健膝壮骨方对大鼠骨性关节炎软骨细胞凋亡及其调控基因P53、Bcl-2表达作用的影响_章建华

第 30 卷 第 11 期 2 0 1 2年 1 1 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 11 Nov． 2 0 1 2 省 级 项 目 平 台 中 华 中 医 药 2437 学 刊 健膝壮骨方对大鼠骨性关节炎软骨细胞凋亡及 其调控基因 P53、Bcl － 2 达作用的影响 章建华1，章权2，朱希3，王政光1，尹华3 (1．浙江中医药大学附属第一医院，杭州，浙江 310006;2．杭州市红十字会医院，杭州，浙江 310003; 3．浙江中医药大学药学院，杭州，浙江 310053) 摘 要:目的:明确健膝壮骨方对骨性关节炎模型大鼠的药效作用，初步探讨其治疗骨性关节炎的作用机理， 为将其研发为中药新药提供实验基础。方法:将 60 只大鼠随机分成正常组(A)10 只和手术组 50 只，将手术组造 成膝骨性关节炎模型。造模方法:采用改良 Hulth法制备大鼠膝骨性关节炎模型，并按随机数字法分为模型对照 组(B)、壮骨关节丸阳性对照组(C)、健膝壮骨方高剂量组(D)、健膝壮骨方中剂量组(E)、健膝壮骨方低剂量组 (F)5 组。于造模 7 天后，高、中、低剂量给药组每日灌服健膝壮骨方药液(按每 100g体重灌胃 2mL) ，剂量分别相 当于生药 8g、4g、2g;阳性对照组每日灌服壮骨关节丸水溶液(按每 100g体重灌胃 2mL) ，相当于成药 2 g;正常组 和模型组分别灌服等量生理盐水。分别在治疗后 1 个月和 2 个月处死一半动物，取股骨内侧髁软骨，检测各组软 骨细胞凋亡及其调控基因 P53、Bcl － 2 的表达情况。结果:健膝壮骨方高、中、低剂量组及壮骨关节丸阳性对照组 均在一定程度上转变了软骨细胞凋亡亢进的趋势，在下调 P53 过度表达及调高受抑制的 Bcl － 2 蛋白表达方面均 优于模型对照组，治疗组与阳性药物对照组之间有显著性差异(P ﹤ 0． 05)。结论:软骨细胞凋亡是导致骨性关 节炎发病的重要机制之一，健膝壮骨方能较好地转变软骨细胞凋亡亢进的趋势，这种作用可能与影响 P53、Bcl － 2 的表达有关，从而在一定程度上保护软骨细胞，对骨性关节炎的发生和发展有预防和延缓作用。 关键词:健膝壮骨方;膝骨性关节炎;软骨细胞凋亡;P53;Bcl － 2 中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1673 － 7717(2012)11 － 2437 － 03 Effect of Jianxi Zhuanggu Formula on Apoptosis of Cartilage Cells and Regulating Gene Expressions of P53 and Bcl － 2 in Rats with Knee Osteoarthritis ZHANG Jian-hua1，ZHANG Quan2，ZHU Xi3，WANG Zheng-guang1，YIN Hua3 (1． The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310006，Zhejiang，China; 2． The Red Cross Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310003，Zhejiang，China; 3． Pharmacy College，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310003 ，Zhejiang，China) 收稿日期:2012 － 06 － 27 基金项目:浙江省教育厅高校科研基金资助项目(20071135) 作者简介:章建华(1962 －) ，男，浙江绍兴人，教授，硕士研究生导师，学士，研究方向:中医骨伤科研、教学、临床及骨伤新药研发。 通讯作者:尹华(1965 －) ，女，湖北应城人，教授，博士研究生导师，学士，研究方向:中药分析、药效物质基础及中药新药研发。 Abstract:Objective:To clear the cure effect of Jianxi Zhuanggu formula on rats with knee osteoarthritis and explore the treatment mechanism． To provide experimental basis for the development of new drugs of TCM． Methods:60 rats were divided into normal group A(10 cases)and surgical group(50 cases)randomly． Rat knee osteoarthritis model was induced with the improved method of Hulth． Surgical method and the model rats were randomly divided into control group B， Zhuangguguanjie Pill positive control group C，high dose of Jianxi Zhuanggu group D，moderate dose of Jianxi Zhuanggu group E and low dose of Jianxi Zhuanggu group F． 