砒霜对MRL_lpr自发性狼疮小_省略_间及血清抗ds_DNA水平的影响_王红

收稿日期:2012 － 09 － 22 基金项目:浙江省中医药科技计划项目(2010ZA090) ;温州市科技 计划项目(Y20100158) 作者简介:王红(1978 －) ，女，浙江绍兴人，副主任医师，博士研究 生，研究方向:风湿免疫专业。 IL － 1β水平明显低于病理模型组，有显著性差异。说明了 黄芪水蛭制剂有一定的抑制炎症反应的作用，延缓了肾脏 的进一步损伤。 综上所述，肾糖颗粒对糖尿病肾病大鼠有一定的肾保 护作用，可以延缓糖尿病肾病大鼠的肾损伤，其机制是通过 其益气活血通络之法而发挥了重要作用;通过抑制 C － IV、 FN的达，抑制了炎症反应，最终减少了细胞外基质 ECM 积聚，延缓了肾小球硬化和肾间质的纤维化。 参考文献 ［1］ 傅晓骏，张慧娥，胡焉凡，等．尿微量蛋白评价芪蛭合剂治疗 早期糖尿病肾病的疗效［J］．临床医学，2004，24(9) :47 － 48． ［2］ 刘玉莲，杨丛忠． 黄芪药理作用概述［J］．中国药业，2004，13 (10) :79． ［3］ 陈清江，杨丽，王辉，等．黄芪对人肾间质成纤维细胞增殖和 转化生长因子 － β1 表达的影响［J］． 郑州大学学报(医学 版) ，2005，40(5) :871 － 873． ［4］ National Kidney Foundation． Kidney Disease Outcome Quality Initiative． K /DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease:evaluation，classification，and stratification［J］． AmJ Kid- ney Dis，2002，39(2Suppl2) :S1 － 246． ［5］ Song RH，SingH AK，Leehey DJ． Decrease glomerular proteinase activity in the streptozotocin diabetic rat［J］． Am Nephrol，1999， 19(3) :441 － 444． ［6］ 秦爽，贺育兰，杨静，等．重组人生长激素对内毒素诱导人巨 噬细胞产生 TNF － α、IL － 1β含量的影响［J］．中国感染控制 杂志，2008，7(1) :9 － 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中没有发现在生理盐水组及亚砷酸组中有统计学差别。结论:砒霜(ATO)可降低 MRL /lpr 小鼠的死亡率，延长 其生存时间，同时可以使其外周血抗 ds － DNA抗体的表达水平降低。 关键词:砒霜;系统性红斑狼疮;生存时间;抗 ds － DNA 中图分类号:R285． 5 文献标志码:A 文章编号:1673 － 7717(2013)02 － 0308 － 03 Effects of Arsenic Trioxide on the Survival Time and Serum anti － ds －DNA Levels in MRL / lpr Lupus Mice WANG Hong1，XIE Qipeng2 (1． Department of Nephrology and Rheumatic Disease，The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，Zhejiang，China; 2． Lab Medicine，The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，Zhejiang，China) 803 第 31 卷 第 2 期 2 0 1 3 年 2 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 31 No． 2 Feb． 2 0 1 3 中 华 中 医 药 309 学 刊 Abstract:Objective:To investigate the effect of arsenic trioxide(ATO)on the survival time and serum anti － ds － DNA levels in MRL / lpr lupus mice． Methods:40 MRL / lpr mice(12 weeks old)and 40 C57 mice were equally divided to 2 groups randomly:control group(saline)and treatment group［arsenic trioxide 0． 4 mg /(kg·d) ］． These drugs were given by abdominal injection for 120 days． Then these mice were observed until the 210th day． The indexes such as mor- tality，the serum levels of anti － double stranded DNA antibody were detected by enzyme － linked immunosorbent assay (ELISA)． Results:By comparing the mortality，anti － double stranded DNA antibody of mice in both groups，we found that the mortality of MRL / lpr mice in treatment group(35%)was much lower than that in control group(65%) ，the mean OD value of serum anti － dsDNA antibody was lower in the ATO group(0． 