白芪龙胶囊的质量标准研究

第17卷第8期 2011年4月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae V01．17．No．8 Apr．。201I 白芪龙胶囊的质量研究 马睿，代龙’，孙明江，刘玉军 (山东中医药大学，济南 250355) [摘要】 目的：研究并建市白芪龙胶囊的质量控制方法。方法：采用薄层色谱法(TLC)对制剂中白花蛇舌草、天龙、黄芪、 茯苓等进行定性鉴别；采用高效液相色谱法(HPLC)对黄芪中的黄芪甲苷进行含星测定，并制定合理的含量限度。结果：TLC 法可专属地鉴别白花蛇舌草、天龙、黄蓖和茯苓，且特征斑点圆整清晰，阴性对照无干扰；含量测定结果显示，黄芪甲苷在 1．354—10．832斗g线性关系良好，r=0．9998(n=5)，平均加样回收率为99．59％(RSD1．25％，n=6)。结论：所建立的方法简 便可行，专属性高，重复性好，可有效控制白芪龙胶囊的质量。 [关键词] 白芪龙胶囊；质量标准；天龙；黄芪甲苷 [中图分类号]284．1[文献标识码]A [文章编号】 1005-9903(2011)08-0052-04 StudiesonQualityStandardofBaiqilongCapsules MARui，DAlLong’，SUNMing-jiang，LIUYu-jun (ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China) [Abstract]objective：TostudyandestablishthequalitycontrolmethodsforBaiqilongcapsules．Method： ThemethodofTLCwasusedtoidentifyHedyotisdiffusa，Gekkoswinhoana，RadixAstragaliandPoriaCOCOS．The contentofastragalosideIVwasdeterminedbyHPLC．Result：FourherbaldrugswerewellidentifiedbyTLC，the spotswereclear，roundandwithoutinterference．QuantitativeanalysisofHPLCshowedthatthelinearrangeof astragalosideIVwas1．354—10．832P,g．TheaveragerecoveryofastragalosideIVwas99．59％，andtheRSDwas 1．25％(n=6)．Conclusion：Themethodsetupissimpleandfeasible，andcouldeffectivelycontrolthequalityof Baiqilongcapsules． [Keywords]Baiqilongcapsules；qualitycontrol；Gekkoswinhoana；astragalosideIV 白芪龙胶囊系国家科技部“重大新药创制”科 技重大专项资助项目(2009ZX09103411)，由白花蛇 舌草、黄芪等5味中药经独特的仿牛酶解工艺及先 进的专利纯化技术加工而成，其中以白花蛇舌草、天 龙(壁虎)为君，法半夏和茯苓为臣，黄芪为佐，具有 [收稿日期】 【基金项目】 [第一作者] 【通讯作者] ·52· 20100830(003) 科技部“重大新药创制”科技重大专项 (2009ZX09103-411) 马睿，在渎硕十，从事中药制剂工艺及质量标准的 研究，Tel：0531-82960689．E·mail：maryl9870123@ sina．corn ‘代龙，教授，从事中药新药开发及新制剂技术的 研究，Tel：0531-82960689，E—mail：dailongdailong @263．net 清热解毒，散结消瘀，健脾化痰之功效，用于非小细 胞肺癌(NSCLC)、肝癌等多种恶性肿瘤的治疗，亦可 配合放疗、化疗及手术后辅助治疗，均取得了满意效 果。为有效控制产品质量，充分保证临床疗效，特对 制剂的质控标准进行了详细研究，采用TLC对白花 蛇舌草等4味进行了定性鉴别，采用HPLC对方中 黄苠甲苷进行了含量测定。 1仪器与试药 LC—IOA型高效液相色谱仪，包括Alltech 2000ESELSD检测器、CLASS．VP工作站(日本岛津 公司)；UVl100型紫外分光光度计(上海天美科学 仪器有限公司)；ABl35．S电子天平(瑞士梅特勒-托 利多公司)；KQ一250型超声波清洗器(昆山市超声仪 器有限公司)。 