7 days after modeling，rats in high，moderate and low dose of Jianxi Zhuanggu groups were given drugs respectively every day(2mL /100g weight) ，dosages was equal to 8g，4g，and 2g crude drugs respectively，while rats in positive control group were given Zhuangguguanjie pills(2mL /100g weight) ，dosage was equal to 2g crude drug． Normal group and the model group took equal amounts of saline solution filling respectively． Half rats were killed 1 and 2 months later． The cartilage of lateral femoral condyle was taken to measure apoptosis of cartilage cells and regulation of expressions of P53 and Bcl － 2． Results:Experiment group demonstrated the ability of Jianxi Zhuanggu formula and Zhuangguguanjie pills converted the apoptosis trend of the cartilage cells compared to other groups． It was superior to model group in down regulating the hyperexpression of gene P53 and turning up the suppressed Bcl － 2 expression． There was a significant difference(P ＜ 0． 05)． Conclusions:Cartilage apoptosis is one of the important patho- genesis of osteoarthritis． Janxi Zhuanggu formula can convert the apoptosis trend of the cartilage cells． This may be relat- ed to the influence of gene expressions of P53 and Bcl － 2 which protect cartilage cells to some extent and prevent devel- opment of osteoarthritis． 7342 第 30 卷 第 11 期 2 0 1 2年 1 1 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 11 Nov． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 2438 学 刊 Key words:Jianxi Zhuanggu formula;knee osteoarthritis;apoptosis of cartilage cells;P53;Bcl － 2 骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨退 行性病变和关节周围骨质增生为病理特征的慢性进行性骨 关节病，多见于中老年人，其中女性多于男性。患者主要表 现为关节疼痛、关节活动不灵活、僵硬等，给患者带来了极 大的痛苦，严重影响了患者的生活质量，随着我国人口老龄 化的发展，这一问日益突出。OA属中医“痹症”、“骨痹” 范畴。祖国医学对该病的最早记载见于《内经》。但由于 OA的病因和发病机制尚未阐明，其治疗往往只是治标，改 善症状，目前对 OA 仍缺乏特异性切实有效的治疗手段。 