MTT该注意的细节!!

1．高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 2细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物？？ 3 MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效， 4 注意细胞悬液一定要混匀，细胞确保为单细胞，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。 5 枪头加入细胞时不要太快 6铺板技术是MTT实验的关键，也是基础，一定要练好 7 吸去MTT时试着将96孔板倾斜30度角，枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致。不要让枪头接触到孔底，且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平，这样也会使结晶脱落。,所以要在保证细胞不被吸掉的前提下，尽量把培养液吸掉。如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响， 8 DMSO后用振荡器轻轻振荡5－10min, 时间控制尽量严格一点,放置时间长了会影响结果,值会偏大,且结果不可信. 9震荡过程如果出现了气泡，应扎破气泡.有气泡存在时,由于其对光的反射与折射作用(酶标仪的原理是通过测定特定波长透过样品的吸光度推测样品内特定物质的浓度),会导致结果偏移. 10 如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很可能是细菌污染。 11复孔直接的OD值差别一般应在0.1－0.15，差别太大考虑 12贴壁时间：18－24h，如果不够，未悬浮的细胞会被吸掉。 13 一般为了实验的准确，每个浓度可以设5－6个复孔，可以最后统计时，可以除去一个最高值和一个最低值，或者除去其中数据离谱的值，这些离谱数字的出现与细胞是否污染，细胞是否在培养期间死去，是否培养液蒸发过多，加MTT液是否准确，在37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育时间是否一定（1－4小时）等有密切的关系，当然测定OD值的仪器工作状态是否正常也非常重要！(一般开机预热20min)。 14 MTT的吸收度在0.2～0.8之间误差较小。这和分析化学中的ｌａｍｂｅｒｔ-beer定律有关， 对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象（吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。 15在实验中若你测得某一个孔的数值偏高，虽然有很多因素会导致数值偏高，但是如果是板底的污点引起的话你可以消除。拿出96孔板擦一擦值偏大孔的板底部，再测值。你会发现孔高的值又会到正常水平。因为咱们做实验时手不可避免的接触96孔板板底留下痕迹，这些痕迹就会使吸光度升高。 16 加药过程中，吸去旧培养基时应特别小心，不能碰到底部，吸取时也不能太快，以免活细胞被吸走。 17 排枪使用之前应确保每个枪头都插紧，漏气的话则不能保证每个副孔之间加入的细胞数一致。