黄曲霉毒素检测方法的若干问题

黄曲霉毒素检测方法的若干问题 陈　南 (福建省测试技术研究所 ,福州 　350003) 摘 　要 :黄曲霉毒素 (AFB1 )为毒性极强的致癌物质 ,因其广泛分布于动物与植物等 的食品中而成为食品安全检测的重要问题。文章介绍了常用的三种黄曲霉毒素检测方 法 ,即薄层层析法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法。其中薄层层析法为最先被广泛使 用于黄曲霉毒素的检测 ,此法尽管简便易行 ,但特异性差 ,干扰多 ;高效液相色谱法操作简 单快捷 ,灵敏度高 ,但样品需净化 ,同时设备昂贵 ;酶联免疫吸附法前处理简单 ,灵敏度高 , 特异性强 ,安全性强 ,仪器设备较为简单 ,对目前检测 AFB1最为适用。 关键词 :黄曲霉毒素 B1 　薄层层析法 　高效液相色谱 　酶联免疫吸附法 1　前言 在食品卫生的污染因素中 ,生物毒素对食品的污 染是最重要的污染之一 ,而黄曲霉毒素则因其对人、畜 肝脏的剧烈损害而名列毒性之首。有资料记载 ,黄曲 霉毒素 B1的毒性是剧毒化学药品氰化钾的 10倍以上。 黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果、特别是花 生和核桃中。由于黄曲霉毒素的毒性大、污染广、难以 去毒 ,对人体危害极大 ,因此对其的检测显得十分重 要。 2　化学结构及其理化特性 黄曲霉毒素 (Aflatoxins)是生长在食物及饲料中的 黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株代谢的一组化学结构类 似的产物 ,目前已分离鉴定出的黄曲霉毒素有 17种 , 主要是黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2以及由 B1和 B2在体内 经过羟化而衍生成的代谢产物 M1、M2等。 2. 1　化学结构 黄曲霉毒素是一种杂环分子 ,具有二呋喃环和氧 杂萘邻酮 (香豆素 )的基本结构 , B1是二氢呋喃氧杂萘 邻酮的衍生物 (毒性及致癌性最强 ) ,含有一个双呋喃 环和一个氧杂萘邻酮 (香豆素 ) ;在天然污染的食品中 以 B1最为多见。 2. 2　理化特性 黄曲霉毒素纯品为无色结晶 ,其相对分子量为 312 - 346;难溶于水 ,易溶于油等中等极性的有机溶剂中 , 不溶于己烷、石油醚和乙醚。一般在中性溶液中较稳 定 ,易被碱或强氧化剂破坏 ;在强酸性溶液中稍有分 解。在紫外线 365nm波长下 ,黄曲霉毒素 B1、B2发蓝紫 色荧光 ,黄曲霉毒素 G1、G2发黄绿色荧光。黄曲霉毒素 耐高温 ,分解温度为 268℃,分子结合力稳定 ,紫外线对 低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。 黄曲霉毒素危害性大 ,世界上 70多个国家和地区 对食品中黄曲霉毒素的含量作了限量要求。总体来 说 ,欧美相关要严于我国国标 ,国外以此设置技术 性贸易措施 ,进而影响我国农产品的出口。 3　提取与净化 提取与净化就是将黄曲霉毒素从基质中提取出来 并尽量减少提取物中的干扰物质。提取在很大程度上 依赖于被检样品的物理化学性质 ,由于食品的性质不 同 ,不同的食品用不同的方法提取 ,目的是尽量提出毒 素并减少干扰。利用黄曲霉毒素能溶于中性极性溶剂 的特点 ,常用的提取溶液有三氯甲烷水溶液、甲醇水溶 液、丙酮水溶液等。黄曲霉毒素分析中的净化方法多 种多样 ,有液液分离、固相萃取 ( SPE)、免疫亲和柱、 TLC等。不同检测方法对净化程度的要求不一。免疫 学方法特异性高 ,对样品净化程度要求相对较低 ,一般 不需要复杂的净化过程 ;而薄层色谱法 ( TLC)以及高效 液相色谱法 (HPLC)对样品净化程度要求较高 ,一般在 提取后还需进一步对提取液进行净化。 4　检测方法 黄曲霉毒素 B1具有毒性大 ,致癌性强 ,样品含量低 等特点 ,这就要求检测方法灵敏度高 ,特异性强 ,集分 离与检测为一体。目前黄曲霉毒素 B1测定方法有薄层 层析法、液相色谱法和免疫学法。 4. 1　薄层层析法 薄层层析 ( Thin - Layer Chromatography, TLC)是在 黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术。