万方数据 马睿，等：白苠龙胶囊的质量标准研究 对照品及对照药材均购自中国药品乍物制品检 定所，白花蛇舌草对照药材(批号12l183．200402)， 茯苓对照药材(批号121117-200403)，亮氨酸对照 品(批号110876．200204)，甘氨酸对照品(批号 l10735—200102)，L一谷氨酸对照品(批号ll1576— 200201)，黄芪甲苷对照品(批号11078l-200613)； 白芪龙胶囊(批号20100301，20100302，20100401， 自制)；乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分 析纯。 2方法与结果 2．1 薄层鉴别‘u 2．1．1 白花蛇舌草 取本品内容物2g，研细，置索 氏提取器中，加石油醚(30～60℃)同流提取至提取 液近无色，药渣挥去残留石油醚，加甲醇30mL，超 声处理30rain，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mI。使 溶解，水液加盐酸调pHl一2，乙酸乙酯振摇提取2 次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，浓缩至1mL，作为 供试品溶液。另取白花蛇舌草对照药材2g，同法制 成对照药材溶液。再取阴性样品(缺白花蛇舌草的 样品)，按照供试品溶液的制备方法进行制备，即得 阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各l“L，分别点 于同一聚酰胺薄膜上，以36％乙酸为展开剂，展开， 取出，晾-f，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品 色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜 色的荧光斑点，阴性对照无干扰。 2．1．2天龙取本品内容物0．2g，研细，加稀乙醇 20mL，超声处理20min，滤过，滤液加盐酸20mL， 100℃加热回流lh，放冷。滤过，滤液蒸于，残渣加 甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取亮氨酸、 甘氨酸和谷氨酸对照品，加70％甲醇制成每lmL 各含0．5mg的混合溶液，作为对照品溶液。再取阴 性样品(缺天龙的样品)，按照供试品溶液的制备方 法进行制备，即得阴性对照溶液。吸取上述3种溶 液各lpL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁 醇．冰乙酸．水(4：l：1)为展开剂，二次展开，取出，晾 干，喷以茚三酮试液，加热至斑点显色清晰。供试品 色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色 的斑点，阴性对照无干扰。 2．1．3黄苠 取本品内容物4g，研细，加甲醇50 mL，超声处理20min，滤过，滤液蒸f，残渣加水20 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次 20mL，合并正丁醇液，用l％氧氧化钠溶液充分洗 涤2次，每次30mL，弃去碱液，正丁醇液蒸干，残渣 加水5mL使溶解，通过D101型大孑L树脂(内径为 1．5cm，柱高为10cm)，以水30mL洗脱，弃去水液， 再用40％乙醇30mL洗脱，弃去洗脱液，继片j70％ 乙醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄苠甲苷对照 品，加甲醇制成每lg·L“的溶液，作为对照品溶液。 再取阴性样品(缺黄苠的样品)，按照供试品溶液的 制备方法进行制备，即得阴性对照溶液。吸取上述 3种溶液各5“L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以 三氯甲烷一甲醇一水(13：7：2)的下层溶液(放置至搴 温)为展开剂，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液， 在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在 与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴 性对照无}二扰。 2．1．4茯苓 取本品内容物3g，研细，加乙醚50 mL，超声处理20min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取茯苓对照药材l g，同法制成埘照药材溶液。