内质网应激在四氯化碳致大鼠急性肝损伤中的作用探讨

基金项目:首都医科大学基础 �临床合作项目 ( 2007 JL57)资助 作者简介:温韬,博士,研究方向:各种肝病基础研究 通讯作者:朴正福, E�m ai:l zfp iao88@ yahoo. com. cn 内质网应激在四氯化碳致大鼠急性肝损伤中的作用探讨 温 � 韬 1,张海燕 1, 卢 � 静2,李胜利 2,王晶晶 2, 朴正福1 首都医科大学附属北京佑安医院肝炎研究所,北京 100069; 2.首都医科大学实验动物科学部 �摘要 � 目的 � 研究内质网应激在四氯化碳诱导的大鼠急性肝损伤中的变化规律和作用机制。方法 � 采用四氯化碳制备大鼠急 性肝损伤模型, 动态测定大鼠肝脏 GRP78蛋白和 caspase 12酶原表达情况,测定大鼠血清 ALT、AST水平、肝组织 SOD活性、MDA 浓度和 caspase 3活性变化; 采用 HE染色和 TUNEL法观察肝组织病理形态学和肝细胞凋亡变化。结果 � 四氯化碳染毒后大鼠肝 脏 GRP78蛋白表达显著增加, caspase 12酶原表达相应减少,呈一定时间依赖方式。大鼠染毒后出现血清 ALT、AST水平以及组织 MDA含量显著升高, SOD活性明显下降, 与对照组有显著性差异 (P < 0. 01);染毒后大鼠肝组织 caspase 3活性亦显著升高, 病理学 及 TUNEL法检测结果均显示肝脏有严重损伤,大量肝细胞发生凋亡。结论 � 四氯化碳诱导大鼠肝损伤时 GRP78和 caspase 12的 表达变化表明发生了内质网应激反应,其变化趋势和大鼠肝细胞凋亡、病理损伤一致, 这一结果提示内质网应激介导的肝细胞凋亡 参与了大鼠肝损伤。 �关键词 � 肝损伤; 内质网;应激; 细胞凋亡;四氯化碳 中图分类号: R575� � � 文献标识码: A� � � 文章编号: 1006- 5709( 2008) 10- 0786- 04� � � 收稿日期: 2008�03�20 Endoplasm ic reticulum stress in the developm ent of acute liver injury induced by CC l4 in rats WEN T ao 1 , ZHANG Ha iyan 1 , LU Jing 2 , L I Sheng li 2 , WANG Jing jing 2 , PIAO Zhengfu 1 1. Inst itute o fH epatit is, Beijing You�anHospita,l A ffiliated to Cap italM ed ical University, Be ijing 100069; 2. D epart� ment o f Laboratory An imal Sc iences, C apitalUn iversity ofM ed ica l Sciences, China �Abstract � Objective� To invest igate endoplasm ic reticulum ( ER ) stress in the deve lopm ent o f acute liver in jury in� duced by carbon tetrach loride( CC l4 ) in rats. Methods� Male Sprague�Daw ley rats w ere random ly allocated to estab lish acute liver in jurymodels by the adm in istration ofCC l4 intraperitoneally ( .i p). The expression o fGRP78 and caspase�12 in the liver of CC l4 �treated rats w ere determ ined byW estern b lot analysis at different t ime. Serum ALT, AST and liver MDA concentrat ion and SOD act iv ity as we ll as caspase�3 activ ity w ere analyzed fo llow ing CC l4 in ject ion. H