弓形虫黏膜疫苗研究进展

!生 旌3 卷笫6期 [nt J Med Paras／t Dis，Nov 2007．Vo1 34．No．6 弓形虫黏膜疫苗研究进展 管志玉 殷国荣 【摘要】 弓形虫主要通过自然感染途径经口感染，引起人和温血动物的弓形虫病。弓形虫可能是 世界上人类感染最普遍的寄生虫之一。弓形虫入侵宿主首先要通过黏膜组织的严密防御系统，即黏膜 免疫系统，这是机体抗感染的第一道免疫屏障，诱导黏膜免疫应答。在共同黏膜免疫系统(CMIS)的作 用下，全身多处黏膜相关淋巴组织(MALT)的免疫活性细胞被激活，黏膜部位产生大量的sIgA抗体，并 形成庞大的免疫应答网络，发挥抗虫效应。该文将就近几年来弓形虫抗原诱导的黏膜免疫和黏膜疫苗 的研究进行综述。 【关键词】 弓形虫；黏膜免疫；黏膜疫苗 Research advance on mucosal vaccine for Toxoplasma gondii GUAN Zhi—yu，YIN Guo—rong． Department of Parasitology，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China Cor~sponding author：YIN Guo—rong，guorongyin@163．con 【Abstract】 Toxoplasma gondii，an intracellular parasitic protozoa，infects the host through the oral route causing toxoplasmosis of human and wai211．blooded animals．Toxoplasma infection iS perhaps one of the most prevalent parasitic infection of mankind in the world．While Toxoplasma gondii invades the host．it must pass the defense system of mucosal tissue，which is the first immunologic barrier against potentially infective pathogens，inducing the mucosal immune response．Under the reactions of common mucosal immune system， the immunologically competent cells of mucosal—associated lymphoid tissue are activated，the high level of sIgA antibody is produced in mucosal tissue，a complex network of immune response produces a marked effect of re- sistance to gondii infection．This paper reviews the recent studies on the mucosal immunity and mucosal vac— cine for Toxoplasma gondii infection． 【Key words】 Toxoplasma gondii；Mucosal immunity；Mucosal vaccine 刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种人群和动 物感染率极高的专性细胞内寄生原虫，呈世界性分 布，估计全世界至少有 1／3的人感染 ¨。弓形虫病给 人类健康和畜牧业带来了严重的损失，由于药物的不 良反应和迅速产生的抗性，本病的治疗十分困难，疫 苗免疫是以极其低廉代价控制本病的有效策略 ]。 1 黏膜免疫应答的基础 黏膜是机体最大的门户和抵御病原生物感染的 首道防线，包括弓形虫在内的95％以上的病原感染 都是从黏膜入侵开始。黏膜组织广泛覆盖于呼吸道、 消化道，泌尿生殖道及眼结膜、内耳和所有的内分泌 腺体。