CEF、DEF培养

鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸭胚成纤维细胞(DEF)培养 一、 9¬10日龄鸡胚 13¬14日龄鸭胚 眼科剪、 镊、外科镊 、巴氏吸管 、蛋架、灭菌平皿 25ml小三角瓶 Hanks＇液 0.25%胰酶液 Versene液 灭菌纱布、玻璃漏斗、0.1% 结晶柠檬酸（0.1M）或0.4%台盼兰,血球计数板、60ML培养瓶或60ML培养皿、灭菌盖玻片、营养液。 二 方法（CEF为例） 鸡胚 理：取9¬10日龄鸡胚直 于蛋架，在气室部用于5%碘酊棉 消毒，再用洒精棉 脱色，用外科镊击破蛋壳用眼科镊取出胚体放于平皿内，去喙瓜眼和内脏，用Hank＇s液洗两次，用弯头眼科剪剪胚剪成1-2mm的碎块，加Hank’s液20ml,略加摇振，静置使组织块下沉，将混有红血球及碎片的上悬液吸去，重复洗2—3次，直至上悬液不混浊为止。 2、 消化：将0.25%胰蛋白酶溶液用5、6%NaHCO2滴定至PH7、6—7、8，加热至37度，按组织块量3—5倍加于装有鸡胚碎块的三角瓶中，每个鸡胚约需胰酶5ml，30分钟取出，静置1—2分钟，吸去胰液，再加HanK’s液20ml，轻轻摇动后吸去，如此反复两三次，目的是洗去残余的胰酶。第三次加入营养液，每胚3ml左右，用粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散。静置1—2分钟，候组织下沉后，细心将细胞悬液吸出，另置一只25ml三角瓶，如此反复数次，使细胞尽量自组织块脱落，将多次取得的悬液合并一处，纱布过滤悬液。必须注意每次吹吸一般6—7次为宜 ，太多则细胞受损，消化时间要灵活掌握，不足细胞不易掊落，太久则细胞破碎。 在消化过程中，摇动时组织不易下沉即立即停止，消化后如组织粘连如涕，证明消化过度。 二、 细胞计数： 取细胞悬液0.1（100ul）置盛有0.9ml10.4%台盼蓝的试管中混合,用血球计数板计数。 计算方法： 4大方格细胞数 每ml细胞数=——————————————X10（5） 4 5中格细胞数 或每ml细胞数=——————————X10（4） 三：接种 以营养液配成每ml10（6）细胞（最终稀释度）接种链霉素瓶（1ml）、60ml瓶（8—10ml），100mm dish（10ml），60mm dish（4ml），37度孵育48小进后形成单层，接种病毒或作次代培养。 四、CEF单层可供作病毒TCID50\LD50等指数的测定,空斑计数\病毒中和试验等. ①取胚　取13d龄spf鸭胚，无菌取出胚体,去除头、翅、爪和内脏，PBS冲洗2-3次以去除残留血液及胚液。 ②剪切　用剪刀将胚体充分剪碎为0.5-1mm3的小块,再用注射器将团块吹打均匀，用10倍体积的PBS液洗涤1~2次至悬液清亮。 ③消化　加入5倍体积的0.25%胰蛋白酶溶液，倒入玻璃珠充分混匀，消化5min，直至组织块边缘出现絮状物为止。　 ④中止　加入培养液中止消化，反复吹打细胞至匀浆，并用八层纱布过滤。 ⑤离心 900rpm离心10min，弃上清，用培养液将沉淀重悬 ⑥分瓶培养　稀释后按每瓶10ml装入细胞瓶中,置37℃恒温箱中静置培养