9163 ± 0． 0667)than that in the control group (1. 7975 ± 0． 2631，P ＜ 0． 01) ，all the indexes of C57 mice had no significant difference between two groups． Conclusion: An adequate dose of arsenic trioxide can prolong the survival time of MRL / lpr lupus mice，reduce mortality，decrease the peripheral level of anti － dsDNA antibody expression． Key words:arsenic trioxide ;systemic lupus erythematosus ;survival time;anti － dsDNA 砒霜，其有效成分为亚砷酸(arsenic trioxide，ATO) ，在 我国用药历史悠久，中医常利用砒霜治疗某些皮肤病(如 梅毒等)、气喘病、风湿病、肿瘤等疾患。国外在 19 世纪也 有利用砷剂治疗肿瘤的尝试。1993 年我国学者首次采用 亚砷酸治疗急性粒细施性白血病(APL)取得满意疗效［1］， 此后一些研究［2 － 5］尝试着将亚砷酸应用于治疗狼疮鼠，并 取得了一定的成绩。本实验旨在探讨亚砷酸对 MRL /lpr自 发性狼疮小鼠的生存时间及血清抗 ds － DNA水平的影响。 1 材料与方法 1． 1 药物与试剂 亚砷酸(ATO ，美国 Sigma公司) ，小鼠 IgG(Southern Biotechnology Associates． Inc公司) ，羊抗小鼠 IgG － HRP(Serotec公司) ，鲑鱼精 DNA(美国 Sigma 公司) ， HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG(北京中山生物科技有限公 司) ，96 孔酶标板(Costar公司) ，酶标仪(芬兰雷勃公司)。 1． 2 实验动物 MRL /lpr自发性狼疮小鼠雌雄各半，至 12 周龄(发病期) ，体重 30 ～ 40 g，随机分为亚砷酸组(ATO 组)和生理盐水组(生理盐水 NS 组) ，每组 20 只。ATO 组 给予 ATO 0． 4 mg / (kg·d)溶于生理盐水，隔日腹腔注射， 治疗至 120 d 结束;生理盐水组给予等量生理盐水同时隔 日腹腔注射。C57 小鼠体重 18 ～ 20 g，也随机分为 ATO 组 和 NS 组，每组 20 只。MRL /lpr 自发性狼疮小鼠购自中国 科学院上海实验动物中心，C57 小鼠由温州医学院动物实 验中心提供，均饲养在温州医学院动物实验中心清洁级动 物房中。 1． 3 观察指标 小鼠生存时间的观察:每日观察小鼠的存 活情况，根据死亡数折算出小鼠的死亡率及生存时间。 1． 4 血清抗 ds － DNA 抗体水平的测定 在给药前记做第 0 d，于第 0 d在无菌条件下断尾取血约 150 μL，采用酶联 免疫吸附(enzyme － linked immunosordent assay ，EL ISA)方法，用于测定小鼠外周血血清抗 dsDNA 抗体。在 给药第 120 d即实验结束时第 120 d断尾取血进行抗 dsD- NA抗体测定。具体方法为:鲑鱼精 DNA 100 μL / 孔室温 预包被 10 h ，1 % BSA 300 μL / 孔室温封闭 10h ，血清 10 μL(按 1 ∶ 100 稀释) ，100 μL /孔，37 ℃孵育 60 min ，然后加 HRP －羊抗小鼠酶标二抗反应，37 ℃孵育 30 min，加底物 液显色 2 min 后，EL ISA Reader 在 492 nm 检测。血清 IgG 的测定采用 EL ISA 法:用兔抗小鼠 IgG 包被，每孔加标本 100 μL(按 1 ∶ 10 稀释) ，37 ℃孵育 30 min，洗涤后加羊抗小 鼠 IgG － HRP，每孔 100 μL(血清 1 ∶ 10 稀释) ，37 ℃孵育 30 min，洗涤后加底物显色，终止，比色。 1． 5 统计学方法 应用统计软件 SPSS 12． 0 进行统计分 析。两样本均数比较采用 t检验，资料用(珋x ± s)表示。以 P ＜ 0． 05 为差异有显著性。 2 结 果 2． 1 砒霜(亚砷酸 ATO)对 MRL /lpr 小鼠的生存时间的影 响 结果见图 1，亚砷酸组死亡 7 只(死亡率 35%) ，生理盐 水组死亡 13 只(死亡率 65%) ，两组有明显差别(P = 0. 0423)。 图 1 亚砷酸组和生理盐水组 MRL / lpr小鼠的生存时间比较 2． 