Caveolin1及B类I型清道夫受体在脓毒症中作用（可编辑）

Caveolin1及B类I型清道夫受体在脓毒症中作用（可编辑） 山东大学博士学位分类号: 单 位代码: 密 级: 学 号: ?厶芡弗孥 博士学位论文论文目:.及类型清道夫受体 在脓毒症中的作用 ’?一 . ‘‘’ ’’ , 舨、 年月日 ,,山东大学博士学位论文 . 原创性声明 论文作者签名:疸垒二 日期:翌:’ 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版,允许论文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 庀、积, 论文作者签名: 导师签名: 日期:兰生璺符号说明 第一部分 前 日? 言” 吾” 材料与方法 结果和讨论??” 结 论” 附 图一 图 释” 参考文献 第二部分 前 日? 言:? 吾“ 材料与方法结 果“ 讨 论一 结 论“ 附 图” 图 释“ 参考文献 致 谢” 攻读学位期间发表的学术论文目录? 学位论文评阅及答辩情况表? 英文论文 英文论文??山东大学博士学位论文?’。。‘。??“?”??..”山东大学博士学位论文 .及类型清道夫受体在脓毒症中的作用 专 业: 老年医学 博士研究生: 冯 虹 博士生导师: 高海青教授 中文摘要 脓毒症是一种由感染引起的临床综合征,是人类死亡的主要原因之一,仅在 美国每年就有约人死于脓毒症,花销约有亿美元,在世界范围内加 重了卫生资源的负担。由于人们对脓毒症的认识还有很多不足之处,这类疾病的 后期病死率极高,超过%。 脓毒症机体全身炎症状态存在两种不同的免疫反应:全身炎症反应综合征 ,特点是产生过多促炎性介质因 子,使机体早期处于高炎症反应状态,而随后发生的代偿性抗炎症反应综合征 ?,则使机体逐渐转入 低炎症反应状态。在发展到的过程中,机体内促炎性介质因子和抗 炎性介质因子可达成某种平衡,称为混合型拮抗反应综合征 ,。与的失衡或扩大化,均会导致宿主发生 不恰当的炎症反应,或因过激的炎症反应或因免疫功能抑制而受到间接伤害。 建立化的脓毒症动物模型是探索脓毒症的病理机制和预防干预的需要。 脓毒症患者最常见的感染源来自腹腔,且造成腹腔内感染相对比较容易,因此腹 腔感染模型是目前最常用的脓毒症动物模型。盲肠结扎穿孔术 ,满足脓毒症动物模型必备的基本要求:符合脓毒症典型的高 排低阻血流动力学表现和高代谢状态。伴发多器官功能障碍。较高的自 然死亡率。一般要求动物模型的自然死亡率达到.%。脓毒症是严重感 染引起机体的炎症反应过度激活,从而造成的自我损伤,而不是细菌和内毒素对 机体的直接伤害,因此出现器官功能障碍、动物死亡应该与脓毒症模型制备有一 定的时间间隔。一般在制模.后发生的器官功能障碍或死亡属全 身炎症反应是的标记蛋白。.基因的敲除会导致的缺失,说明 蛋白在这种特殊结构的组装过程中发挥了关键作用。 在多种细胞生理病理功能方面都发挥了重要作用:.参 与胞吞和吞噬作用;参与胆固醇转运和胞内胆固醇调节; 参与细胞信号转导的调节等。因此,人们发现与多种疾病 的发生发展都有密切的关系,如肿瘤、糖尿病和心肺疾病等。 最近有文章报道参与机体的免疫调节。但关于的这项 功能,不同的文章有看似相反的报道。用细菌脂多糖, 刺激作为内毒素血症的模型,人们观察到敲除小鼠更能耐受引起 的炎症性肺损伤。但用伤寒沙门氏菌或铜绿假单胞菌刺激小鼠,敲除 小鼠则表现出较高的死亡率。这些研究证明对和细菌感染的反应 是不一样的,而且以上研究所用的炎症模型都不能较好地模拟临床。内毒素血症 和脓毒症的病理生理改变有相当大的区别,我们发现至今尚无有关.和 脓毒症关系的报道。