黏膜组织具有强大的机械和化学清除功能，可 以降解和清除大多数的外来物质。更重要的是，黏膜 组织存在大量高度特化的先天和后天免疫系统，能有 效地保护黏膜面和机体内部免受外来病原体的侵 害。在健康成人，此黏膜免疫系统拥有的免疫细胞占 基金项 目：国家 自然科学基金 (No．30640057)；山西自然科学基金 (No．20041105)；山西省高校科技研究开发重点项目(No．20041238) 作者单位：030001太原，山西医科大学医学寄生虫学研究所、寄生虫 学教研室 通讯作者：殷国荣，Tel：0351—4135772，E-mail：guorongyin@163． · 3l1· · 综 述 · 全身的80％。这些免疫细胞或集中或散在于全身各 个黏膜相关淋巴组织(mucosal associated lymphoid tis． sue，MALT)，包括诱导黏膜免疫的肠相关淋巴组织 (gut—associated lymphoid tissue，GALT)的派伊尔集结 (Peyerg patches，PP)和鼻相关淋巴组织(nasal—associ— ated lymphoid tissue，NALT)，以及发挥效应的肠上皮 内淋 巴细 胞 (intestinal intraepithelial lymphocytes， iIEL)和鼻腔(nasal cavity，NC)等，它们共同构成了 全身最大的淋巴系统——共同黏膜免疫系统(con— non mucosal immune system，CMIS)。 CMIS在黏膜免疫中发挥极其重要的作用，是研 制黏膜疫苗的基础。当外来抗原入侵机体时，宿主发 动CMIS作用于抗原，使抗原暴露在含有大量免疫活 性细胞的诱导部位，并激活抗原特异性的B、T细胞， 这些激活的B、T细胞从诱导部位迁出，经过血循环或 淋巴循环归巢到远处的效应部位，在呼吸道、胃肠道、 生殖道黏膜及唾液腺等黏膜效应部位引起相关的免 疫应答。同时，IgG抗体形成细胞主要进入血循环归 巢至系统淋巴结或组织的炎症部位，而IgA抗体形成 细胞归巢至黏膜部位，发挥抗虫作用 』。 2 弓形虫复合抗原的免疫保护作用 疫苗免疫防治疾病是人类最伟大的医学成就之 维普资讯 http://www.cqvip.com 2007年 11月第34卷第 6期 Int J Med Parasit Dis，Nov 2007 yo】． ： 一 。 早在10世纪，中国就利用天花幸存患者的结痂， 碾末调水后点入健康人的鼻孔来预防天花。此后，用 这种复合抗原消灭了天花，这是人类通过自身的努力 彻底消灭的惟一传染病。这可视为黏膜免疫研究的 开端。 280多年的疫苗免疫理论与实践表明，抗原是 疫苗免疫效应的关键，复合抗原优于单一抗原。然 而，寄生虫作为动物，其抗原具有复杂性和多源性及 株、期特异性，任何单一抗原只有该虫的部分免疫原 性，复合抗原才可能具有该虫的全部免疫原性。这 或许是目前尚无有效的寄生虫疫苗的真正原因。目 前，研究最多的弓形虫候选抗原 SAG1虽具有较强 的免疫原性，但单独使用只产生部分免疫保护。以 弓形虫 SAG2和 SAG1联 合 免疫 、用 GRA2、 GRA6、SAG1单克隆抗体中的任何两个同时免疫，小 鼠存活期比单独应用明显延长 J。但是，上述类似 的抗原免疫只能延长小鼠寿命 3～5 d J，并不能 预防或阻止弓形虫感染。 毋庸置疑，复合抗原具有很高的免疫原性。目 前，对弓形虫复合抗原的研究仅限于两种抗原的联 合，缺乏对弓形虫可溶性速殖子抗原(STAg)和排泄 分泌抗原(excreted．secreted antigens，ESA)等复合抗 原免疫原性的研究。鉴于此，2000年以来，作者课 题组致力于弓形虫感染与黏膜免疫的研究，特别是 对包含STAg、ESA和SOAg的弓形虫复合抗原鼻内 免疫诱导的黏膜免疫方面取得新进展：STAg滴鼻免 疫小鼠可诱导有效的黏膜及系统免疫应答，其最佳 剂量为20 g ，两次免疫间隔以14 d效果最佳 J。 采用 STAg联合 一干扰素(IFN一 ) 或霍乱毒素 (cholera toxinc，CT)¨ 或 CpG基序(CpG ODN)¨ 制备的弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫，可有效地抵 抗弓形虫经 [J感染。 