，提示独活能抑制 VD模型大鼠的自由基损伤，这些可 能是独活预防治疗血管性痴呆的机制。 参考文献 ［1］ 李磊，马长清，刘飞鸽，等． 超氧化物歧化酶的固定化及其酶 学性质．中国生物制品学杂志． 2009，22(2) :153． ［2］ Isabelle M，Michel P，Dominique L． Antioxidant strategies in the treatmentof stroke［J］． Free Radical Biology＆Medicine， 2005，39:429 － 443． ［3］ 吴杰、周丹、杜志军等．多梗塞痴呆患者血清细胞黏附分子 － 1 和超氧化物歧化酶的变化及意义［J］． 中国实验诊断学， 2005，9(4) :574 － 576． ［4］ 张敬伟． NO、SOD与缺血性脑血管病的关系［J］．中国误诊学 杂志，2005，5(5) :900． 009