再取阴性样品(缺茯苓 的样品)，按照供试品溶液的制备方法进行制备，即 得阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各2斗L，分别 点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷一乙酸乙酯- 甲酸(10：1：0．2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外 光灯(365nm)下榆视。供试品色谱中，在与对照药 材色辩相应的位置t，显相同颜色的荧光斑点，阴性 对照无干扰。 2．2 含量测定 2．2．1 色谱条件“】 依利特ODS柱(4．6mm× 150mm，5仙m)，流动相乙腈一水(32：68)；ELSD检 测，放大系数2，漂移管温度101℃，载气(空气)流 量2．7L·rain～，流动相流速1．0mI．·min～，柱温30 ℃。理论板数按黄苠甲苷峰计算不低于4000。 2．2．2对照品溶液的制备 取黄芪甲件对照品 6．77mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻 度，摇匀，得黄芪甲苷对照品储备液。精密量取上述 对照品储备液4mI．，置10mL量瓶中，加甲醇溶解 并定容至刻度，摇匀，即得黄芪甲苷对照品溶液 (0．2708g·L一)。 2．2．3供试品溶液的制备取本品内容物，研细， 取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加f}j醇50 mL，称定质量，超声处理(功率300W，频率50kHz) 30min，放冷。再称定质量，用甲醇补足减失的质量， ．53· 万方数据 第17卷第8期 2011年4月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae V01．17．No．8 Apr．，2011 摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加水 20mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每 次30mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次， 每次40mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇 使溶解，并定量转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度， 摇匀，微孔滤膜(0．45¨m)滤过，取续滤液，即得。 2．2．4线性关系考察精密量取黄苠甲苷对照品 溶液(1．354g·L“)0．1，0．2。0．4，0．6，0．8mL于1 mL量瓶中，分别加甲醇稀释至刻度，得浓度为 0．1354，0．2708，0．5416，0．8124，1．0832 g·L一1 的对照品溶液，按照2．2．1色谱条件，分别迸样10 ¨L进行测定。以黄芪甲苷进样鼍的对数为横坐标 (x)，峰面积积分值的对数为纵坐标(y)，绘制标准 曲线，得回归方程Y=1．3147x+5．1929(r= 0．9998)。结果明，黄芪甲苷进样量在1．354— 10．832P,g线性关系良好。 2．2．5专属性试验取黄芪以外的其余药味，按照 制备工艺制成不含黄芪的空白制剂，然后按照供试 品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。按照2．2．1 色谱条件进行测定，进样量20斗L，结果在黄芪甲苷 对照品相同保留时间处无干扰峰，表明其余药味对 黄芪甲苷的测定无干扰，结果见图1。 2．2．6精密度试验精密吸取黄芪甲苷对照品溶 液(0．2708g·L“)，按照2．2．1色谱条件进行测定， 重复测定6次，进样量20“L。结果黄芪甲苷峰面积 积分值RSD1．02％(，l=6)，表明仪器精密度良好。 2．2．7稳定性试验 取上述供试品溶液(批号 20100301)分别于配制后的2，4，6，8，10，12h测定 黄苠甲苷峰面积，进样量20斗L。结果黄苠甲苷峰 面积积分值RSD0．75％(n=6)，表明供试品溶液在 12h内具有良好的稳定性。 2．2．8重复性试验取同一批次白芪龙胶囊(批号 20100301)内容物，共6份，分别按2．2．4方法制得 供试品溶液，照2．2．1色谱条件进行测定，进样量20 “L。