鸡马立克氏病胚胎免疫后淋巴器官免疫效果的观察

鸡马立克氏病胚胎免疫后淋巴器官免疫效果的观察 鸡马立克氏病胚胎免疫后淋巴器官免疫效 果的观察 中国兽医科技1995年第25卷第5期9 鸡马立克氏病胚胎免疫后淋巴器官免疫效果的观察 鲍恩东陈万芳步志高一——一 (南京农业大学动物医学院210095) 2r]-;’ . /’; 摘要用火鸡疤疹病毒(I-IVT)疫苗对孵化至18日龄的鸡胚进行胚胎免疫注射,免疫后出壳雏鸡淋巴脏器的组织 学和组织化擎显示,18日龄胚胎免疫鸡对淋巴器官的早期发育具有明显的免疫促进作用. 关键词鸡苎圭垒&鱼暨丝皇蕴坚垦器上覃弓知 自从本世纪6O年代鸡马立克氏病(MD)疫苗问世,尤其 是火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗的出现,对MD的防制取得了明 显的效果.目前,用HVT及其它类型的MD疫苗对鸡免疫,多 收稿日期1994…929 修改稿收到日期1995—03—11 在1日龄时接种.由于雏鸡在接种后1,2周才能产生有效的 免疫力,而且MD疫苗只能阻止肿瘤的发生,不能防止感染, 使免疫雏鸡在没有产生坚强免疫力的情况下,仍可受野外强 毒的侵袭而发生MD..若能使雏鸡提前产生有效的免疫力, 对减少因MD而引起的损失,将产生深远影响. 激素(CRF,41肽).这4种下丘脑释放激素中,GnRH与生殖 生理密切相关.,l989年Miyata叉报道了一种新的多肽激素 —— 脑下垂体腺苷酸活化酶活化多肽(PACAP)”“,有2种为 27肽和38肽,它们有类似GnRH的生物作用.此后他又报道, 在人类,猪,羊体内查到PACAP活性多肽.本试验结果明, 双峰驼精清内的诱导排卵活性多肽,分子量约在10309, 24358D之间,有四种形式为l.0肽以上的多肽,将其注入家 免能诱发排卵.但不典型,排卵强度低,与注射hcG和PMSG 使母免超排的结果不相同”.因此它有可能是一种新的多肽 激素.但需进一步纯化. 3.2激素是生物信息物质,由特异的受体识别.一般多肽激 素在血液中的浓度约在10.,10mol/L时,膜受体即可识 别并与之结合形成复合物.继而激活骡苷酸环化酶(AC)促进 ATP转化为环化腺苷酸(CAMP.它引起细胞内一系列生 化反应.膜受体接受来自何组织分泌的公驼精清活性多肽,目 前尚不清楚.魍双峰公驼生殖系统有其特点,特别是睾丸与副 性腺的特殊之处,有可能为今后研究膜受体提供一些线索, 3.3在生物活性j}}=的研究中,多敬研究者在分离肽时,先采 用冰醋酸,丙酮,乙醇等沉淀并离心,弃去大分子蛋白质,然后 将样品泵入碳l8硅胶柱内,用乙腈与微量三氟乙酸行梯度洗 脱,分部收集.根据我们对公驼精清作的SDS—PAGE和IEF 电泳结果,认为仍可按常规蛋白和多肽层析技术进行初步分 离,只要调整好正确的离子强度,控制洗脱的流速.粘稠的公 驼精清在Sephacryls一200柱内大分子蛋白并无排阻效应,而 分子量较小的多呔组份,则在进样1.5小时后,在缓慢的流速 中被收集. 3.4公驼精清内存在诱导排卵的活性多肽,分子量较大,因 此其结构,构象也可能比较复杂在活性肽结构与功能的有关 方面研究中,G,.fillemin等从病人胰腺肿瘤中分离到能刺激垂 1 体释放生长激素的活性肽(hpGHRF),其生物活性与理化性员 与下丘脑分泌的GH—RF相同,为44肽,此分子羧端区—— 28,44顺序不呈现活性,而N端的1,3位序却与活性有密 切关系.本研究已初步分离出公驼诱导排卵的活性肽,其全序 列以及活性部位尚需在纯化后,在氨基酸分析仪,蛋白测序仪 等新技术,新方法的分析测试中,逐步发现诱导排卵因子的奥 秘. 致谢本研究承蒙甘肃农业大学陈北亨教授,赵兴绪副 教授的指导与帮助和甘肃省民勤县草原站的大力支持. 