检测猪流行性腹泻病毒的RT—PCR方法的建立

· l0· Animal Husbandry& Veterinary Medicine 2004 Vo1．36 No．1 检测猪流行性腹泻病毒的 RT—PCR 方法的建立 倪艳秀，何孔旺，俞正玉， 郭蓉利，吕立新，陈兆霞 (江苏省农业科学院 农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室，江苏 南京 210014) 摘要：根据猪流行性腹泻病毒 (PEDV)的N基因自行设计和合成了一对呵扩增长度为641 bp目的片段的引物，成功地建立了检测的猪流行性腹 泻病毒的 RT．PCR方法。对猪轮状病毒 (PRV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)的 RT-PCR检测结果均呈阴性。对 PEDV JS株的 RT-PCR产物的 序列分析明，与CV777株的同源性为97．3％。 关键词：猪流行性腹泻病毒；RT．PCR；猪轮状病毒；猪传染性胃肠炎病毒 中图分类号：$858．28 文献标识码：A 文章编号：0529-5130(2004)Ol-0010433 Detection of porcine epidemic diarrhea virus by RT-PCR NI Yah—xiu， HE Kong—wang，YU Zheng—yu， GUO Rong—li，LU Li—xing，CHEN Zhao—xia (Key Lab of Animal& Poultry Diseases Diagnosis．Ministry of Ag6C Jiangsu Academy of Agfic Sciences，Nanjing 2 1 00 1 4，China) Abstract：A PCR assay for rapid and sensitive detection of porcine epidenlit‘diarrhea virus was developed． The PCR primers based on the N gene of porcine epidemic diarrhea virus could extend a 64 1 bp PCR produ~‘1． Using the same pairs．no PCR product was detected from por- eine rotavirus and transmissible gastroenteritis virus． The sequence homology of RT—PCR products of PEDV-JS strain and CV777 strain was 97．3％ ． Key words：po rcine epidemic diarrhea virus； RT-PCR；transmissible gastroenteritis virus；porcine rotavirus 猪流行性腹泻 (PED)是 由猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 引起的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪肠道传染病。 各种年龄的猪都易感，哺乳仔猪 、架子猪或育肥猪的发病率可 达 100％，尤其哺乳仔猪受害最严重。本病主要发生在冬季， 夏季也可发生。我国以 12月至次年 2月为高发季节。 PEDV比较常用的诊断方法是免疫电镜法、免疫荧光法 、 间接血凝试验、ELISA法。这些方法最主要的缺陷是难以检出 微量病毒，不适宜早期诊断。Ishikawa等⋯和 Kubota等 应 用 RT-PCR技术检测 PEDV，结果证实 RT．PCR是一种特异 、 敏感的 PEDV诊断方法。但国内迄今未见有类似报道。本试验 旨在建立 PEDV的 RT．PCR检测方法，为该病的诊断和流行病 学研究提供更为敏感和可靠的手段。 1 材料与方法 1．1 试剂 AMV逆转录酶为美国 Promega公司产品；Taq DNA聚合 酶为上海 Promega产品；RNA酶抑制剂 、DL．2000 DNA Marker 收稿 日期：2003 5．I7 作者简介：倪艳秀 (1970．)，女，助理研究员。硕士。 购自大连 Takara公司： 1．2 粪便标本的处理 PEDV、猪传染性 胃肠 炎病毒 (TGEV)和猪轮状病毒 (PRV)粪便毒用 PBS稀释成 10％ 一20％的悬液，7 O00r／min 离心 10 rain，取上清置 一20~C冻存备用。 1．3 RT-PCR 1．3．1 引物 按文献 3]上的 N基因序列 ，应用 Primer 5．0软件设计 了以下一对引物 ，上游引物 (P )：5 -etttatggcttctgtcag一3 ；下 游引物 (P2)：5 -ggtcatttgactggttcc-3 。其中 Pl与 PEDV N基因 的 32～49位核苷酸相同，P 与 N基因的 655～672位核苷酸 互补：引物扩增长度为 641 bp。引物由上海生工合成，用 TE 缓冲液将其稀释成 50 txmol／I ，一20~C冻存备用。 1．3．2 RNA的提取 采用异硫氰酸胍法。在 1．5 mI EP管 中，加入病 毒液 300 L。再加入变性液 300 L，充分摇动。加入 60 L乙酸 钠，混合。加入酚：氯仿：异戊醇660 txL，用力振荡 10 S，冰上 冷10 rain。4 12 000 r／rain离心 10 rain。小心吸取上层含有 RNA的水相。加 等体积异丙醇 ，一20℃至少作用 1 h以沉淀 维普资讯 http://www.cqvip.com 畜牧与兽医 2004年 第 36卷 第 1期 RNA。4~C12 000 r／min离心20 min。弃上清，加变性液300 I 重悬 RNA沉淀物，涡旋振荡直至 RNA完全溶解。加等体积异 丙醇，一20~C至少作用 1 h。4~C 12 000 r／min离心 20 rain。弃 上清，70％乙醇洗涤 RNA沉淀。干燥后加入 lO DEPC水重 悬 RNA沉淀。 1．