近年来，大量的临床报道显示中医药治疗 OA 的研究取得 了一定的进展。健膝壮骨方是依据中医药理论并结合多年 临床经验总结出的经验方，临床治疗早中期 OA 疗效确切、 安全可靠。为探讨其防治 OA 的作用机制，从微观的层面 探讨中医中药治疗骨关节病的作用机理，本文通过观察健 膝壮骨方调控基因 P53、Bcl － 2 表达蛋白的改变，揭示 0A 的发病机制和中药治疗 OA 的作用靶点，进而探索新的有 效治疗 OA的方法，通过动物实验研究揭示健膝壮骨方治 疗骨性关节炎的作用机制，证实该方治疗骨关节炎的有效 性，为今后的中药新药研发奠定基础。 1 材 料 1． 1 实验动物 健康 SD 大鼠(250 ± 25)g，60 只，雌雄各 半(浙江医学科学院实验动物中心提供) ，随机分成正常 组、模型对照组、壮骨关节丸阳性对照组、健膝壮骨方高、 中、低剂量给药组，每组各 10 只。 1． 2 实验药物 健膝壮骨方由生黄芪、狗脊、防己、威灵 仙、老鹳草、制草乌、牛膝、莪术等药材组成。其药物制备方 法为:取一定处方量的健膝壮骨方各味药材，以 10 倍量水 加热回流 1 h，提取 2 次，合并提取液，滤过，滤液于旋转蒸 发仪上 55℃浓缩至 2 g生药 /mL，供灌胃用。 壮骨关节丸，由三九医药股份有限公司生产(国药准 字 Z44023377) ，批号:080092。 1． 3 实验试剂 Rabbit Anti － P53 武汉博士德生物工程有 限公司(产品编号:BA0521) ;Rabbit Anti － BCL － 2 武汉博 士德生物工程有限公司(产品编号:BA0412) ;细胞凋亡检 测试剂盒(In Situ Cell Apoptodis Detection Kit I，POD)武汉 博士德生物工程有限公司(产品编号:MK1020)。 2 方 法 2． 1 造模、取材 所有动物适应性饲养 1周后，手术组统一 选取大鼠右侧后肢，行常规手术前准备，采用 3%戊巴比妥 钠腹腔注射麻醉(注射剂量:1． 5mL/kg) ，切断右侧膝关节前 后交叉韧带、内侧副韧带及摘除内侧半月板，并进行前抽屉 试验验证，充分止血，冲洗，逐层缝合。术后连续 3 天用 20 万单位的青霉素进行肌肉注射，每天 2 次，作抗炎治疗以防 止感染。于手术后 7天每日定时驱赶动物，强迫所有动物活 动后肢 1次，每次 30min。分别于造模 1 个月、2 个月后各处 死一半大鼠，取股骨内侧髁软骨，中性福尔马林固定。 2． 2 给药方法 于造模 7 天后，高、中、低剂量给药组每日 灌服健膝壮骨方药液(按每 100g体重灌胃 2mL) ，剂量分别 相当于生药的 8g、4g、2g;阳性对照组每日灌服壮骨关节丸 水溶液(按每 100g体重灌胃 2mL) ，相当于成药 2g;正常组 和模型组分别灌服等量生理盐水。 2． 3 指标检测 TUNEL 法检测细胞凋亡的表达，结果判 定:细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。 每张切片在 200 倍视野下计数 200 个以上细胞。细胞中阳 性的凋亡细胞数，换算成凋亡指数(AI) ，AI =视野内的阳 性细胞数 /视野内总的细胞数 × 100%，然后进行整理及统 计分析。 免疫组化染色检测软骨 P53、Bcl － 2 基因蛋白的表达: 切片软骨组织中的 Bcl － 2 阳性软骨细胞浆呈棕黄色染色; P53 阳性细胞核呈棕黄色染色。在 10 × 40 高倍视野下计 算总细胞数及 p53、Bcl － 2 阳性细胞数，取其平均值，求出 阳性细胞占单位面积总细胞数的百分率。 2． 4 统计学分析 各组数据所得结果用均数 ±差(珋x ± s)表示，数据处理采用 SPSS 17． 0 统计软件进行分析，多 组计量资料采用单因素方差分析，以 P﹤ 0． 05 为差异有统 计学意义。 3 结 果 3． 1 健膝壮骨方对 OA 大鼠软骨细胞凋亡的影响 见插 页Ⅲ图 1，表 1。 表 1 不同时间各组软骨细胞凋亡 指数(AI)比较(%，珋x ± s) 组别 1 个月 2 个月 正常组(A) 1． 54 ± 0． 37 3． 13 ± 0． 16 模型组(B) 15． 57 ± 1． 79* 20． 86 ± 1． 91* 壮骨关节丸对照组(C) 9． 02 ± 1． 48# 13． 20 ± 1． 42# 健膝壮骨方高剂量组(D) 8． 87 ± 1． 82# 9． 99 ± 1． 86# 健膝壮骨方中剂量组(E) 8． 62 ± 1． 33# 9． 44 ± 1． 01# 健膝壮骨方低剂量组(F) 9． 14 ± 0． 85# 10． 04 ± 0． 50# 注:与正常组比较，* P ＜ 0． 01，# P ＜ 0． 05;与模型组比较， # P ＜ 0． 01。 由图 1 可直观发现，正常组在 1 个月和 2 个月时，几乎 无凋亡细胞，模型组凋亡细胞的数量较同期其它组明显增 多;而壮骨关节组和健膝壮骨方(高、中、低剂量)组凋亡细 胞的数量较同期模型组明显减少。 