自 1990 年 ,它被列为 AOAC (A ssociation of Official Agricultural Chem ists)标准方法 ,该方法同时具有定性和定量分析 黄曲霉毒素的功能 [ 1 ]。 TLC 法是用适宜的溶剂把 AFB1从样品中提取出来 ,经柱层析 ,再在薄层板上展开 层析、分离 ,利用 AFB1的荧光性 ,根据荧光斑点的强弱 与标准品比较测定其含量。 薄层层析法的优越性是对实验室仪器设备要求 低 ,一般的实验室即可实施 ,但此法操作繁琐、耗时、灵 9　2009年 12月 黄曲霉毒素检测方法的若干问题 　　　 敏度不高 ,进行目视定量时主观性影响较大。薄层层 析法是最先用于分析黄曲霉毒素的方法 ,但在发达国 家由于 HPLC方法的发展以及后来免疫学方法主要是 酶联免疫吸附分析 ( EL ISA)和荧光技术的发展 ,其使用 频率有所下降 ,但在发展中国家 ,仍被广泛使用。 4. 2　高效液相色谱法 随着高效液相色谱方法的发展 ,由于具有稳定准 确灵敏等优点 ,在黄曲霉毒素检测中的应用越来越广。 黄曲霉毒素测定的液相色谱法包含正相液相色谱法 (NPLC)和反相液相色谱法 ( RPLC) ,可使用紫外检测 器或荧光检测器 ,由于荧光检测器的灵敏度高于紫外 检测器 ,所以目前多使用荧光检测器。高效液相色谱 法操作简单快捷 ,灵敏度高 ,但样品需净化 ,同时设备 昂贵。 4. 3　免疫化学分析方法 免疫学方法是利用具有高度专一性的抗黄曲霉毒 素单克隆抗体或多克隆抗体的亲和性为基础 ,根据抗 体的特异性不同 ,检测一种或同时检测多种黄曲霉毒 素的免疫分析方法 ,是现在最常用的黄曲霉毒素检测 方法。这类方法通常包括放射免疫分析方法 (Radioim2 munoassay, R IA) ,酶联免疫法 ( Enzyme - linked of Immu2 nosorbent A ssay, EL ISA )和免疫层析法 ( Immunoaflinity Column A ssay, ICA) ,它们均可以对黄曲霉毒素进行定 量测定 ,现在最常用的是 EL ISA。 4. 3. 1　酶联免疫吸附法 : 酶联免疫吸附法 ( EL ISA )是六十年代出现的新免 疫测定技术 ,它把抗原抗体免疫反应和酶的高效催化 作用原理有机地结合起来。其原理是抗原 (或抗体 )吸 附于载体上的免疫吸附剂和用酶标记的抗体 (或抗原 ) 与样品中的待测物 (抗体或抗原 )起特异的免疫反应 , 然后加入酶底物进行显色反应 ,通过颜色深浅来判断 样品中待测物的含量 [ 2 ]。 酶联免疫法对 AFB1的最低检出浓度为 0. 01μg/ kg,比薄层分析法检测灵敏度高 500倍 ;而且 ,由于单克 隆抗体本身具备的强特异性 ,定量分析和定性分析等 于同时完成 ,所对呈阳性结果的样品不必再做确证试 验 ,检测结果准确稳定。其它荧光物质、色素、结构类 似物对检测无干扰 ,整个测定过程仅需 2小时 ,并且一 次可同时测定几十份样品。在样品提取时 ,也因此适 当简化了反复纯化、分离的步骤 ,适合处理批量样品。 此外 ,用酶免疫法检测法时 ,使用者对照标准抑制曲线 用数值插入法计算结果 ,可以避免因接触标准毒品受 到的伤害 ,显示出了方法简便易行 ,耗时少 ,特异性强 , 灵敏度高、安全的特点。 近年来 ,由于酶联免疫吸附法具有灵敏度高、特异 性强、安全性好、操作简便 (一般样品不用净化可加提 取液直接测定 )等特点 ,利用 EL ISA检测 AFB1越来越 普遍。 4. 3. 2　放射免疫法 放射免疫法特异性强 ,灵敏度高 ,比较准确快速 , 操作简单 ,易于标准化 ;但其需要特殊的设备和安全防 护的缺陷 ,妨碍了该方法的广泛应用。 4. 3. 3　一步式金标试纸法 金标免疫层析 ( Gold Labeled Immunochromatograph2 ic A ssay, GICA)是八十年代初发展起来的一种快速免 疫诊断技术。一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法是利 用单克隆抗体而的固相免疫分析法 ,快速检测试 纸利用纳米金作为标记物 ,可在 5—10分钟完成对样 品中黄曲霉毒素的定性测定。它不须进行结合标记物 与自由标记物的分离 ,省去了繁琐的加样、洗涤步骤 , 不仅提高了检测速度 ,而且检测过程中无需处理试剂 , 真正实现了一步式检测。