3 黏膜疫苗 对于经黏膜入侵的病原体来说，肌肉或皮肤接 种免疫只能在疾病发生前解除感染，而黏膜接种可 通过激活机体黏膜和系统免疫应答，阻止病原生物 的入侵。由于黏膜接种合乎疫苗的原位免疫设计， 即在感染的起始阶段进行预防而倍受关注 ¨。 已注册的脊髓灰质炎、减毒沙门氏菌和霍乱弧 菌疫苗均为人类 口服黏膜疫苗l J，脊髓灰质炎是人 类使用黏膜疫苗拟在近期 (WHO的 目标 为 2005 年)消灭的第二种传染病。2003年，WHO决定优先 发展的肺炎球菌、B型流感嗜血菌、轮状病毒、乙型 肝炎疫苗也主要是通过黏膜免疫。 鼻腔免疫是一种更具发展前景的非侵人性疫苗 接种途径 ¨。与其他黏膜免疫途径相比，鼻腔免疫 能更有效诱导更早更强的黏膜免疫应答。鼻相关淋 巴组织及其引流淋巴结，能保持更长时间的免疫记 忆 。Jiang等证实滴鼻较口服免疫诱导的粪便 slgA抗体水平高 ¨。事实上，对于某些不经黏膜表 面侵入的感染也可用黏膜疫苗来预防。 首种人用的滴鼻黏膜疫苗一流感病毒疫苗 (cold．adapted influenza virus，CAIV)已进入临床试 验 引¨。英国科学家(2004)研制出一种新的抗 SARS 吸人疫苗，经非洲绿猴鼻黏膜免疫证实免疫效果非 常理想，免疫后28 d可完全抵抗 SARS攻击 ¨。E 型肝炎病毒黏膜疫苗可诱导很强的系统免疫和黏膜 IgA，而且这种免疫无需任何佐剂，其滴鼻免疫非常 有效，所需抗原量少于El服 ¨。出血性败血病鼻雾 剂活疫苗已在150万动物使用，免疫牛l2个月后仍 可完全抗攻击 ¨。Valosky等u 证实(2005)，呼吸 道合胞体病毒活疫苗鼻内免疫可有效诱导记忆 B 细胞并产生 IFN一 。 4 弓形虫黏膜疫苗 目前，绝大多数黏膜疫苗的递送是模仿天然黏 膜感应部位与环境抗原和病原体相遇的方式。为了 更好的体现疫苗的经济性、高效性、安全性，并结合 弓形虫感染宿主的自然途径，诱导抗弓形虫保护性 免疫的最佳途径是直接将弓形虫候选疫苗抗原接种 到黏膜表面。大量研究显示，通过黏膜表面接种疫 苗既可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答，同 时还可诱导黏膜部位的黏膜免疫应答 J。由于 CMIS的存在，在某一黏膜位点的接种可诱导全身的 黏膜免疫反应，因而口腔、鼻腔、直肠以及生殖道均 可作为黏膜免疫的途径。 4．1 弓形虫口服疫苗 弓形虫自然感染部位是肠黏膜表面，因此自然感 染弓形虫后获得的保护性免疫指出了研制刺激胃肠 道黏膜防御疫苗的重要性。目前，国内外关于弓形虫 口服疫苗的研究已取得可喜进展，其中包括全虫抗 原、ESA，单／多价分子疫苗及基因疫苗等。 Bourguin等 研究发现，弓形虫速殖子超声裂 解物(TSo)联合CT经口免疫 C57BIM6小鼠提高保 护性，并诱导细胞免疫应答，TSo组存活率3．7％， TSo+CT组为50％，攻击感染2个月后，TSo+CT组 脑内包囊数明显减少，脾T细胞增生明显。 Hafid等 将 RH株弓形虫 ESA单独或联合 CT经口免疫 OF．1小鼠，动态检测粪便和血清中的 维普资讯 http://www.cqvip.com 7年 11月第34卷第 6期 Int JMed ParasitDis．Nov 2oo7．Vo1．34．N0．6 IgA、IgG和 IgM。于初次免疫后第 4天和第 12天， CT+和 CT一组分别在粪便中检测到IgA，并且一直持 续到第49天；从第 12天到第 41天可在 CT+组中 连续检测到粪便IgG，而cT一组仅在第12天可检测 到粪便IgG；但未检测到IgM。分析血清抗体发现， cT+组仅在第27、41、49天可检测到IgA；第4和第 12天在 cT+组分别检测到 IgM和 IgG，在cT一组 从第27天起才检测到。这些结果表明经口免疫小 鼠的ESA有良好的免疫原性，可能成为弓形虫口服 候选疫苗。 李文姝等 研究表明，弓形虫 P30乳酸球菌疫 苗口服免疫小鼠可诱导体液和细胞免疫反应，并对 弓形虫感染有部分保护力，免疫组检测到高水平的 特异性抗体，并诱导产生了偏向Thl型的免疫反应 (抗体亚类IgG2a的生成量稍高于IgG1)，脾淋巴细 胞经伴刀豆球蛋白(ConA)刺激后增殖能力比对照 组显著提高，说明P30乳酸球菌口服疫苗能有效地 激发小鼠细胞免疫应答。 