epatocyte ap� optosis w as detected by TUNEL m ethod and damage o f liverw as exam ined by h istopatho log ica lmeans. Results� Itw as shown that adm in istration of CC l4 to rats caused amarked hepatic damage, characterized by significant e levation of serum ALT, AST leve ls and liverMDA conten,t caspase�3 activ ity comb ined w ith a remarkab le reduct ion in liver SOD activ ity w hen compared w ith the control group. H istopatholog ical observations revealed severe damage such as necrosis, fibrosis, haemo rrhage, fatty degeneration. M assive hepatocyte apoptosis took place in the liver of rats follow ing CC l4 treatmen.t The expression o fGRP78 increased sign ificantly from 6 to 36 hours after CC l4 adm inistration wh ile the expression of pro� caspase�12 decreasedmarked ly at the same time. Conclusion� The changes o fGRP78 and caspase�12 expression in rats suggested that endoplasm ic reticu lum stress occurred as a result of CC l4 adm inistrat ion. H epatocyte apoptosis med iated by endoplasm ic ret iculum stress m ight play an importan t ro le in the deve lopm ent of acute liver injury caused by CC l4. �Key words � L iver in jury; Endoplasm ic ret iculum; Stress; Apoptosis; Carbon tetrach loride � � 内质网应激 ( endoplasm ic ret iculum stress, ERS ) 是指细胞内质网钙稳态失衡或蛋白质加工运输障碍、 生理功能发生紊乱的一种亚细胞器的病理过程 [ 1] , 近 年来研究发现,内质网应激与机体的多种疾病密切相 关,如糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病和各种类型 的肝损伤等,其机制可能与内质网应激诱导细胞凋亡 有关 [ 2]。本研究拟以内质网应激为切入点,通过建立 四氯化碳诱导的大鼠急性肝损伤模型, 研究内质网应 激的标志性蛋白 GRP78和 caspase�12在肝损伤过程 中的变化规律及其介导肝细胞凋亡的作用机制, 同时 结合肝功能、氧化应激、组织病理学变化等指标, 探讨 内质网应激反应在中毒性肝损伤发生中的病理生理意 义及其作用机制,为进一步探明中毒性肝损伤的发病 机理提供重要线索。 1� 材料与方法 1. 1� 动物模型制备和实验分组 � 健康 SD大鼠 30 只,雄性,体重 250~ 300 g (首都医科大学动物实验中 !786! 胃肠病学和肝病学杂志 � 2008年 10月第 17卷第 10期 � Ch in J Gastroentero lH epato ,l Oct 2008, Vo l� 17, No�10 心提供 ) ; 在恒温 ( 25 ∀ )、光照周期 12~ 12 h环境中 饲养 1周后实验,实验前 12 h和实验期间禁食, 自由 饮水。