因此,利用合适的动物模型来研究在脓毒症中所 山东大学博士学位论文 起作用是一个非常有意义的课题。这不仅能得出更为贴近临床的结论,而且也为 脓毒症的干预提供一个新的靶点。 研究目的 探索.对动物脓毒症病程的影响及研究此影响的具体机制。 研究方法 我们用作为脓毒症模型研究.在多种微生物引起的脓毒症中的 作用。首先我们观察敲除小鼠和野生型小鼠在术后天的死亡率 并观察到了一定差别。然后我们分别从以下个方面探索.的作用 机制: 衡量.对引起的肺损伤的影响。我们检测术后两组 小鼠肺脏髓过氧化物酶,活性,称量肺湿重和干燥后的 肺干重,计算肺湿/干重比来评估肺水肿,利用分离.灌注肺脏模 型检测肺脏毛细 血管膜通透性。衡量.对引起的炎症反应的影响。两组小鼠施 以,术后、、、时取小鼠血清测量血清中肿瘤坏死因子吨 ,.,白介素..,和亚硝酸盐/硝酸盐 /,水平。衡量对术后机体含菌量的影响。 两组小鼠施以,术后时检测小鼠血液、肝脏和脾脏中的细菌含量。 衡量.对后淋巴细胞稳态和凋亡的影响。两组小鼠施以,术 后时分离小鼠胸腺和脾脏,用流式细胞术组织中淋巴细胞表 型,并用 /和肘两种方法检测细胞凋亡。 结果 对脓毒症小鼠有保护作用。导致.敲除小鼠 %的死亡率,但野生型小鼠死亡率只有%。.对引起的肺 损伤无明显影响。两组小鼠肺活性,肺水肿和肺毛细血管膜通透性无明显 差别。.敲除小鼠在脓毒症时炎症反应失控。后野生型小鼠表 现出典型的急性期反应,.和.在脓毒症早期大量产生然后在接 下来的时间水平逐渐降低。但与野生型小鼠不同,.敲除小鼠在脓毒症 期间炎症因子的生成水平一直很高,血清.、.和水平在术后 内持续升高,并且在时比野生型小鼠高.倍。.敲除小鼠 山东大学博士学位论文 在脓毒症时有较高的细菌负荷。敲除小鼠血液、肝脏、脾脏中均表现 出较高的含菌量。脓毒症时敲除小鼠胸腺细胞凋亡增多,淋巴细 胞稳态失衡。敲除小鼠胸腺细胞凋亡明显增多,表现为、卯 和腿的胸腺细胞均有倍增加。而且胸腺和脾脏中淋巴细胞稳态失衡,细 胞亚群比例失调。 结论 .对脓毒症小鼠起到了保护作用,降低脓毒症小鼠的死亡率。 .抗脓毒症的作用是通过调节炎症反应、减少细菌负荷、抑制胸腺 细胞凋亡等来实现的。 .是较为理想的脓毒症动物模型。 研究意义 本研究的创新点在于采用一种更好地模拟临床的脓毒症动物模型来验证了 在脓毒症中的作用,并从多角度多方面深入探索了作用机制。进一步 证明了炎症是一个牵涉多器官组织的复杂的过程,涉及机制繁多。而. 通过干预多种途径对脓毒症动物起到保护作用,这也为脓毒症的临床干预提供了 一个崭新的靶点,并为进一步研究指出了方向。 第二部分 类型清道夫受体通过调节炎症反应对脓毒症小鼠起保护作用 研究背景 , 是清道夫受体 类型清道夫受体 家族的一员,是一个的位于细胞膜里的膜蛋白。.分布广泛, 主要在肝脏及生成类固醇激素的组织中高度表达,如肾上腺、睾丸、卵巢等。在 巨噬细胞、星形胶质细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞上也都有表达。. 是目前公认的受体,介导了转运的胆固醇酯选择性地摄入细胞内, 参 与了胆固醇的逆向转运过程。除此之外,.还具有多种重要的生理功能: 介导的内流的胆固醇是合成类固醇类激素的重要原料:血浆中 与血管内皮细胞上结合,可以激活共同位于里的内皮型一氧化氮 山东大学博士学位论文合成酶 , ,,产生一氧化氮 ,发挥舒张血管等心血管保护作用;抑制过量产生的细胞毒 性;在没有配体与结合的情况下,能通过激活舔.诱导 细胞凋亡; 最近有文章报道有抗引起的动物死亡的作用。其保护作用来源 于抑制诱导的细胞毒性和介导的糖皮质激素合成。