M6v61ec等 对大肠杆菌谷胱甘肽一S．转移酶融 合蛋白表达的弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的抗原性 和免疫原性进行了研究，发现 GRA4联合 CT口服 免疫 C57BL／6小鼠诱导血清产生明显抗 GRA4 IgG，但肠道分泌的抗 IgG很少，经口感染弓形虫后 提供部分保护力，提示重组 GRA4是潜在候选弓形 虫口服疫苗之一。 丛华等 构建弓形虫主要表面抗原 SAG1、 SAG2复合基因真核表达质粒，并将其转入减毒鼠伤 寒沙门氏菌 BRD509株，即 BRD509／pSAG1／SAG2，经 口免疫 BALB／c小鼠后 IgG水平明显提高，而且受攻 击的免疫鼠平均存活时间比对照组延长 5 d，说明口 服弓形虫DNA混合疫苗可诱导小鼠产生保护性免 疫。同时，他们对此口服基因疫苗偶联 CT A2／B亚 单位基因佐剂的免疫效果进行研究，结果显示抗原特 异性 T细胞增殖反应和细胞毒性 T淋巴细胞(cytoly— tic T lymphocyte，CTL)的活性明显增强，攻击感染后 小鼠存活时间较不加佐剂组明显延长 -- 4．2 弓形虫鼻疫苗 虽然宿主存在共同黏膜系统，但不同黏膜部位的 免疫效应却有很大差异。如经口服或肠腔内途径接 种疫苗，在胃肠黏膜有很强的免疫应答出现，而其他 部位如上、下呼吸道、泌尿生殖道却无明显的免疫应 答。而鼻腔内免疫后除了在上呼吸道有强免疫应答 出现，在下呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道也有明显的免 疫应答，并且可以显著减少免疫原的剂量。这说明鼻 内免疫可能是一种更有效、更安全的免疫途径心 。 Stanley等 用胶囊化效率达80％的技术手 段，用聚乳酸乙醇酸共聚物(poly D，L．1actide．CO．gly． colide，PLG)包裹弓形虫速殖子粗提取蛋白制成微 粒，并联合 cT滴鼻免疫羊，结果显示，用颗粒性弓 形虫抗原免疫羊的局部和全身产生高水平的抗原特 异性抗体，出现强烈的细胞免疫反应，IFN．^y相应增 高；尽管所有的动物最终未能抗弓形虫感染，但此研 究指出鼻内免疫是有效的接种途径。 殷国荣等 以 STAg联合 cT滴鼻免疫 BALB／c小鼠，肠 IEL发生增殖性免疫应答，且持续 较长时间；他们还证实，以STAg联合蜂胶和IFN．^y 鼻内免疫小鼠能有效诱导细胞免疫应答。该研究指 出，以STAg作为弓形虫滴鼻疫苗候选抗原有良好 的前景。 弓形虫主要表面抗原P30是一种很有效的保护 性抗原成分，大量研究已经证实其作为弓形虫滴鼻 疫苗候选抗原的可行性。以 P30分别联合 CT、 LTR72／LTR63及沙丁胺醇滴鼻免疫小鼠，受攻击感 染小鼠脑内包囊数明显少于对照组，提示对弓形虫 感染提供有效保护；同时联合CT或LT鼻内免疫能 诱导机体产生强烈的体液免疫应答及细胞增生反 应，血清IgG和肠液IgA显著升高 孙 。 此外，用弓形虫mRNA滴鼻免疫小鼠能诱导体 液和细胞免疫应答并对抗弓形虫感染提供一定的保 护，提示黏膜接种RNA也是可行的 。 5 结语 弓形虫经口感染机体后，在CMIS作用下，引起 强烈的黏膜免疫反应，多种免疫细胞和大量的 sIgA 抗体参与应答。因此，研制能刺激黏膜并诱导黏膜 免疫应答的疫苗成为了可能。目前，研究人员已经 利用动物模型对多种弓形虫滴鼻和口服候选疫苗进 行了研究 ，有些已被证实有一定保护力。深入研究 弓形虫抗原的保护性，制定更加详尽的黏膜疫苗策 略，以期获得安全、经济、有效的弓形虫黏膜疫苗成 为可能。 参 考 文 献 [1] Kasper L，Courret N，Darche S，et a1．Toxoplasma gondii and mucosal immunity．Int J Parasitol，2004，34(3)：401-409． [2] Bhopale 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