参考文献 l陈北亨.畜牧兽医,1980,11(2):65,75 2潘光武等.甘肃农大研究生论文集,1982:5,? 3PanGuangWueta1.Proceedingof1stICC.1992: l59,l61 4潘光武等.中国兽医科技,1994,24(7):9,l2 5张龙翔.生物化学实验方法与技术.北京:人民教育出版 社,1987:171,255 6周本正等.实用卫生检测技术.北京:科学出版社,1992: l23,l3O 7WorkerJMeta1.MethodsinMolecularBiology.1984: l05,l11 8LaemmeliUKeta1.Nature.1976.227:680 9ZhaoXingXiueta1.Proceedingof1stICC,1992?163,168 1o陈北亨等.畜牧兽医,1980,11(il】:l,7 1lMiyataAeta1.BiochemBiophysResCommun,1989, 164:567,574 12常慧云等.甘肃省遗传学会论文集,1993:74,75 1O中国兽医科技1995年第25卷第5期 6o年代以来,国外学者通过对牛,猪,狗,羊等多种动物所做的 试验证实,胚胎在妊娠后期就可对异种抗原有较强的应答反 应.在家禽,17日龄鸡胚对多种抗原的刺激即可产生良好的免 疫应答.,Sharma等指出,11日龄鸡胚对HVT苗已能表现出 良好的免疫反应,使胚胎免疫鸡一出壳就具有一定程度抵抗 MD的能力.”“.国内也有人试用HVT或814疫苗进行对鸡 胚免疫,均取得了较好的效果”,但尚缺乏系统,完整的试验 研究. 从免疫病理学角度较全面,系统地揭示MD胚胎免疫的 机制及组织结构的形态学变化,具有重要理论与实践意义.本 文拟就胚胎免疫后从淋巴器官观察其免疫效果. l材料与方法 1.1试验材料? 1.1.1种蛋京自904种蛋,由山东泰安市种鸡场提供. 1.1.2HVT疫苗美国Solvay公司生产,批号:SerialNo. 1088/93. 1.2试验方法 1.2.1鸡胚接种对孵化至18日龄时的鸡胚进行鸡胚免疫 注射,即在鸡蛋的钝端用碘酊棉球消毒,并用6号针头在钝端 中央扎孔.然后用装有5号针头的金属连续注射器沿针孔垂 直刺入全部引长接种疫苗,0.2rnl/枚,接种后用石蜡封孔.另 以相同日龄的非免疫鸡胚作为对照.在完全相同的条件下继 续孵化,雏鸡孵出当天随机从两组雏鸡中各取5只剖检,上颚 动脉放血致死后,取淋巴器官(胸腺,法氏囊,脾脏,盲肠扁桃 体),分别进行以下染色和组织学,组织化学检查. 1.2.2HE染色将采取的淋巴器官固定于1o中性福尔 马林溶液中,常规法石蜡制片,HE染色,镜检,并测定法氏囊 滤泡大小. 1.2.3非特异性酸性酯酶染色(ANAE染色)采取淋巴器 官于甲醛一蔗糖固定液内固定24小时(4?),之后转入Holt’S 液中24小时(4?)双重固定,石蜡包埋,切片,脱腊,复水后于 孵育液中(37?)孵育4小时,经脱水,透明,封片后,光镜观察 并计数. 1.2.4浆细胞染色(RNA染色)采取淋巴器官固定于 Carnoy’S液中24小时(4?),石蜡包埋,制片,脱蜡,复水后转 入RNA染色液中4o分钟,短时的丙酮脱水,透明,封片,置光 镜下观察并计数. 1.3数据处理法氏囊淋巴滤泡直径的比较以及胚胎免疫 组和非免疫对照组淋巴器官ANAE和RAN细胞组问差异 的比较均采用两标本均数差异的显着性检验法 2试验结果 2.1免疫器官的组织学变化 2.1.1脾脏胚胎免疫组雏鸡脾脏分化较完全,有较明显可 辨的红髓和白髓;中央动脉及小动脉周围淋巴细胞鞘中散在 分布淋巴细胞.有些部位可见到大小均一,体积较小的小淋巴 细胞呈灶状分布. 