光合细菌对氯氰菊酯的降解作用

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 第 27 卷 　第 4 期 　2009 年 12 月 　 　 　 四川农业大学学报 Journal of Sichuan Agricultural University 　 　 Vol. 27 　No. 4 Dec. 2009 　　收稿日期 :2009 2 09 2 03 基金项目 :重庆市科委科技攻关计划项目课 (CSTC ,2007AC1052) 。 责任作者 :陈章宝 ( E2mail : xiczb86 @126. com) 光合细菌对氯氰菊酯的降解作用 郭冉冉 , 向少能 , 夏 　婷 , 陈章宝 (西南大学 药学院 , 重庆 北碚 　400716) 摘要 : 采用气相色谱法研究光合细菌对氯氰菊酯的降解作用。结果明 ,氯氰菊酯的浓度为 011μg/ mL 时 ,光合细 菌对其降解率在 8 h、18 h 和 36 h 时分别达到 6211 %、8314 %、9118 % ,液体中的氯氰菊酯被快速富集于光合细菌菌 体内 ;在 10 h 时 ,光合细菌体内氯氰菊酯含量最高达 01062μg/ mL 。随着光合细菌的生长代谢 ,菌体内的氯氰菊酯 逐渐被降解。30 h 时 ,菌体内的氯氰菊酯浓度降低至 01017μg/ mL ,120 h 后被完全降解消除。 关键词 : 气相色谱 ; 光合细菌 ; 氯氰菊酯 ; 降解 中图分类号 : O658 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 1000 - 2650 (2009) 04 - 0471 - 04 Effects of Photosynthesis Bacteria on Cypermethrin Degradation GUO Ra n2r a n , XIANG S ha o2ne ng , XIA Ting , CHEN Zha ng2b a o (College of Pharmaceutical Sciences , Southwest University , Beibei 400716 , Chongqing , China) Abstract : To st udy t he effect and mechanism of cypermet hrin degradation by p hotosynt hesis bac2 teria ( PSB) , gas chromatograp hy was used to determine t he degradation of cypermet hrin by PSB. The result s showed t hat the cypermet hrin was quickly degraded by PSB , and degradation rate was 6211 % , 8314 % , 9118 % after 8 h , 18 h , 36 h respectively , while initial concent ration of cyper2 met hrin was 011μg/ mL , and cypermethrin in environment was accumulated into PSB in vivo rap2 idly , and t he cypermet hrin concent ration of p hotosynt hesis bacteria in vivo was highest with 01062μg/ mL after 10 h. Wit h t he metabolism of PSB , cypermethrin concent ration decreased rap2 idly , and it s concent ration reached 01017μg/ mL af ter 30 h. Cypermethrin was completely degrad2 ed by PSB af ter 120 h. In conclusion , PSB can degrade cypermet hrin rapidly by it s metabolism. Key words : gas chromatograp hy ; p hotosynt hesis bacteria ; cypermet hrin ;degradation 　　农药伴随人类改造自然、利用自然已有了一百 多年历史[1 ] ,拟除虫菊酯类杀虫剂是农业中广泛使 用的一种高效、广谱、低残留农药 ,氯氰菊酯是拟除 虫菊酯类农药中重要的一种广谱杀虫剂 , 具有高 效、低毒和能生物降解等特性 ,不仅在植物保护中发 挥了巨大作用 ,在渔业生产上也被广泛用于毒杀池 塘中的有害生物 ,施用的氯氰菊酯部分残留、蓄积在 环境中 [224 ] ,通过食物链进入牛、羊、鱼、虾等生物体 内 ,甚至进入人体内 ,引起畜、禽或人中毒 ,中毒表现 为神经系统症状和皮肤刺激症状[4 ,5 ] 。残留在环境 中的氯氰菊酯不仅通过光化学、水化学被降解 ,同时 也受到微生物的降解[5 ] 。