2 砒霜(亚砷酸 ATO)对 MRL /lpr小鼠外周血抗 dsDNA 抗体的影响 在给药前及实验结束时(即给药第 0 d 及第 120 d) ，共留取血标本两次，采用酶联免疫吸附分析(en- zyme － linked immunoadsordent assay，ELISA)方法测定 MRL /lpr自发性狼疮小鼠外周血抗 dsDNA 抗体。结果显 示，给药第 120 d，亚砷酸(ATO)组血清中抗 dsDNA抗体的 OD值较给药第 0 d明显降低(P ＜ 0． 01) ，而生理盐水(NS) 组给药第 120 d明显高于给药第 0 d(P ＜ 0． 05) ，在统计学 上有显著性差异(表 1)。 现将表 1 中的统计数据绘制成条形图，见图 2，便于我 们直观的了解亚砷酸组及生理盐水组对 MRL /lpr小鼠外周 血血清抗 dsDNA抗体水平的 OD值的影响。 903 第 31 卷 第 2 期 2 0 1 3 年 2 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 31 No． 2 Feb． 2 0 1 3 中 华 中 医 药 310 学 刊 表 1 给药前后 MRL /lpr狼疮鼠血清抗 dsDNA 抗体水平的 OD值(珋x ± s) 组别 给药前 给药后 生理盐水组 1． 1853 ± 0． 4179 1． 7975 ± 0． 2631* 亚砷酸组 1． 1234 ± 0． 0563 0． 9163 ± 0． 0667＊＊ 注:与给药前相比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01。 图 2 给药前后 MRL / lpr 3 讨 论 MRL /lpr小鼠是常用的 SLE 动物模型之一，3 月龄发 病，出现抗 dsDNA抗体升高，表现与人类 SLE类似，常将其 作为探索 SLE新治疗方法的实验对象。 系统性红斑狼疮(SLE)是一种以大量的自身抗体产生 包括抗 ds － DNA抗体在内的、并引起多系统损伤为主要特 征的自身免疫性疾病［8 － 11］，具体发病机制不明，故治疗上 也很棘手。SLE的预后随着糖皮质激素和细胞毒类药物的 临床应用已有所改观，但 12%的病人仍发展成终末期肾病 (ESRD)［6］。传统中药由于缺乏现代医药学理论的证明阐 释，限制了其更为广泛的应用，但其与西药相比，具有不良 反应小，综合调理，价格低廉及使用安全等优点［7］，故人们 仍对其研究颇多。 目前关于砒霜(亚砷酸 ATO)治疗狼疮的研究在我 国刚刚起步，本研究组目前已进行的实验发现亚砷酸 (ATO)能缓解临床症状，改善肾脏病理，对 BXSB 小鼠 有免疫抑制作用［2 － 5］。至于亚砷酸的不良反应，张晓晖 等［12］报道砒霜治疗早幼粒细胞白血病 1 ～ 2 个疗程(10 mg /d × 28 d为 1 个疗程) ，其不良反应主要有恶心、呕 吐等消化道症状及血肝肾功能异常等，前者发生率为 8． 1%，后者为 5． 4%，停药后即可消失，认为亚砷酸的 不良反应较轻，并且是可恢复的。 本研究中以 MRL /lpr自发性狼疮小鼠为研究对象，随 机分为生理盐水组和亚砷酸组，隔日分别腹腔注射生理盐 水及亚砷酸(As2O3) ，疗程为 120 d，比较两组小鼠在生存 时间、抗 dsDNA 抗体水平上的差异;另设 C57 正常小鼠做 参照，观察亚砷酸的安全性。 从研究结果中可以看出，经亚砷酸治疗 120 d，再继续 观察至 210 d，亚砷酸组死亡 7 只(死亡率 35%) ，生理盐水 组死亡 13 只(死亡率 65%) ，两组有明显差别(P = 0． 0423) ，故认为亚砷酸可降低 MRL /lpr 小鼠的死亡率，延 长其生存时间，而对正常小鼠，无明显致死等毒副性作用。 故认为本研究中亚砷酸的剂量是安全的，而且是有效的。 抗 dsDNA抗体是 SLE重要的自身抗体之一，也是 SLE 活动的指标。目前认为，存在于体内的多种自身抗体如抗 dsDNA 抗体与狼疮的皮肤损害、狼疮性肾炎的发生、转归 及疾病的活动有较密切的关联［13］。本研究结果亦示 MRL /lpr小鼠经亚砷酸治疗 120 d 后，血清抗 dsDNA 抗体 水平比生理盐水组明显下降(P ＜ 0． 01) ，故认为亚砷酸能 抑制 MRL /lpr小鼠血清中抗 dsDNA抗体的产生，从而控制 狼疮的活动。 总之，根据本实验结果可以认为亚砷酸能缓解 MRL / lpr小鼠自身免疫反应，降低血清抗 ds － DNA 抗体，延缓疾 病进程，降低死亡率，延长生存时间，故认为该剂量的亚砷 酸治疗是有效的。从治疗安全性方面来看，C57 小鼠在一 般情况、死亡率、生存时间等上述指标中，两组比较无统计 学差异，故认为该剂量的亚砷酸治疗是安全的，为中药砒霜 治疗系统性红斑狼疮提供了可靠的实验依据。 但本实验并无研究亚砷酸降低抗 ds － DNA 抗体的机 制，也没有比较加大亚砷酸剂量及延长治疗时间是否会有 更快、更好的效果，还有待于本研究组成员下一步实验来进 一步观察。 参考文献 ［1］ 张鹏，王树叶，胡龙虎，等． 三氧化二砷治疗急性早幼粒细 胞白血病七年总结 242 例分析［J］． 中华血液学杂志， 2000，21(2) :67 － 70． ［2］ 朱小春，金晓冬，黄朝兴，等．三氧化二砷对 BXSB 自发狼疮 鼠血清自身抗体与肾小球免疫球蛋白沉着的影响［J］．中华 内科杂志，2001，40(11) :764 － 765． ［3］ 朱小春，张文辉，高申孟，等． 三氧化二砷对自发狼疮 BXSB 小鼠免疫系统的影响［J］．中华风湿病学杂志，2002，6(5) : 343 － 346． ［4］ 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