对照组鸡脾组织分化不完全,白髓主要由网状细胞构成, 其中散在胞体较大和胞浆嗜伊红的大,中淋巴细胞,小淋巴细 胞数量较少. 2.1.2胸腺胚胎免疫组雏鸡的胸腺皮质,髓质界限分明, 皮质部分多由核呈深蓝色的数层小淋巴细胞构成,髓质多由 胞体稍大,核蓝染,胞浆嗜伊红着染的中淋巴细胞和少量的小 淋巴细胞组成. 对照组雏鸡的胸腺组织已具备较完整的固有组织结构, 细胞排列紧密,但多数个体的胸腺小叶中皮质,髓质界限尚未 分化完全,皮质,髓质界限不清,胸腺组织多由胞体稍大,轻度 嗜伊红胞浆的中淋巴细胞和小淋巴细胞构成.中,小淋巴细胞 较均一地分布于胸腺小叶中. 2.1.3盲肠扁桃体胚胎免疫组和对照组雏鸡盲肠扁桃体 组织中尚不见明显的淋巴滤泡,只在粘膜固有层中可见散在 的中,小淋巴细胞,两组试验鸡无明显差异. 2.1.4法氏囊胚胎免疫组淋巴滤泡已形成界限较分明的 皮质和髓质.皮质区较薄,由1,2层体积较小,核蓝染,胞浆 稀少的小淋巴细胞密集排列.髓质区域相对较大,由松散排列 的网状细胞和中,小淋巴细胞组成 对照组淋巴滤泡尚不见皮质,髓质,滤泡周边部和中央部 单位面积的细胞数量较胚胎免疫组淋巴滤泡的相应部位要 少. 对两组雏鸡法氏囊淋巴滤泡的直径进行抽测,各组数据 比较结果如下表: 胚胎免疫组与对照组法氏囊淋巴滤泡直径比较 2.2组织化学染色 2.2.1ANAE染色镜下所观察的ANAE大致有两种形 态,一种是数量较少,细胞形体较大,棕红色着染,质地较均一 的细胞,多数具有单核巨噬细胞的形态特征;另一种是数量较 多,细胞体积较小,只在胞浆一侧见有1,3个细小的棕色颗 粒,具有中,小淋巴细胞形态特征的.此类细胞多分布在胸腺 的髓质,在皮质,髓质交界处尤为明显. 脾脏ANAE细胞出现频率较高的区域在鞘动脉周围弥 散淋巴组织和中央动脉周围的淋巴组织鞘中. 对照组雏鸡法氏囊淋巴滤泡中ANAE细胞散在分布于 整个滤泡中;胚胎免疫组雏鸡则多沿皮质,髓质交界处分布. 盲肠扁桃体中少量的ANAE细胞零散分布于粘膜固有 层中. 2.2.2RNA染色观察到的阳性细胞有两种,一种为前浆 细胞,呈圆形,核的比例较大,也呈圆形,有的显核仁,胞浆和 核仁红染,核呈蓝绿色;另一种浆细胞体积小于前浆细胞,核 的比例较小,偏位,核质呈车轮状排列,无核仁,蓝染,胞浆为 中国兽医科技1995年第25卷第5期 深红色. 胚胎免疫组和对照组各淋巴器官,组织中所见到的阳性 细胞多为前浆细胞,而浆细胞的数量则较少. 3分析与讨论 3.1淋巴器官的组织学显示,出壳当日的雏鸡,鸡胚免疫组 法氏囊淋巴滤泡分化已相当完全,有明显可辨的皮质,髓质; 脾脏鞘动脉周围和中央动脉周围有较多散在的淋巴细胞,个 别例中已有较少的淋巴细胞灶;胸腺小叶也有较明显可辨的 皮质,髓质结构而非免疫对照组此时法氏囊淋巴滤泡不见明 显可辨的皮质,髓质;脾脏白髓中只散在有少量的淋巴细胞, 细胞排列松散.这表明鸡胚孵至18日龄时注射HvT疫苗,对 淋巴器官的早期发育具有明显的免疫促进作用. 3.2胚胎免疫组和非免疫对照组出壳当日的雏鸡各淋巴器 官中的ANAE淋巴细胞和RNA淋巴细胞的差异比较,怔胎 免疫组此两种阳性细胞数均普遍高于对照组.说明对鸡胚进 行适时的提前免疫,可以加快T,B淋巴细胞的增殖与分化,使 雏鸡提前获得一定程度的免疫保护力,缩短雏鸡出壳后产生 有效免疫保护的时间,因此可减少感染MD的机会. 3.3各免疫器官中的RNA细胞在1日龄时,胚胎免疫组显 着高于非免疫对照组,而且对法氏囊皱襞中淋巴滤泡的观察 结果也显示,胚胎免疫组淋巴滤泡的发育程度较为均一,依次 由大到小的顺序测定,胚胎免疫组淋巴滤泡比非免疫对照组 普遍要大,且分化程度更高.上述结果表明,胚胎免疫组B细 驴驴驴?来?稿?摘?登? 