3．3 逆转 录 在0．5 mL EP管 中依 次加 入 5×RT Buffer 4．0 L， 10 mmol／L dNTPs 2．0 L，50 m0L／L下游引物 (P2)1．0txL， 40 U／p~L RNA酶抑制剂 0．5 ，双蒸水 1．5 ，模板 RNA 10．0 L，10 U／p~L AMV逆转录酶 1 ，使总体积为20 。 瞬间离心后 ，于 PCR仪上按照下列程序进行逆转 录：30~C 10 min：42℃ 30 min：95℃ 5 min；5℃ 5 min。 1．3．4 PCR 在0．5 mL EP管中依次加入 l0×PCR Buffer 2．5 L，MgCI2 1．5 L，2．5 mmoVL dNTPs 1．0 L，50~moVL上、下游引物 各0．5 L，cDNA 2．5 L，5 U／p~L Taq DNA聚合酶 0．5 L． 双蒸水 16．0 I．tL，总体积为 25．0 。覆盖 25 L液体石蜡油 后，在 PCR扩增仪进行三温循环 ，即94℃变性1 min，50~C退 火 1 rain，72℃延伸 1 rain，30个循环后，72~C延伸 10 rain。 1．3．5 RT．PCR产物 的检测 采用常规的琼脂糖凝胶电泳法 ，胶浓度为 1．0％。 1．3．6 RT—PCR特异性试验 取 PEDV粪便毒和TGEV、PRV粪便毒，按上述方法进行 RT—PCR。 1．4 RT-PCR产物序列分析 PEDV—JS株的 RT—PCR产物经胶回收后，送大连 Takara公 司测序。并将所测的序列与 PEDV代表株——cV777株的序列 (GenBank登录号为 AF3535l 1)进行比较分析。 3 讨论 2 结果 2．1 RT-PCR特异性试验 对 PEDV粪便毒进行 RT—PCR能扩增出 641 bp的目的条 带。同时对 TGEV、PRV粪便毒进行 RT—PCR，未扩增 出任何 条带 (见图 1)。 2 Oo0 l Oo0 750 500 250 l00 M l 2 3 注：M：DL2000 Marker；l：PEDV粪便毒 2：TGEV粪便毒； 3：PRV粪便毒 图 1 RT-PCR的特异性试验结果 2．2 PEDV-JS株的 RT-PCR产物的序列分析 对 PEDV—JS株的 RT—PCR产物进行了一个反应的测序，共 测了608 bp。将测出的序列与国外 已发表的 CV777株的基因 序列 (GenBank登录号为 AF353511)相比，有 l7个核苷酸不 同，两者核苷酸的同源性为97．3％ (见图2)。 1 ccgcaaacgg gtgccallat c t田tatgc ccctcttagg gttactaatg acaa固CCCClllctaaggta cttgcaaaca 8 1 acgctgtacc cactaacaag gggaataagg accagcaaat tgg[~tactgg aatgagcaaa ttcgctggcg catgcgccgt 1 6 1 ggtgagcgaa ttgaacaacc ttccaattgg calltcta【【]l tcggaac agg tcac g日cga(．ctcc gttataggac 24 1 tcgtactgag ggtgttttct gggttgclaa agaaggcgca aagactgaac ccactaa园t gggtgtcaga aaggcgtctg 321 aaaagccaat c allccaaa回ttctctc agctg]c -ag日 gttgag attgttgaac ctaac cc tcctgcttca 40 1 cgtgcaaatt c[~gtagcag gagtc gg囡aatggc -aa曰aggtc g atctccaagt aac agag gcaat ∞ 48 1 gtcccgtggt aatt(~acaga atcgtggaaat aaccagggtc gtggagcttc tcagaacag aggaggcaat aataataaca 56 1 ataacaagt cgtaaccag tccaa囡a a ggaaccagtc aaatg 注：方框中为与CV777株比较的变异核苷酸 图 2 PEDV-JS株的 RT-PCR产物的测序结果 RT—PCR用于 PEDV的检测在国外已有先例，但国内目前 尚未见报道。本试验成功地建立了检测 PEDV的 RT．PCR方 法 ，可有效地检测 PEDV粪便毒。此外，本实验室已建立 了检 测猪轮状病毒 和猪传染性胃肠炎病毒 的 RT．PCR方法。目 前正在探索合适的条件 ．以便将 TGEV、PEDV及 PRV的引物 合在一起，建立用于 3种猪病毒性腹泻病毒鉴别诊断的三重 PCR方法。 维普资讯 http://www.cqvip.com · l2· Animal Husbandry& Veterinary Medicine 2004 Vo1．36 No．1 肉仔鸡生长过程中行为与产热的变化 任建军，高文婷，邱泽文，王靖宇 (大连医科大学实验动物中心，辽宁 大连 1 16072) 摘要：研究肉仔鸡成长过程中行为变化对产热量的影响，将2日龄肉仔鸡36只分为自由摄食、50％摄食和绝食3组进行观测。立位行为集中在 明期，特别是摄食30min前后，暗期几乎没有出现立体行为。2日龄时，每天约有700min是立位的，其后 ，随着 日龄的增加而减少。在自由采食 区，公雏比母雏摄食时间长。50％摄食区较 自由采食区的摄食时间少。在绝食区，随着 日龄的增加，公母的立位时间呈现减少倾向。21日龄之前 随着日龄的增加其摄食时间也增加 ，其后呈现相反倾向。产热 (HP，kJ／kg )与摄食时间有相同倾向。在21日龄前公雏的HP比母雏低，21日 龄后母雏比公雏低。l天中各个区的HP活动规律是摄食后 l h内最高 ，暗期降低；限制摄食量后，HP降低，明期和暗期的HP差也随之减小。 关键词：肉仔鸡；行为；产热量 中图分类号：$831．