这些研究提 示了可能会在脓毒症中发挥一定作用。鉴于内毒素血症并不能很好地模拟 临床,采用合适的脓毒症动物模型来发掘在炎症中的作用是一个十分必要 的课题。这不仅能够更好地得出延伸至临床的结论,而且也为脓毒症的诊治提供 了一个新的靶点。 研究目的 研究.在动物脓毒症中的作用并探索其作用机制。 研究方法 我们采用作为脓毒症动物模型,观察.敲除小鼠和野生型小鼠在 后的死亡率,并观察到了一定的差别。接下来我们采用以下步骤来探索其中 的机制:衡量对后炎症反应的影响。两组小鼠施以,术后 、、、时测量小鼠血清中.,.和水平。衡量. 介导的糖皮质激素合成在脓毒症中的作用。两组小鼠施以,术后、、 、时测量小鼠血清中皮质酮水平,以及在小鼠施以之前在饮用水 中添加皮质酮,观察后小鼠的死亡率。衡量对巨噬细胞炎症因 子产生的影响。我们培养两组小鼠骨髓来源的巨噬细胞,并用刺激,检测 分泌的和一水平。衡量.在巨噬细胞上的表达是否与脓毒症 小鼠的死亡率有相关关系。我们之前的研究证明第位氨基酸突变为的 .已经丧失了?的基本功能,包括摄取胆固醇、调节类 固醇激素合成、诱导凋亡、抗毒性。因此转基因小鼠是一个良 好的用来研究未知作用的模型。我们用敲除背景的转 基因小鼠和未转基因小鼠来再一次确定.对巨噬细胞炎症反应的影响及这 个影响与小鼠的死亡率的关系。衡量.对样受体. 山东大学博士学位论文 ,介导的..激活的影响。既.细胞稳定表达、、 和启动子。激活,导致?启动子的表达,然后能催 化.检测液变蓝。蓝色的深浅用处的吸光值来定量检测。我们制 备稳定表达野生型.、和质粒的.细胞系, 用、.、、 /的刺激后检测.的激活。衡量 在脓毒症时对脂蛋白的影响。两组小鼠施以,术后时采血,用快速蛋白 液相色谱分析血清脂蛋白分型。衡量.在脓毒症时对血浆清除的 影响。两组小鼠施以,术后、、时取血检测血浆水平。 结果 对脓毒症小鼠有保护作用。在后时敲除小鼠的 死亡率是%,而野生型小鼠的死亡率只有%。脓毒症时敲除小 鼠固有免疫反应异常。野生型小鼠表现出典型的急性期反应,师吨和.在 脓毒症早期.大量产生然后在接下来的时间水平逐渐降低。与野生型小鼠 不同,敲除小鼠在后时血清.伍和.水平水平较低,说明 脓毒症早期敲除小鼠炎症反应延迟。而且在时敲除小鼠血清 .和.水平持续升高,说明脓毒症晚期敲除小鼠体内炎症反应失 控性持续发展。的反应类似。介导的皮质酮合成对脓毒症小鼠的 死亡率无明显影响。补充皮质酮对引起的脓毒症的敲除小鼠并无保 护作用。调节巨噬细胞的炎症反应。在刺激下,野生型巨噬细胞 生成的在达到最大值,.在达到最大值。但是敲除巨噬 细胞持续产生.和.,在时水平超过野生型巨噬细胞。说明无 表达的巨噬细胞炎症反应失控。巨噬细胞上的表达是降低脓毒症小鼠 死亡率的原因之一。与未转基因的巨噬细胞相比,转基因的巨噬细 胞上的表达显著抑制.和.的产生。并且后 转基因小鼠死亡率明显较低。调节介导的. 激活。的存在显著地抑制了刺激下.?的激活,说明能调 节信号传导通路来调节炎症反应。脓毒症期间对脂蛋白无明显 影响。脓毒症时加速了的清除。后时敲除小鼠 血浆水平比野生型小鼠较高,而且在脓毒症早期敲除小鼠血浆 山东大学博士学位论文 水平比野生型小鼠较低,说明.同时参与了从炎症部位吸收入血和从 血中清除两个过程。 结论 .对脓毒症小鼠是一个重要的保护性因子,有效降低脓毒症小鼠的死亡 率。 .抗脓毒症的作用是通过调节巨噬细胞介导的炎症反应和促进 清除来实现的。 .是较为理想的脓毒症动物模型。 研究意义 本实验采用了一种更能模拟临床脓毒症患者病程的动物模型来验证了 .和脓毒症的关系。是公认的受体。我们这一发现将脂代谢中 的关键蛋白和炎症联系在一起,强调了蛋白的多功能性,说明了生物体的 复杂性。