细胞计数的结果见表 1，给药 1 个月和 2 个月后，正常 组与手术各组间细胞凋亡指数存在显著性差异(P ＜ 0. 01) ;模型对照组与壮骨关节丸阳性对照组、健膝壮骨方 高、中、低剂量组比较均存在显著性差异(P ＜ 0. 01) ;健膝 壮骨方高、中、低剂量之间比较均无显著性差异(P ＞ 0. 05)。但健膝壮骨方高、中、低剂量组与壮骨关节丸对照 组之间，在给药 1 个月后，无显著性差异(P ＞ 0． 05) ;而给 药 2 个月后，则较存在显著性差异(P ＜ 0． 05)。 3． 2 健膝壮骨方对 OA 大鼠软骨细胞凋亡基因 P53 表达 的影响 见插页Ⅳ图 2，表 2。 表 2 不同时间各组 P53 阳性表达率的比较(%，珋x ± s) 组别 1 个月 2 个月 正常组(A) 5． 73 ± 0． 25 6． 77 ± 0． 38 模型组(B) 11． 63 ± 0． 73* 14． 05 ± 0． 32* 壮骨关节丸对照组(C) 7． 71 ± 0． 81# 9． 61 ± 1． 03# 健膝壮骨方高剂量组(D) 7． 29 ± 0． 91# 7． 93 ± 0． 92# 健膝壮骨方中剂量组(E) 6． 96 ± 0． 54# 7． 65 ± 0． 89# 健膝壮骨方低剂量组(F) 7． 07 ± 0． 50# 8． 05 ± 0． 62# 注:与正常组比较，* P ＜ 0． 01，#P ＜ 0． 05;与模型组比较，#P ＜ 0． 01。 8342 第 30 卷 第 11 期 2 0 1 2年 1 1 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 11 Nov． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 2439 学 刊 由图 2 可知，正常组基因 P53 呈低表达状态，而模型组 则呈高表达状态，阳性细胞数量较同期其它各组明显增高。 给药后，4 组(壮骨关节丸对照组，健膝壮骨方高、中、低剂 量组)P35 均出现较低表达的现象，与同期的模型组有显著 差异。 由表 2 可知，给药 l个月与给药 2 个月后，正常组与手 术各组比较基因 P53 的表达情况存在显著性差异(P ＜ 0. 01) ;模型对照组与壮骨关节丸对照组、健膝壮骨方高、 中、低剂量组比较均存在显著性差异(P ＜ 0. 01) ;健膝壮 骨方高、中、低剂量组之间比较则无显著性差异(P ＞ 0. 05)。健膝壮骨方高、中、低剂量组与壮骨关节丸对照组 在给药 1 个后，无显著性差异(P ＞ 0． 05) ;而给药 2 个月 后，则存在显著性差异(P ＜ 0． 05)。 3． 3 健膝壮骨方对 OA大鼠软骨细胞凋亡基因 Bcl － 2 表 达的影响 见插页Ⅴ图 3、表 3。 表 3 不同时间各组 Bcl － 2 阳性表达率的比较(%，珋x ± s) 组别 1 个月 2 个月 正常组(A) 16． 32 ± 1． 14 16． 00 ± 1． 09 模型组(B) 8． 54 ± 0． 99* 6． 84 ± 1． 64* 壮骨关节丸对照组(C) 14． 83 ± 1． 25# 12． 38 ± 1． 00# 健膝壮骨方高剂量组(D) 15． 10 ± 1． 54# 13． 14 ± 1． 09# 健膝壮骨方中剂量组(E) 14． 87 ± 1． 18# 12． 99 ± 1． 18# 健膝壮骨方低剂量组(F) 14． 22 ± 0． 95# 12． 50 ± 0． 87# 注:与正常组比较，* P ＜ 0． 01，#P ＜ 0． 05，与模型组比较，#P ＜ 0． 01。 从图 3 可知，正常组基因 Bcl － 2 呈高表达状态，而模 型组则呈低表达状态，阳性细胞数量较同期其他各组明显 减少，给药后，4 组(壮骨关节丸组，健膝壮骨方高、中、低剂 量组)Bcl － 2 均出现较高表达的现象，与同期的模型组有 显著性差异。 由表 3 可知，给药 1 个月与给药 2 个月后，正常组与手 术各组间基因 Bcl － 2 表达情况存在显著性差异(P ＜ 0. 01) ;模型对照组与壮骨关节丸对照组、健膝壮骨方高、 中、低剂量组之间比较存在着显著性差异(P ＜ 0． 01) ;健 膝壮骨方高、中、低剂量组之间比较则无显著性差异(P ＞ 0． 05)。但健膝壮骨方高、中、低剂量组与壮骨关节丸对照 组在给药 1 个后，比较无显著性差异(P ＞ 0． 05) ;而给药 2 个月后，则存在显著性差异(P ＜ 0． 05)。 4 讨 论 中医学认为，骨性关节炎的基本病机是“本虚标实”， 即以肝肾亏虚为本，血瘀痰凝痹阻经络为标，正虚是本病发 生的内在因素，邪实则常为发病后的主要病机。治疗上主 要遵从中医“肾主骨”的思想，采用补益肝肾，温经散寒，祛 风通络的治法。