而与化学降解和光降解等 方式比较而言微生物降解具有高效、安全、无二次污 染、费用低等优点[6 ] , 所以 ,生物修复可用于降解、 去除拟除虫菊酯类农药残留 ,目前 ,对于筛选具有降 解氯氰菊酯类农药的研究报道较多[7 ] 。 光合细菌 ( Photosynt hetic Bacteria ,简称 PSB) 是地球上出现最早、自然界中普遍存在、具有原始光 能合成体系的原核生物[8 ] 。由于 PSB 具有独特的 新陈代谢方式 (固氮、脱氢、固碳、硫化物的氧化、光 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　　　 四川农业大学学报 第 27 卷 合生长) ,因而在农业、畜牧及水产养殖中广泛应用。 光合细菌在有机磷和拟除虫菊酯类农药降解方面研 究报道较多 ,但关于光合细菌降解拟除虫菊酯类农 药中的氯氰菊酯 ,特别是光合细菌降解拟除虫菊酯 类农药的机制 ,目前未见文献报道[8 ,9 ] ,因此本试验 拟对此进行研究。 1 　材料和方法 1 . 1 　光合细菌菌种 沼泽红假单胞菌 ,购自中国农业微生物菌种保 藏中心 (菌号 :ACCC 10649) 。 1 . 2 　氯氰菊酯 纯度 9910 % ,美国 Chem service 公司。 1 . 3 　光合细菌培养 1. 3. 1 　光合细菌培养液 氯化钠 014 g ,磷酸二氢钾 013 g ,氯化镁 012 g ,氯化铵 013 g ,氯化钙 0105 g ,碳酸氢钠 2 g ,无水 乙酸钠 1 g ,抗坏血酸 015 g ,酵母膏 015 g ,维生素 015 mL ,微量元素 015 mL ,纯化水加至 1000 mL 。 培养基于 121 ℃灭菌 15 min。 1. 3. 2 　光合细菌培养 光合细菌培养液接种光合细菌菌种 ,于 30 ℃, 1500 lx 光照培养。 1 . 4 　氯氰菊酯的降解试验 1. 4. 1 　试验分组 试验对照组 :按 1. 3 制备光合细菌培养液 ,培养 液中添加氯氰菊酯 ,使氯氰菊酯含量为 011μg/ mL 。 试验组 :在试验对照组里按培养液的 10 %接种光合 细菌菌种液。 1. 4. 2 　降解培养 试验对照组和试验组按 1. 3. 2 进行培养 ,并分 别于添加氯氰菊酯后第 0、2、4、6、8、10、12、18、24、 30、36、48、60、72、96 和 120 h ,取样 1 mL 测定培养 液中氯氰菊酯的残留浓度。 1. 4. 3 　样品前处理 由 1. 4. 2 采集的样品迅速于 10000 r/ min 离心 10 min ,分别取上清液和菌体沉淀。上清液中加入 5 mL 石油醚充分振荡 ,然后 10000 r/ min 离心 10 min ,取该上清液即为培养液的提取液。菌体沉淀 中加入 5 mL 石油醚进行超声波破壁 ,450 W 破壁 10 min ,然后 10000 r/ min 离心 10 min ,上清液即菌 体提取液。 1. 4. 4 　提取液的纯化 由 1. 4. 3 得到的培养液和菌体提取液通过净化 柱去除水分和杂质。净化柱底端装入脱脂棉 ,用湿 法装柱 ,从下至上依次加入 510 g 无水硫酸钠 ,310 g 氟罗里硅土 ,510 g 无水硫酸钠。用石油醚预淋洗 柱子 ,弃去淋洗液 ,待石油醚下降至无水硫酸钠层 时 ,迅速加入样品提取液过柱 ,分别用 3 倍体积的洗 脱液 (石油醚 ∶乙酸乙酯 ,9 ∶1)淋洗柱子 ,控制淋洗 速度为 60～80 滴/ min ,收集淋洗液 ,在 45 ℃水浴 下用旋转蒸发仪浓缩近干。残液用石油醚充分溶 解 ,定容至 1 mL ,即为氯氰菊酯残留样品。 1 . 5 　氯氰菊酯残留浓度检测 1. 5. 1 　气相色谱检测条件 SP23420 气象色谱仪 :配有 DM21 弹性石英毛 细管柱 (30 m ×0125μm ×0125μm) 和 ECD 检测 器。汽化室温度 :280 ℃,检测器温度 320 ℃,采用 程序升温 :200 ℃起温保持 1 min ,接着以 5 ℃/ min 升温至 285 ℃保持 2 min ,载气 99199 % N2 ,进样量 1μL 。以 99 %氯氰菊酯标样定性定量。 1. 5. 2 　氯氰菊酯曲线的绘制 将氯氰菊酯标准品用石油醚配制成 011μg/ mL 的溶液 ,再稀释成 0105、0101、01005、01001μg/ mL 的溶液 ,从低浓度到高浓度依次进样。以峰面积为 纵坐标 ,氯氰菊酯的标准浓度为横坐标绘制氯氰菊 酯的标准曲线[10 ] 。 1. 5. 3 　样品中氯氰菊酯残留量的检测 采用 1. 4. 4 处理好的样品 ,按照 1. 5. 1 的检测 条件 ,样品分别进样 1μL ,以保留时间定性峰面积 定量对氯氰菊酯的残留量进行检测。 1. 5. 4 　降解率的计算 降解率的计算方法 :降解率 ( %) = (1 - C1 / C0 ) ×100 C1 :光合细菌处理氯氰菊酯残留浓度 , C0 :对照 处理氯氰菊酯残留浓度 2 　结果与 2 . 1 氯氰菊酯的气相色谱图 按气相色谱检测条件检测氯氰菊酯的结果见图 1。由图 1 可见 ,氯氰菊酯的保留时间约为 8 min , 峰形正常 ,表明样品处理方法合理 ,重复性良好 ,色 谱条件适宜用于氯氰菊酯的检测。 2 . 