这就开拓了我们在实验时的想象力,并给我们一个提示,揭示蛋白 的多功能是必不可少的任务。机体的各个系统都紧密相关,比如干预脂代谢时可 能会影响到机体的炎症免疫。因此本实验为脓毒症的临床干预开拓了一个崭新的视野。 关键词:脓毒症,.,类型清道夫受体,炎症,固有免疫 山东大学博士学位论文, ., . ,. , % %. . , ; , ; ,, . .. . ,. , . , . , . % % . . ., . ,. . ? ,. , . ,. . , :,,山东大学博士学位论文 符号说明 英文缩写 英文全称 中文全称 代偿性抗炎症反应综合征 小窝蛋白.盲肠结扎穿孔术 内皮型 一氧化氮合成酶 胎牛血清 高密度脂蛋白 十六烷基三甲基溴化铵 . 白介素. 诱导型一氧化氮合成酶 肺毛细血管滤过系数 晦伍 脂多糖 螂 混合型拮抗反应综合征髓过氧化物酶一氧化氮 一氧化氮合 成酶 / 亚硝酸盐/硝酸盐 磷酸盐缓冲液碘化吡啶 磷脂酰丝氨酸 全身炎症反应综合征山东大学博士学位论文 清道夫受体类型清道夫受体 .样受体肿瘤坏死因子吨 师吨 转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷 生物素刻痕末端标记 ?山东大学博士学位论文 第一部分 .通过调节炎症反应、减少细菌负荷、抑制胸腺细胞凋 亡从而对脓毒症小鼠起到保护作用 屿。鱼 刖 置 脓毒症是一种由感染引起的全身一系列炎症反应的临床综合征,是导致人类 死亡的重要原因之一。仅在美国每年就有约人死于脓毒症,花销约有 亿美元【.】,在全球范围内加重了医疗卫生资源的负担。由于人们对脓毒症的 认识还有很多不足之处,这类疾病的后期病死率极高,超过%】。研 究脓毒 症中涉及的调节因素,尤其是内源性调节因子,是一个重要的课题。这不仅是对 脓毒症发病机制的探索,而且对脓毒症的有效治疗有重大的指导意义。 .脓毒症 .脓毒症的病理生理学改变 脓毒症的病理生理过程可分为个阶段:全身炎症反应综合征 ,、脓毒症、严重脓毒症和脓毒症休克 。脓毒症后期主要表现为全身器官功能衰竭,并伴随难以逆转的循环衰竭, 即脓毒症休克。胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道以及血液感染是大多数脓毒症患者 的初始感染灶【】。脓毒症的全身炎症反应存在两种不同的免疫反应状态: 的特点是过多的促炎性介质因子产生,使机体在脓毒症早期表现出高炎症反应状 . 态;而随后发生的代偿性抗炎症反应综合征 ,则表现为代偿性产生一系列抗炎性介质因子,使机体 逐渐转入低炎症反应状态。在向发展的过程中,机体内促炎性介质 因子和抗炎性介质因子可达到一定的平衡,这时称为混合型拮抗反应综合征,】。在脓毒症的发生发展过程中, 与的失衡或两者的扩大化均会导致宿主发生不恰当的炎症反应,或 导致炎症反应过激损伤自身机体,或导致免疫功能抑制降低机体的防御力。这些 出不一致的结论,在以往的报道中时有发生。出现这个问题的原因可能有很多, 其中一点即为选用的动物模型不恰当。因此,研发符合脓毒症发病和病生过程的 稳定的动物模型至关重要【.】。 为了合理地模拟脓毒症的发病、病生学变化和临床特征,我们寻找的理想的 脓毒症动物模型必须具备以下基本要求:具备脓毒症时典型的高排低阻的血 流动力学改变和高代谢状态;伴随多器官功能障碍;产生较高的死亡率。 一般要求制模后动物的自然死亡率达到.%;具备脓毒症典型的生存死 亡曲线,动物死亡一般出现在制模后.之后。脓毒症时机体的损伤绝大部分 来源于自身过度激活的炎症反应造成的间接伤害,而不仅仅是细 菌和内毒素的直 接影响。