秦艽花椒散治疗耕牛内障眼 耕牛由于暑热天气温高,圈舍通风不良,使役失节,饮水 不足,易产生肝经炽热传于眼的内障眼,常见且特别严重,延 治或治疗不当可致患眼失明.笔者10年来用秦艽花椒散治疗 62头耕牛内障眼,效果显着. 症状多数体温升高,精神沉郁,羞明流泪,走路高低错 落,谨慎而作试探状.以晴生白膜为主,两眼昏暗或角膜表面 呈云雾状水肿,混浊,瞳孔扩大,多呈椭圆或圆锥形,翳膜凝于 瞳面:白内障现有星,点,条状混合物;黑内障则瞳孔经常散 大,不缩小,对光不反射;绿内障瞳孔明显散大,呈绿色的瞳孔 反射. 治疗用浓儿茶50g,五味子100g煎水洗患眼至红筋退 去;洗后用l%毛果芸香碱液滴眼,每El3次;同时肌肉注射抗 生素,每日2次,连用3天;再用秦艽花椒散中药方剂滋补肝 肾,养肝熄风明目. 处方秦艽,花椒,蔓荆子各60g,桔梗,胆草,柴胡,刺蒺 藜,蒙花,石决明各50g,川芎45g,白芷,草决明,蝉蜕,枸杞, 五味子,黄莲各4Og,杜仲,黄柏各35g,蛇蜕2O条,甘草10g, 夏枯草,桑白皮为引,水煎内服,每日4次,连服3日.临床上 胞对疫苗的反应是非常活跃的.但由此引发的体液免疫与T 淋巴细胞和非特异性免疫活性细胞在协同抵抗MD的早期感 染中的作用及影响程度等仍需进一步探讨. 3.4利用ANAE和RNA组织化学染色法对T,B淋巴细匏 进行粗略地区分,是两种不受严格条件限制的细胞化学显色 反应.尽管目前就ANAE染色来反映T淋巴细胞的特异性, 细胞阳性率和阳性细胞分类还存在一些争议,但本试验结果 显示,呈ANAE的T淋巴细胞主要分布于T细胞凝集的区 域,如胸腺髓质,脾脏中央动脉周围和生发中心外周淋巴组织 以及盲肠扁桃体弥散区淋巴组织等部位.说明用ANAE染色 法显示T细胞活动情况在特异性上是可信的.尽管受染色时 间,温度等条件的影响,但在限定条件下,ANAE染色反应依 然能相对地反映机体成熟性T淋巴细胞的活化状态,是当前 值得推广应用的一种组织细胞呈色反应. , 参考文献 张学松.养禽与禽病防治,1984,(2):22,23 邹叔和.皖北农学院,1982,(2):14,16 SharmaJMeta1.AvianDisease,1982,26(1):134,139 SharmaJMeta1.AvianDisease,1983,27(2):453,463 SharmaJM.LeukemiaReviewsInternational,1983,1: 137,138 刘中学等.中国畜禽传染病,1987,(5):15,16 古飞霞等.中国兽医科技,1990,(3):4,7 驴驴 有风症偏盛者加钩藤;眼角屎多者加银花,菊花,薄菏;眼睑肿 胀加藁本,细辛,白芷减量;翳膜退去慢者加秦皮,生石膏,去 黄柏,五味子;白内障加秦皮,菊花,去五味子,枸杞;绿内障加 石膏,薄荷,忌用青葙子;特别重要的是瞳孔散大时必须加枣 仁,五味子,白芍,诃子皮,忌用青葙子;气血虚,肝肾亏时酌加 党参,黄芪,熟地黄,大枣,田七末,牡丹皮,肉桂等. (四川省宣汉县厂溪乡畜牧兽医站636157李仕兴) 犬佝偻病的诊治 犬佝偻病是一种常见病,近几年发病呈增加趋势,据笔者 对2o多例病犬的调查了解,一部分是由于饲料中营养不全所 致,而相当部分因长期拴于阴凉处缺乏阳光照射和运动造成 维生素D合成不足或缺少所致,并不是因缺钙而引起的.其临 床表现是病犬喜卧,异嗜,骨骼变形,常见膝,腕,跗,系及肋骨 肿胀,四肢骨呈”o”或”x”状肢势,体温,脉搏,呼吸一般无变 化.内服钙片,鱼肝油丸,龙牡壮骨冲剂等含钙,磷的药物效果 多不理想.改用肌肉注射维生素AD针,3000IU/kg体重,每日 或隔日一次,连用1O次以上,另加骨化醇,对98%的病犬取得 较好的疗效. (陕西省蒲城县畜牧站715500陈树新) l234567