随机分为正常对照组和实验组, 实验组又按不 同时间点分 3、6、12、24、36 h 5个亚组,每组各 5只。 新鲜配制 50%四氯化碳植物油溶液,按 3 mL /kg剂量 给予大鼠腹腔注射;对照组只注射等量的植物油溶液。 1. 2� 取材 � 按不同时间点取大鼠肝组织, 部分用 4% 甲醛溶液固定,石蜡包埋, 拟制备组织切片;部分肝组 织立即投入液氮冻存,待制备组织匀浆;同时采集大鼠 股静脉血,于 3 000 # g离心 10 m in后留取上清 - 70 ∀ 冻存待测。 1. 3� 生化指标测定 � 采用全自动生化分析仪测定大 鼠血清 ALT、AST水平; 采用黄嘌呤氧化酶法测定大鼠 肝组织匀浆的 SOD活性, 采用硫代巴比妥酸法测定肝 组织 MDA含量。 1. 4� W estern blot检测肝组织 GRP78和 caspase�12 蛋白表达变化 � 用细胞裂解液制备大鼠肝组织匀浆, 4 ∀ 高速离心后留取上清并进行蛋白定量 ( B radfo rd 法 ) ;取 50 �g蛋白经 SDS�PAGE电泳、转膜、封闭, 然 后以兔抗鼠 GRP78(美国 abcam公司产品, 1∃500稀 释 )和 caspase�12多克隆抗体 ( Chem icon Internat iona 公司产品, 1∃500稀释 )进行孵育, PBST漂洗后以辣根 过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG抗体 (中山生物技术有 限公司提供, 1∃2 000稀释 )进行二抗反应。最后在暗 室中以 ECL发光液 ( P ierce公司 )进行显影、曝光, 并 用 B io�Rad图像分析系统对所得区带进行扫描, 经 �� actin校正后,比较各组的积分光密度值。 1. 5� caspase�3测定 � 采用 caspase�3试剂盒 ( P romega 公司产品 )测定肝组织 caspase�3活性,方法简述如下: 取 50mg新鲜肝组织, 用细胞裂解液充分匀浆, 冰浴、 高速离心后取上清,进行蛋白定量。加 caspase�3反应 液振荡混匀, 37 ∀ 避光反应 4 h,在酶标仪上测 400 nm 处的吸光度值, 最后根据公式计算 caspase�3 活化 程度。 1. 6� 病理学变化 � 以石蜡包埋的肝组织标本制备 4 �m切片, HE染色,光学显微镜下观察组织损伤情况。 1. 7� 细胞凋亡 � 采用 TUNEL法测定肝细胞凋亡, 试 剂盒为德国 Roche公司提供,具体操作按说明书进行; 细胞核被染成棕黄色并有凋亡特征性者为阳性细胞。 1. 8� 统计学分析 � 所有数据以均数 %差 ( x % s ) 表示,以 SPSS 11. 5统计软件进行分析处理。 2� 结果 2. 1� 一般情况 � 正常大鼠肝脏体积正常, 呈鲜红色, 表面光滑、边缘整齐, 组织切片显示肝细胞、汇管区、胆 管上皮细胞等形态结构完整,未见变性、坏死等。大鼠 图 1� 各组大鼠肝组织病理改变 � A: 正常组, B:四氯化碳染毒 12 h ( HE 200# ) ; 图 2� 各组大鼠肝组织凋亡情况 � A: 正常 SD大 鼠肝组织, B: 四氯化碳染毒 24 h大鼠 ( TUNEL 400 # ) F ig 1� Hepatocyte pathologic changes of each group SD rats� A: L ive r of norm a l SD rats, B: L iver of SD rats a fter adm in istra tion of CC l4 12 h (H E 200 # ); Fig 2� Hepatocyte apoptosis of each group SD rats� A: L ive r o f norma l SD rats, B: L iver of SD rats after ad� m inistration of CC l4 24 h( TUNEL 400 # ) !787!胃肠病学和肝病学杂志 � 2008年 10月第 17卷第 10期 � Ch in J Gastroen tero lH epa to,l O ct 2008, Vol�17, No� 10 腹腔注射四氯化碳 6 h后,可见到肝细胞胞浆疏松化, 并可见散在的嗜酸变性等; 12 h后肝损伤明显加重, 肝脏体积增大,色灰暗呈土黄色,并有腹水渗出、黏连 等;组织病理学显示: 以中央静脉为中心的肝细胞出现 典型的胞浆疏松变性、气球样变及脂肪变等,并可见坏 死细胞及中性粒细胞、库普细胞浸润等 (见图 1)。 