因此理论上动物死亡和模型制备应该有一定的时间间隔。.内全身 炎症反应还来不及启动,因此.内出现的动物死亡不符合典型的脓毒症动物 死亡。 常用的脓毒症动物模型列举如下: 菌血症和内毒素血症模型。脓毒症是细菌及其毒力因子内毒素,释放入血引起的全身炎症反应。因此最直 接的设想就是直接输注细菌和/或来制备脓毒症动物模型。理论上静脉注射 细菌和/或确实能引起机体炎性介质释放,模拟急性全身炎症反应。这种动 物模型常用的制模方法为单次大剂量输注细菌和/或,即短时间内或次输 注致死量的细菌和/或。但是,这种方法制作的脓毒症动物模型表现出低排 高阻的血流动力学,不同于脓毒症患者早期出现的高排低阻,而且动物死亡时间 早、死亡率很高,常在制模后数小时内迅速死亡,而这时机体的炎症反应还没有 充分调动起来。因此,该模型的病理生理变化其实是细菌和/或的 直接毒性 导致,并非真正的脓毒症模型。因此采用这种模型来做脓毒症研究,可能会得出 与临床实际不相符的结论。例如,等】用单次输注致死量大肠杆菌的 山东大学博士学位论文 脓毒症动物模型,得到甲基强的松龙能明显提高脓毒症动物存活率的结论。但是 在之后的临床实际研究中,人们观察到糖皮质激素并不能显著改善脓毒症患者的 预后。又比如,等【】关于抗肿瘤坏死因子 单克隆抗体治疗感染性休克的研究,得到了令人振奋的结论,从此揭开了抗促炎 性细胞因子治疗脓毒症的序幕。然而接下来的、?期临床实验证明这种治疗办 法并不能显著改善患者的生存率。因此,选用合理且稳定的动物模型是脓毒症研 究的基本要求,并且这一原则也适用于其他任何一项动物研究。除大剂量单次输 注细菌和/或之外,持续小剂量门脉注射细菌和/或也是一种办法。这种 方法虽然可以较好地模拟细菌持续吸收入血的过程,但是实验步 骤复杂,实验条 件要求较高,动物需保持全程麻醉状态,不易操作。 腹腔感染模型。脓毒症患者最常见的感染灶之一即腹腔,而且造成腹 腔感染比较容易,因此,目前腹腔感染模型是最常用的脓毒症动物模型。制模方 法主要有两种:盲肠结扎穿孔术 ,和腹腔细菌 接种。 年等】将早期的模型进行改良并推广。动物盲肠 内积存粪便和细菌,将盲肠结扎并穿孔后就会有含细菌的肠内容物持续进入腹 腔,引起腹膜炎,可以很好地模拟临床腹膜炎引起的脓毒症,可用于多个种类的 动物。手术中可通过调节多个因素来控制脓毒症的严重程度,即表现为死亡 率。一般情况下脓毒症的严重程度主要与动物的基因背景、盲肠大小、粪便量、 结扎部位和穿孔个数等因素有关。为了建立稳定的、合理的脓毒症模型,实验前 需要对不同类型的动物进行手术条件的摸索,包括结扎的盲肠范围、穿孔大小和 个数等。我们在以/为背景的敲除小鼠和对照组的模型制 作中观察到,从根部结扎盲肠,用号针头在盲肠上穿孔两次并轻轻挤压,使 少量内容物排出后回纳盲肠关腹,所制作的模型存活率可达到%,天 的自然死亡率敲除小鼠高达%,并能引发多器官功能障碍、脓毒症 休克,较好地模拟临床,符合脓毒症动物模型的要求。 另一方法即腹腔细菌接种。在这个方法制成的腹膜炎和继发脓毒症模型中, 大量细菌迅速进入腹腔可很快吸收入血从而导致中毒性休克,也不能很好地模拟 临床病程。为克服这一缺点,等将其改良为纤维蛋白一粪便凝块 山东大学博士学位论文 法。将凝块种植到腹腔,既能保证细菌持续释放吸收入血,又能防止细菌被过快 吸收。这种方法制成的脓毒症模型虽然可以模拟脓毒症时患者体内的炎症反应, 但程度较轻,很少发生血流动力学变化和多器官功能障碍。 总之,用制成动物脓毒症模型,病理生理机制和临床病程同脓毒症患 者类似,制模操作简单,不需要维持麻醉状态,可制成多种动物模型,适合不同 研究目的的需要,是目前较为理想的脓毒症动物模型。 . . . 和. 