近年来大量临床报道显示此类中药，如六 味地黄汤、补肾壮筋汤等能通过抑制 OA 软骨细胞凋亡从 而延缓 OA的进程［1 － 2］。本文中的健膝壮骨方以生黄芪、 狗脊为君药，具有补气益卫，补养肝肾，强壮筋骨之功效;防 己、威灵仙、老鹳草为臣药，有祛风通络，软坚祛湿的功效; 制草乌、莪术为佐药，有破血行气，温经止痛的功效;牛膝则 为使药，引血下行为膝部之引经药;诸药合用，共奏补肾通 络之效，用于肝肾不足、气血虚寒、风寒湿痹所致膝骨性关 节炎，临床治疗骨性关节炎疗效确切。 现代研究表明，骨关节炎发病中软骨破坏与软骨细胞 的过度凋亡有关［3］。细胞凋亡是涉及基因调控的复杂过 程，其相关基因大致分为促进基因和抑制基因，分别起促进 和抑制细胞凋亡的作用，且彼此之间有一定的相互联系。 促进细胞凋亡的基因包括:P53、Bax、c － myc、ced － 3． 4 等， 而抑制细胞凋亡的基因则包括:Bcl － 2、Fas 等。其中 P53 及 Bcl － 2 是目前公认的细胞凋亡调控因子，二者在细胞凋 亡过程中具有相互拮抗的作用［4］。人 P53 基因位于 17 号 染色体，在退变的关节软骨细胞中可见阳性表达［5］，它是 DNA修复和细胞周期的重要调节因子，可提供限制细胞生 长和导致细胞凋亡的关键信号。Bcl － 2 基因是在滤泡性淋 巴瘤细胞中染色体易位 t(14 ∶ 18)的断点上发现的一种原 癌基因，具有抑制细胞凋亡和延长细胞寿命的功能。Bcl － 2 的过量表达可抑制 Fas 介导的细胞凋亡。Erlacher 等［6］ 研究 OA病人及健康成人关节软骨中 Bcl － 2 的表达发现， OA病人 Bcl － 2mRNA表达水平较高，邻近软骨缺损区的软 骨细胞 Bcl － 2 蛋白也高表达。 本文的研究结果表明，同时期正常组与手术组比较均 存在显著性差异，提示手术组大鼠软骨细胞的确存在明显 的凋亡亢进，并随时间的推移有进一步发展的趋势，与其相 对应的调控基因 P53 亦则表达过度，而 Bcl － 2 蛋白的表 达并不活跃。但壮骨关节丸组和健膝壮骨方各剂量组的 各项指数在用药后的两个时期与模型组存在着显著性差 异，说明药物有抑制 OA 大鼠软骨细胞凋亡的作用，在抑 制 OA大鼠软骨细胞凋亡的同时对 P53 的过度表达同样 有良好的抑制作用，而对 Bcl － 2 的这种低表达状态则有 一定的上调作用。壮骨关节丸组和健膝壮骨方各剂量组 比较时发现，在给药 1 个月时，各组之间无显著差异;而给 药 2 个月后，健膝壮骨方各剂量组的疗效要优于壮骨关节 丸组，提示健膝壮骨方在治疗骨关节炎方面存在一定的优 越性。 本文发现健膝壮骨方能在一定程度上抑制 OA 软骨细 胞凋亡亢进的趋势，保护软骨细胞，预防和延缓骨关节炎发 展的作用，可能与影响 P53、Bcl － 2 的表达有关，但其确切 的机制有待进一步实验研究及临床探讨。 参考文献 ［1］ 舒谦，卿茂盛，曹亚飞，等．六味地黄汤含药血清对软骨细胞 增殖、凋亡影响的体外实验研究［ J］． 中国中医药科技， 2006，13(4) :217． ［2］ 潘浩，胡庆丰，李雄峰，等．补肾壮筋汤对兔早期实验性骨关 节炎软骨细胞凋亡及 PCNA表达的影响［ J］．中国中医骨伤 科杂志，2004，12(4) :16 － 20． ［3］ Hashimoto S，Ochs Rl，Rosen F，et al． Chondrocyte － derived ap- optotic bodies and Calcification of articular cartilage［J］． Proc Natl Acad Sci USA． 95(6) :3094 － 3099，1998． ［4］ Steller H． Mechanisms and genes of cellular suicide［J］． Sci- ence，1995，267:1445 － 1449． ［5］ Ookawa K，Tsuchida S，Adachi J，et al． Differentiation induced by RB expression and opoptosis induced by p53 expression in an os- teosarcoma cell line［J］． Oncogene，1997，14:1389 － 1396． ［6］ Pelletier J P，Jovanovic DV，L a scau2Com an V，etal． Selective inh ib ition of inducible nitric oxide syn tha sereduces progression of experimental osteoarthritis in vivo:possible link with the reduc- tion in chon － drocyte apoptosis and caspase 3 level1［J］． Arthri- tis Rheum，2000，43(6) :1290． 9342