4 文献标识码：A 文章编号：0529-5l30(2004)01-0012-03 Effects of growth on behavior and heat production in broilers REN Jian-jun，GAO Wen—ting，QIU Ze—wen，WANG Jing—yu (Laboratory Animal Center，Dalian Medical Univ，Dalian 1 1 6027，China) Abstract：An experiment was carried out to investigate the behavior and heat production of broilers using 36 birds(1 8 male and 1 8 female birds，respectively)during 2nd—day—old to 54 day of age．The birds were offered with three feeding levels：ad libitum，50％ feeding and 0 g(fasting)．Standing behavior was exhibited in the light period，especially increased at the time 30 min before and after starting of feeding (8：00 and 16：00)，but it was rare in the dark period．Standing time was 700 min／d in the 2nd．day—old chicks and then decreased with the increase of age．Standing time in the ad libitum fed birds was longer in the males than in the females． In the 50％ feeding level，it was Ion— get in the females than in the males，but decreased during the fasting period in both the males and females with the increase of age．Eating time increased up to 21 day of age and then decreased with the increase of age．Similar result was found in case of heat production(HP)． HP in the males was lower than that of females up to 2 1 day of age and then a reverse phenomenon was found． In all the feeding levels．HP was higher in the light period rather than in the dark． Similarly．HP was higher during one hour before and after starting of feeding and on— off of lighting． The light—dark difference of HP decreased when reducing feeding levels． Key words：broilers；behavior；heat production 摄食、站立、休息行为是最基本的维持行为，Asahida和 Mimura(1972)将 4周龄前的幼雏在照明的 10 h内的摄食行 为所占的比例分为 3日龄占 33％；4日龄占42％；10日龄以 收稿日期：2003-06．12 作者简介：任建军 (1960．)，男，工程师，学士。 后占50％ ～60％。Newberry(1987)⋯通过对平养肉仔鸡的行 为调查 ，将肉仔鸡的行为分成了 l9种形态。Preston(1987) 报道7周龄的肉仔鸡每天的休息时间占75％，而采食占7％； 成鸡的休息时间占20％，摄食时间占40％，成长过程中肉鸡 行为模式发生变化。 肉仔鸡行为模式的变化影响能量分配，摄食量不仅和产热 参考文献： [2] Ishikawa K，Sekiguchi H，Ogino T，et a1． Direct and rapid detec． tion of porcine epidemic diarrhea virus by RT·PCR [J]．J Virol Method，1997，69： 191．195． Kubota S，Sasaki O，Okada N，et a1． Detection of porcine epidem— ic diarrhea virus using polymersae chain reaction and comparison of the nucleocapsid genes among strains of the virus[J]．J Vet Med Sci，1999，61(7)：827430． [3] [4] [5] Bridgen A，Duaae M，Tobler K，et a1．Sequence determination of the nucleocapsid protein gene of the porcine epidemic diarrhoea virus confirms that this virus is a coronavirus related to human coronavirus 229E and porcine transmissible gastroenteritis virus[J]．J Gen Vir- ol，1993，74(Pt 9)：1795．1804． 倪艳秀，林继煌，陆承平，等．逆转录．聚合酶链反应 (RT． PCR)检测轮状病毒 [J]．中国兽医学报，1998，18 (5)： 437-440． 李 军，林继煌，陆承平，等．RT．PCR检测猪传染性胃肠炎 病毒 [J]．中国兽医学报，2001，21(3)：246-248． 维普资讯 http://www.cqvip.com