在拉丁语中是小的凹陷的意思,最早在年由等提出, 用来描述上皮细胞上观察到的细胞膜烧瓶样内陷。在之后的研究 中人们发现 是脂筏的一种类型,是细胞膜表面特定的直径约.的一个微型 结构区域,富含胆固醇、鞘磷脂和多种蛋白质【】。不仅含有特殊 的脂 质成分,还含有大量的细胞信号传导分子,比如一氧化氮合成酶 ,、家族酪氨酸激酶 ,、样受体 等,为细胞信号传导提供了一个作用平台。 年人们鉴定出一种称为的蛋白。随后的功能性研究证明该蛋白 不仅介导了结构的形成,也是功能的关键性蛋白,因此被命名 为。到目前为止,哺乳动物中已经发现了种的异构体: 、、和,是不同基因的编码产物。./分布广泛,在内 皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、粒细胞和肺泡细胞 等细胞膜上都有 分布,而主要分布于多种肌细胞,如骨骼肌、心肌和横纹肌细胞】。 .分子量为,是的主要组成蛋白,而且被看作是 的标记性蛋白【】。.?基因的敲除会导致的缺失【】, 说明.蛋白在这种特殊结构的组装过程中发挥了关键作用。鉴 于对细胞信号转导的影响,已经有多篇报道证明在多种细胞 生理功能方面都发挥重要作用,特别是胞吞,吞噬,胆固醇转运和肿瘤抑制等, ,?。 . .的生物学功能 山东大学博士学位论文 .. .参与胞吞和吞噬作用 多个实验证明是介导胞吞过程的关键性蛋白【】。 参与了多种不同类型的胞吞过程。其结构中包括囊泡运输系统必需的全 套分子机制。介导的胞吞作用具有选择性。仅在内有相应受体 的配体可以通过这种方式进入细胞。的这种内吞作用对机体具有正反两 方面的生理意义。一方面,的胞吞作用有助于机体必需的功能分子如生 长因子、胰岛素、抗体、营养素等运输至细胞内,发挥重要的生理功能;另一方 面,有实验提示介导的胞吞作用可能会有助于一些病原微生物进入细胞 内,起到辅助感染扩散的作用。因为经途径进入细胞内的微生物可不被 溶酶体降解,逃避了机体的免疫防御,保持其致病活性【】。 .. .参与胆固醇运输和胞内胆固醇调节 微结构中胆固醇的含量远高于其他部位,部分是因为和 胆固醇具有非常强的亲和力。参与运输胆固醇,其效率比其他运输胆 固醇的机制高倍以上。因此.得以迅速将细胞内新合成的胆固醇从内 质网运送至细胞膜,参与构成细胞膜、形成或装载到高密度脂蛋白 ,上参与胆固醇的逆向转运。因此,通 过参与细胞的胆固醇转运,对细胞胆固醇稳态的维持发挥了重要的调节作用 【。值得注意的是,目前公认的受体类型清道夫受体 ,.主要分布在细胞膜的。既可以介导皿上的胆固醇 酯从上摄入至细胞内,又可以介导细胞内胆固醇外流出细胞,是调节细胞 胆固醇代谢的一个重要因子。但等【】用两种细胞系证明了并 不影响.这种转运胆固醇的能力。 .. .参与细胞信号转导的调节 中含有数量惊人的信号转导相关蛋白,包括酪氨酸激酶类膜受体、 家族酪氨酸激酶、丝/苏氨酸激酶类膜受体、蛋白偶联受体及下游信号转导 分子、类固醇激素受体、、?等,。为这些信号分子提供 了一个作用平台,使各条信号通路之间的交互谈话成为可能。.在这个 信号平台中处于中心调节位置。一般情况下,对中的信号分 子主要起到抑制作用,抑制细胞增殖,促进细胞分化成熟,维持细胞状态的稳定。 山东大学博士学位论文 但在胰岛素受体信号转导通路中,.促进了受体活化后的信号传导,对 维持受体正常的功能发挥了重要作用,。 . .与疾病 .. .与肿瘤 之前在对比人类和小鼠染色体图谱的同源性时,人们发现小鼠染色体的 对应人的。而恰好这一区域是当时一个尚未鉴定的肿瘤抑制基因的位置。 因为人们在多种恶性肿瘤中均发现了该位点的缺失,包括前列腺癌、头颈部鳞癌、 肾癌、卵巢癌、结肠癌和乳腺癌等。