2. 2� 细胞凋亡检测结果 � TUNEL染色的阳性细胞胞 浆不着色, 胞核被染成棕褐色, 核固缩, 染色质浓聚。 正常大鼠肝组织无明显的细胞凋亡, 四氯化碳染毒 3 h 后大鼠肝细胞开始出现凋亡, 但数量较少, 12 h出现 大量肝细胞凋亡,分布广泛, 24 h凋亡细胞达到高峰, 与肝损伤严重程度呈正比 (见图 2)。 2. 3� 大鼠血清 ALT、AST和肝脏 SOD、MDA变化 � 研究结果显示, 给予四氯化碳 3 h后, 血清 ALT、AST 水平即开始升高, 24 h达到高峰, 与正常对照组相比 有显著性差异 (P < 0. 01), 36 h时有所下降, 但仍高于 正常对照组。染毒 6 h后肝组织 SOD活性开始降低, M DA含量相应升高, 随着时间延长肝损伤加重, SOD 活性下降和 MDA浓度升高趋势更为明显, 与正常对 照组相比差有显著性差异 (P < 0. 01) (见表 1)。 表 1� 急性肝损伤大鼠血清 ALT、AST水平和肝脏 SOD活性、 MDA含量变化 (x % s) Tab 1 � Conten ts of serum ALT, A ST, SOD activity and MDA of liver in acu te hepat ic failure of rats( x % s) n ALT ( U /L) AST (U /L ) SOD ( U /m g) MDA ( nm ol /mg) 对照组 5 59. 4 % 12. 1 � 96 % 9. 74 83. 6 % 4. 1� � 2. 03 % 0. 59 3h 5 � 106 % 25. 7 � 125 % 20. 4 77. 2 % 9. 6� � 2. 73 % 1. 43 6h 5 � 492 % 38. 7 � 585 % 48. 6 53. 6 % 12. 4� � � 4. 43 % 1. 25 12h 5 1 032 % 62. 9 � 768 % 59. 8 46. 5 % 15. 7� � � 4. 87 % 1. 34 24h 5 2 124 % 132. 4 1 429 % 172. 1 45. 9 % 18. 3� � � 5. 72 % 0. 83 36h 5 1 372 % 278. 3 1 074 % 242. 6 58. 4 % 19. 4� � � 3. 94 % 1. 07 2. 4� 大鼠肝脏 GRP78和 caspase�12蛋白表达情况 � GRP78在正常大鼠肝组织中有表达, 四氯化碳染毒后 6 h表达开始增强, 其后均维持在较高的水平, 显著高于 对照组 (P < 0. 01);正常大鼠肝脏高表达 procaspase�12, 图 3� W estern b lot检测大鼠肝脏 GRP78和 caspase�12表达 F ig 3� Expression s of GRP78 and caspase�12 in liver by west� ern b lot 给予四氯化碳之后 procaspase�12表达开始降低, 24 h 和 36 h表达至极低水平,与正常对照组相比有显著性 差异 (P < 0. 01) (见图 3)。 2. 5� 大鼠肝脏 caspase�3活性变化 � 四氯化碳染毒 6 h后大鼠肝组织的 caspase�3活性明显增强, 24 h达峰 值,其后活性有所下降但亦显著高于正常对照组。 (见图 4)。 图 4� 大鼠肝脏 caspase�3活性变化 � 与对照组相比* P < 0. 01 F ig 4� Effect of caspase�3 activity in liver of SD rats� * P < 0. 01 com pared w ith contro l g roup 3� 讨论 中毒性肝损伤 ( Drug /chem icals�induced liver in ju� ry)是指药物、外源性毒物及其代谢产物引起的肝脏损 伤性病变, 临床上十分常见, 发病率仅次于病毒性肝 炎 [ 3, 4]。近年来,随着新药、新化学物质的不断出现和 环境污染加剧,药物 /中毒性肝损伤的发病率呈明显上 升趋势。中毒性肝损伤的发病机制非常复杂, 对其肝 细胞损伤的确切发病机制目前尚不清楚。