借助黄曲霉毒素标准样品 , 该方法能估算黄曲霉毒素的含量 ,非常适用于现场测 试和进行大量样品的初选 [ 3 ]。 5　结束语 薄层层析法是常规法 ,一般实验室均可完成 ,但特 异性不强 ,易被其他荧光物质干扰 ,所以样品前处理繁 琐 ,要进行样品提取净化 ,分析时间长。 高效液相色谱法是一种操作简单快捷 ,灵敏度高 , 检测时间短 ,分辨率高的检测方法 ,而且可以对样品进 行定性、定量测定 ;但是仪器设备较昂贵 ,样品前处理 麻烦 ,需提取净化 ,技术要求较严谨。 酶联免疫法前处理简单 (提取后可直接测定 ,不需 要净化 ) ,分析时间短 ,灵敏度高 ,特异性强 ,准确度高 , 安全性强 ,一次可同时测定数十个样品 ,仪器设备较为 简单 ,是目前检测 AFB1最实用的方法。免疫亲和柱法 优点很多 ,但是只能测定黄曲霉毒素总量 ,而且必须使 用高纯水 ;同时 ,因检测费用过高无法普及。随着纳米 金技术的不断成熟 ,简单方便的一步式金标试纸法亦 会被广泛使用 ;该法已经被先进国家所广泛使用 ,引进 和消化这些先进的方法是我们检测领域的当务之急。 综合以上分析 ,酶联免疫吸附法是目前检测黄曲 霉毒素 B1最实用的方法。由于抗原抗体之间的特异性 反应 ,定性、定量分析同时完成 ,简化了反复纯化、分离 的前处理过程。所以酶联免疫吸附法检测黄曲霉毒素 是一个准确性高 ,安全性、实用性强的检测技术。 参考文献 [ 1 ] Official Methods Of Analysis 2000, 17 th, Ed. AOAC Int. Gaithersburg MD. Method 990. 33. [ 2 ]赵春城 ,赵晓联 ,蔡正森. 有机相萃取法消除 EL ISA 法检测 AFB1假阳性的研究. 饲料工业 [ J ]. 2003, 24 (3) : 40 - 43. [ 3 ] 黄惠明 ,徐群英 ,胡敏. 黄曲霉毒素检测方法研究 01 江 　西 　化 　工 2009年第 4期 　 的概述. 中国卫生检验杂志 [ J ]. 2001, 11 ( 4) : 510 - 512 In troduction the exper iences in the Afla lox in s testing Chen Nan ( Fu jian Institu te of Testing Technology, Fuzhou　350003 Abstract:Aflaloxins which has intensive poison and carcinogen is distributed extensively in animal and agricultural food p roducts. So it is an important p roblem for safely exam ination of food agricultural p roducts. In this paper, itmainly empha2 sizes three normal testing methods forAflaloxins. The thin - layer chromatography( TLC) is early used for testing Aflaloxins . A lthough its equipments are simp le but its operation mode is lower specificity and higher interference. H igh Pressure L iq2 uid Chromatography (HPLC) is more accurate and sensitive than conventional TLC but its equipments are very expensive. EL ISA has some advantages such as higher specificity, simp le, suitable, sensitivity and lower interference. Now the EL ISA is the most suitable testing method for Aflaloxins determ ination. Key W ords:AFB1 　TLC　HPLC　EL ISA 11　2009年 12月 黄曲霉毒素检测方法的若干问题