结果制剂中黄苠甲苷的平均含量为0．162mg／ 粒，RSD1．51％(／'t=6)，表明本含量测定方法重复 性较理想。 2．2．9加样回收试验取已知含鼍的白芪龙胶囊 (批号20100301，黄苠甲苷含量0．162mg／粒)内容 物，约2g，共6份，精密称定，分别精密加入黄芪甲 苷对照品溶液(0．0426g·L“)25mL和甲醇各25 mL，称定质量，其余按2．2．3方法操作，制得供试品 ·54· 1 ^ ．一 J L 0 2 4 6 8 10 12 14 t／rain 图1 白芪龙胶囊HPLC A．对照品；B．供试品；C．阴性对照溶液；1．黄芪甲苷 溶液，照2．2．1色谱条件进行测定，进样量20¨L，计 算加样回收率，结果见表l。 表1黄芪甲苷加样回收试验(n=6) 2．2．10样品含量测定取3批样品分别制得供试 品溶液，分别精密吸取对照品溶液10，20肛L，供试 品溶液20斗L，注入液相色谱仪，按照2．2．1色谱条 件进行测定，每批样品测定3份，采用外标两点法对 数方程计算黄芪甲苷含量，结果见表2。 根据上述结果及药典中黄苠药材的黄芪甲苷含 量低限(≥0．04％)，确定本制剂的黄芪甲苷含量低 限为0．06mg／粒[200g药材×0．04％×70％(转移 万方数据 马睿，等：自芪龙胶囊的质星标准研究 率)／l000粒=0．056mg／粒]，3批制剂的含量均在 低限以上，表明所制定的黄芪甲苷含量限度(I>0．06 mg／粒)是合理的。 表2 白芪龙胶囊中黄芪甲苷测定(n=3) 3讨论 3．1 白花蛇舌草TI。c鉴别白花蛇舌草为方中君 药，文献报道其抗肿瘤成分主要为总黄酮和多糖类， 故制剂制备’[艺中对白花蛇舌草分别进行乙醇提取 和水煎煮提取。供试品溶液制备中，以黄酮作为定 性鉴别的目标成分，采用聚酰胺薄膜进行展开，分别 比较了36％乙酸、18％乙酸、甲醇-水(1：1)和氯仿． 甲醇(7：3)的展开效果，发现36％乙酸的分离效果 最佳，斑点晚l整，分离度好。 3．2薄层鉴别的耐用性试验考察了不同展开条 件：薄层板(自制、购买)、点样方式(手动点样、自动 点样仪)、展开温度(冰箱8℃、室温18～25oC)及展 开湿度(相对湿度20％，75％)对展开效果的影响， 发现不同薄层板、点样方式及展开湿度均不影响4 个定性鉴别目标成分的分离度，但是展开温度对黄 芪甲苷的分离度有一定影响，故文中限定展歼剂“放 置至窒温”后再行展开。 3．3指标成分的选择纵观全方，可定量控制的化 学成分较少，黄芪为方中要药，其中所含黄芪甲苷代 表性强，HPI。C测定条件成熟，对其进行含量测定对 于有效控制本品质量有一定参考价值。因此选择了 黄苠甲苷作为含量测定的指标成分。 3．4含链测定供试品溶液提取方法的优选根据 黄芪甲苷的性质，分别比较了甲醇超声提取和【口l流 提取的提取效果，发现2种提取方法相差不大，选择 了操作简便、提取杂质相对较少的超声提取法。超 声时间分别考察了10，20，30，40，50，60min，结果以 甲醇为提取溶剂，超卢处理30min的效果较好。 3．5含量测定色谱条件的优选参照文献方法，采 用HPI。C—E1．SD法测定制剂中黄苠甲苷的含量，对流 动相(乙腈：水)进行了不同比例的考察，发现当二 者比例为32：68时，色谱峰分离效果最佳，峰形对 称，可达基线分离，且阴性对照无干扰，故选择乙腈一 水(32：68)。 [参考文献] [1]常新伞，丁丽霞．中药活性成分手册[M]．北京：学 苑出版社，2002：699，1619．2042． [2]中国药典．一部[S]．2010：284，403，781． [3]李磊．李志军，周玉新，等．HPLC测定排氚片中黄苠甲 苷的含量[J]．中国实验方剂学杂志。2010，16(5)：37． [4]孙健，刘泓，范斌．HPLC—El。SD法测定祝艾康胶囊中黄 芪甲苷的含量[J]．中国实验方剂学杂志．2010，16 (4)：60． [责任编辑蔡仲德] ·55· 万方数据 白芪龙胶囊的质量标准研究 作者： 马睿， 代龙， 孙明江， 刘玉军， MA Rui， DAI Long， SUN Ming-jiang， LIU Yu-jun 作者单位： 山东中医药大学,济南,250355 刊名： 中国实验方剂学杂志 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF EXPERIMENTAL TRADITIONAL MEDICAL FORMULAE 年，卷(期)： 2011,17(8) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgsyfjxzz201108016.aspx