新近研究表 明, 应激可能是中毒性肝损伤发生过程中的重要环 节 [ 5�7] ,如线粒体应激、内质网应激和氧化应激等, 其 中内质网应激在肝损伤中的地位尤其受到关注。 研究发现,内质网应激可能是机体应激时发生在 细胞中的最早期反应,它可以激活内质网分子伴侣等 保护分子的表达, 以保护细胞, 抵抗应激, 维持生存。 肝脏是体内最大的药物代谢器官,是外源性毒物 /药物 攻击的主要靶器官。多数外源性化合物须通过内质网 膜上的混合功能氧化酶系统 (如 CYP450酶系 )进行生 物转化和代谢,最后形成无活性成分排出体外,因此内 质网在肝脏解毒作用中占据非常重要的地位 [ 3�5] , 但 此过程亦可能会影响内质网的结构或功能,诱导内质 网应激反应,继而引起细胞凋亡、肝损伤等一系列级联 反应。由此可见,内质网应激与中毒性肝损伤的发生 发展可能密切相关,值得深入探讨。 本研究发现,给予 CC l4可诱导典型的大鼠肝脏损 伤,表现为血清 ALT、AST水平显著升高, 组织病理学 显示有严重的肝脏损伤和细胞凋亡等; 染毒后大鼠肝 组织 GRP78蛋白表达明显增加,同时伴有 caspase�12 酶原活化、表达减少, 和正常对照组相比有显著性差 !788! 胃肠病学和肝病学杂志 � 2008年 10月第 17卷第 10期 � Ch in J Gastroentero lH epato ,l Oct 2008, Vo l� 17, No�10 Lenovo 高亮 Lenovo 高亮 Lenovo 高亮 异。GRP78是内质网应激反应的标志性蛋白 [ 8�10] , 一 般在发生内质网应激时表达会显著增加,其作用是促 进内质网中蛋白质的重新折叠、修饰和寡聚化,以形成 正确的构象并输送到高尔基体; 此外, GRP78表达增 加还有利于调节内质网膜对钙离子的释放,以维持胞 内钙离子平衡等 [ 10]。结果表明 CC l4能诱导发生内质 网应激反应, GRP78是细胞抵抗应激的重要机制, 适 度反应有助于保护细胞,维持生存,但严重地或长时间 地内质网应激则可以损伤内质网结构, 引起细胞功能 障碍, 导致细胞凋亡。 大鼠染毒后组织 caspase�12酶原发生活化, 表达 减少, 即提示内质网应激同时启动了肝细胞凋亡的信 号通路 [ 9, 11, 12 ]。研究证实, caspase�12是内质网应激介 导细胞凋亡的一个主要调节因子, 属于蛋白质水解酶 caspases家族成员, 正常情况下以蛋白酶原的形式存 在于细胞内质网内膜上 [ 13�15] ; caspase�12活化之后可 通过激活 caspase�9和 caspase�3等效应分子, 独立地 诱导肝细胞凋亡,而不需依赖于其他如死亡受体和线 粒体损伤途径。 根据上述结果,还检测了肝组织 caspase�3活性变 化, caspase�3是凋亡过程中十分关键的蛋白酶, 是多 种凋亡途径下游的共同效应部分 [ 16] , 结果发现大鼠染 毒后 caspase�3活性明显增加, 其变化趋势和内质网应 激反应的变化规律基本一致。TUNEL测定结果亦表 明,大鼠染毒 6 h后开始发生明显的细胞凋亡, 其趋势 与 caspase�3活性的变化一致, 提示内质网应激诱导的 细胞凋亡参与了中毒性肝损伤的发生机制。 染毒大鼠的氧化应激指标检测结果,发现大鼠染 毒后组织 MDA浓度显著增加, SOD活性下降,提示发 生脂质过氧化反应,并可能是肝细胞损伤的重要原因。 已知 CC l4通过内质网上的 CYP酶系代谢转化时, 常 会过量产生自由基, 使肝细胞膜上磷脂分子脂质过氧 化,造成生物膜受损、线粒体膜通透性增加等, 最终导 致肝脏损伤 [ 4�6 ]。大量产生的自由基可能首先攻击内 质网使其结构和功能受损,导致内质网膜脂质过氧化、 蛋白变性,进一步加重内质网的应激反应等。因此,可 以推测氧化应激是启动细胞内质网应激的关键因素 之一。 综上,可以推定内质网应激在中毒性肝损伤中起 重要作用,但其发生发展过程中的许多环节尚未明了, 如内质网与线粒体或其他亚细胞器的应激、氧化应激 之间的具体关系,还有内质网应激是否为中毒性肝损 伤的早期事件或共同通道等, 这些问题还有待于进一 步深入探讨。 参考文献 [ 1] Ru tkow sk i DT, K aufm an RJ. 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