2 　氯氰菊酯标准曲线的绘制 以峰面积为纵坐标 ,氯氰菊酯的标准浓度为横 坐标绘制氯氰菊酯的标准曲线 ,见图 2。其线性回 归方程 : y = 232285 x + 683815 , R2 = 019962。 274 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 第 4 期 郭冉冉 (等) : 光合细菌对氯氰菊酯的降解作用 　　　 图 1 　氯氰菊酯气相色谱检测结果 Figure 1 　The result of cypermethrin detection with gas chromatography 2 . 3 　光合细菌对氯氰菊酯的降解曲线 在液体培养液中 ,氯氰菊酯的浓度为 011μg/ mL ,光合细菌的接种量为 10 % ,试验组和对照组的 液体培养液中氯氰菊酯残留浓度结果见图 3。在 36 h 内 ,光合细菌对氯氰菊酯的降解率结果见图 4。 图 2 　氯氰菊酯的标准曲线 Figure 2 　Standard curve of cypermethrin 图 3 　氯氰菊酯残留量测定结果 Figure 3 　Detection results of cypermethrin residues 图 4 　氯氰菊酯降解率 Figure 4 　Degratation ratio of cypermethrin 从图 3、图 4 结果可知 ,对照组氯氰菊酯降解变 化比较缓慢 ,而试验组氯氰菊酯降解变化比较大 ,8 h 时试验组氯氰菊酯的降解率已达 6211 % ,随着时 间的延长降解率仍在不断上升 ,但是 18 h 时试验组 氯氰菊酯的降解率已达 8314 % ,之后氯氰菊酯降解 的变化比较平缓 ,而在 36 h 后降解率达到 9118 %。 2 . 4 　光合细菌菌体内氯氰菊酯残留浓度变化 氯氰菊酯在光合细菌菌株体内的浓度变化见图 5。光合细菌体内氯氰菊酯的含量变化与体外氯氰 菊酯的降解率相关 ,体外环境中的氯氰菊酯降解率 越高 ,光合细菌体内的氯氰菊酯含量越高 ,在 10 h 达到最大值 ;随着时间的延长 ,菌体内的氯氰菊酯含 量逐渐减少 ,在 120 h 后 ,已经检测不到氯氰菊酯。 光合细菌的延滞期为 6 h [11 ] ,本试验中光合细 菌对氯氰菊酯的降解在 6 h 后急剧上升 ,与光合细 374 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　　　 四川农业大学学报 第 27 卷 菌的生长曲线吻合。 图 5 　光合细菌菌株体内氯氰菊酯的浓度 Figure 5 　Cypermethrin concentration of photosynthesis bacteria in vivo 3 　讨 　论 拟除虫菊酯类农药现在被广泛应用于农业 ,由 此 ,也导致残留的农药不仅污染环境 ,也威胁人们的 健康[ 12214 ] 。因此 ,消除残留农药的污染一直受到极 大的重视 ,而采用微生物降解残留农药研究报道较 多 ,如丁海涛[15 ]等从活性污泥的富集培养物中分离 得到对氰戊菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解率分别 为 5318 %、4112 %和 6117 %的地衣芽孢杆菌菌株。 张松柏等[9 ]报道光合细菌对甲氰菊酯的最大耐受浓 度为 600 mg/ L ,培养 15 d 后 ,对 600 mg/ L 甲氰菊 酯的降解率为 35126 % ,杨韶斌等[ 16 ] 曾利用复合光 合细菌降解食用菌上的顺反氯氰菊酯。本试验研究 表明 ,添加浓度为 011μg/ mL 的氯氰菊酯在 36h 后 降解率达到 9118 % ,48 h 后完全降解 ,说明在液体 培养基中 ,光合细菌对氯氰菊酯有显著的降解能力 , 与文献[ 16 ]报道一致。 微生物降解农药的作用方式可以分为两大类 : 一类是微生物直接作用于农药 ,通过酶促反应降解 农药 ;另一类是通过微生物的活动改变了化学和物 理的环境而间接作用于农药[17 ] 。Maloney 等[18 ] 从 加 Tween 80 为 C 源的无机盐基础培养基中分离到 蜡状芽孢杆菌降解菌 ,并通过离子交换层析、凝胶过 滤层析等方法从该菌株中分离纯化了氯氰菊酯酶。 本试验结果表明光合细菌菌株体内的氯氰菊酯先增 加后减少 ,说明光合细菌对氯氰菊酯有短暂的富集 作用 ,并且随着时间的延长 ,光合细菌将菌株体内的 氯氰菊酯逐渐代谢 ,在 120 h 后完全消除 ,分析认为 光合细菌对氯氰菊酯的降解作用可能是由菌体内的 酶降解的。 目前我国在渔业中广泛使用氯氰菊酯用于杀灭 鱼、虾等水产动物体上的寄生虫 ,以及种植业中大量 使用的氯氰菊酯很大一部分汇集残留在水体中 ,造 成水环境的污染。因此 ,在水产养殖、农业种植中应 广泛推广使用光合细菌 ,不仅因其具有改良水质 ,促 进鱼、虾等水产动物生长 ,更因为光合细菌能有效降 解环境中的氯氰菊酯 ,减少甚至消除氯氰菊酯对环 境的污染。 参考文献 : [ 1 ] 　刘占山 , 刘爱中 , 黄安辉. 现代农药发展中的问题及应用前 景[J ] . 农药研究与应用 , 2008 , 12 (5) : 18221. 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