在随后的研究中, 等【】于 年证实了/基因就定位于人类号染色体...,在基因水平提示 .与肿瘤的发生发展密切相关。目前,.与肿瘤的相关性问题已 是肿瘤学的研究热点之一。在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、胃肠道肿瘤等 的研究中均有关于的报道,但在不同的肿瘤中发挥 的作用不同。 .. .与糖尿病 糖尿病的病理生理机制包括两个方面:胰岛素分泌异常和/或胰岛素受体信 号传导异常。在这两个过程中必须有两个分子的参与:葡萄糖转运蛋白和胰岛 素受体,而两者均定位于中。与胰岛素受体有交互作用。胰 岛素受体是中少数能被.活化的信号受体之一,而胰岛素受体 又可以通过直接催化.的第位酪氨酸残基发生磷酸化,从而调节胰 岛素受体的信号传导。此外,人们在糖尿病小鼠模型中发现,糖尿 病性心肌损伤 常伴有水平的升高。这些实验说明./在胰岛素的信号转导、 糖尿病的发生发展中起到重要作用【】。 .. .与心肺疾病 内皮细胞来源的一氧化氮 ,生成不足、生物利用率低下, 在动脉粥样硬化的发生发展过程中扮演了重要角色。内皮型一氧 化氮合成酶,在中直接与.结合, 并且其活性受.的调节。.的缺失导致活性水平降低、 生成减少,导致血管弹性降低【,。肺泡型上皮细胞高度表达?。 山东大学博士学位论文 .基因敲除小鼠肺泡空间狭小,肺泡间隔增厚、纤维化,肺泡上皮 增殖失控,导致严重的肺脏结构和功能紊乱。基因敲除小鼠心肺 障碍,运动耐量显著降低【】。 .. .与炎症 最近有文章报道参与了机体的免疫调节。内毒素刺激可以上 调巨噬细胞.的表达【】;而巨噬细胞上的表达可以减少 诱导的细胞因子的产生】。等用刺激作为内毒素血症的模型, 观察到敲除小鼠更能耐受引起的炎症性肺损伤。但也有一些与此 篇文章相反的报道。最近的两篇文章显示,用伤寒沙门氏菌【】 或铜绿假单胞菌 【】刺激小鼠,敲除小鼠表现出较高的死亡率。这些研究证明 对和细菌感染的反应是不一样的。对细菌引起的脓毒症可能起到 保护作用。虽然人们经常用引起的内毒素血症作为研究脓毒症的模型,而 且在脓毒症的发生发展中起到了关键作用,内毒素血症并不能完全模拟脓 毒症时的病理改变【】。比如对突变小鼠来说,这种小鼠可以抵抗内 毒素血症引起的死亡,但是对细菌引起的脓毒症性死亡却很敏感。鉴于内 毒素血症和脓毒症的区别,我们发现关于和脓毒症的报道非常少。因 此我们选择了一种公认的更接近临床的脓毒症模型来研究.在脓毒 症中的作用】。在这篇文章中我们论证了敲除小鼠更容易死于多种 微生物引起的脓毒症。进一步研究发现抗脓毒症的作用是通过调节炎 症反应、减少细菌负荷、抑制胸腺细胞凋亡等来实现的。 山东大学博士学位论文 材料与方法 .实验材料 .实验动物 以/为背景的敲除小鼠购自 。为 了消除实验组和对照组之间背景的影响,我们用.?的小鼠交配 得到 和.竹的同窝仔畜,仔畜用 提供的方法来判断基因 型。小鼠喂以标准饮食,维持标准昼夜节律。动物实验得到肯塔 基大学动物饲养 和使用协会的批准。 .主要试剂 标记的单克隆抗体抗克隆购自 ; 标记的单克隆抗体抗克隆.购自 ; ; 标记的单克隆抗体抗克隆..购自 标记的单克隆抗体抗克隆购自 ; 购自 ; 血琼脂平板 肿瘤坏死因子吨 砬,伍酶联免疫吸附试验, ? 试剂盒购自; 白介素..,.试剂盒购自; : 皮质醇/皮质酮试剂盒购自 ; 亚硝酸盐/硝酸盐/,试剂盒购自 ; 脂多糖,试剂盒购自 膜联蛋白/碘化吡啶 /试剂盒购自 , / ; 转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷一生物素刻痕末端标记趾 ,小试 剂盒购自; 山东大学博士学位论文 试剂盒购自; 磷酸盐缓冲液 ,购自:培养液购自: ,购自 十六烷基三甲基溴化铵 : 盐酸邻联茴香胺购自; ‘ 过氧化氢溶液购自; ,异氟醚购自 .; ; 克他命购自 甲苯噻嗪购自; 肝素购自 。 .主要仪器 麻醉机 ; 分光光度计 ; 仪一 .; 重量传感器 ; / 压力传感器 ; ?信号放大器 ;数字转换器 ;乙烯导管 ; 灌注泵 : 呼吸机 ; ; 流式细胞分析仪 ;山东大学博士学位论文 凝胶蛋白成像系统 ; 流式细胞分析软件; 图像处理软件 ; 传感器信号处理软件 ; ? ◎软件 。 .实验方法 .脓毒症模型的制备 按照.描述的步骤进行,。?的小鼠用麻醉机 以.%的异氟醚和%的氧气混合持续吸入麻醉。膈肌下做一长的腹 正 中切口。腹内探查,分离出盲肠,从盲肠根部结扎,用号针头在盲 肠上穿孔 两次并轻轻挤压,使少量内容物排出。将盲肠复位,依次缝合腹 膜、皮下、皮肤 层关腹。将术后小鼠腹腔注射 缓冲液复苏。假手术组与手术组类似,只 是未进行盲肠结扎穿孔。术后观察天内的生存率。 .细胞因子和一氧化氮的测定 .大小的小鼠在做完术后、、、用进行麻醉,心脏 穿刺取血。血清中含量用相应的试剂盒进行测定,借此估测小鼠 体内产生 的含量;血清、.、皮质酮和水平用相应的试剂盒进 行测定。的大致步骤如下: 专用孔盘用/孔的稀释过的捕 将 捉抗体孵育过夜。 弃液体,用清洗液洗次。 用/孔的封闭液室温封闭。 弃液体,用清洗液洗次。 按浓度梯度稀释标准液,/孔加入指定的孔中,并将/孔待 测样品加入指定的孔中。室温孵育或孵育过夜。 弃液体,用清洗液洗次。 山东大学博士学位论文 将/孔的稀释后的检测抗体加入所有的孔中,室温孵育。 弃液体,用清洗液洗次。 将/孔的稀释后的.心加入所有的孔中,室温孵育 。 弃液体,用清洗液洗次。 将州孔的反应底物加入所有的孔中,室温孵育。 将/孔的停止液加入所有的孔中。 用分光光度计记录的吸光值。 .髓过氧化物酶,活性检测 .大小的小鼠在做完术后、、、用进行麻醉。取出 的磷酸钾盐缓冲液 中研磨成匀 肺脏在含 浆。把研磨好的组织匀浆用超声粉碎,反复冻融次液氮.水浴,再 用的转速离心。将离心后的上清液按/的比例体积比与 显色液含. /盐酸邻联茴香胺和.%过氧化氢混合,用荧光分 光光度计波长记录液体混合后内吸光度的变化。髓过氧化物酶 活性即每克肺组织产生的每分钟的吸光值的变化。 啪活性燃 分钾×历想重 .肺毛细血管膜通透性的测定 我们采用离体肺灌流模型来测定小鼠的肺毛细血管滤过系数晦 【。 敲除小鼠和野生型小鼠在术后用克他命 /和甲苯 噻嗪. /腹腔注射麻醉,暴露气管和肺脏。插入气管插管维持正压通气 次/,最高通气压.水柱,呼气压水柱,内侧颈静脉注射 肝素防止血液凝固。在小鼠右心室做切口,将聚乙烯导管通过肺 动脉瓣插入 肺动脉,用缝线将导管固定在肺动脉和主动脉旁。切开左心房,用以收集通过肺 .以恒定的速度/ 循环流出的灌注液。用恒温的. 通过导管灌注肺脏。迅速将心脏和肺脏整体从胸腔游离,悬挂于连接于重量传感山东大学博士学位论文 器的金属钩上。试验期间同时用压力传感器记录肺动脉压。两个感受器都接到信 号放大器上,信号借助数字转换器和软件在电脑上显示并记录。设备组装好后, 将肺重标准化为,并稳定,记录之后的压力变化。每隔,肺重的 记录都会呈现一种特征性的曲线,前快速期肺重会迅速增加几乎垂直, 然后进入慢速期,表示伴随着灌流液的外流。静脉压力忽略为。每只小鼠测量 个羁值,取均值。实验结束后分离肺脏置于烤箱中烘干至少,称肺脏干 . 重。数据用 ◎软件进行分析。 .菌血症和组织含菌量的检测 实验按我们以前文章描述的步骤进行【】。在.敲除小鼠和野生型 小鼠术后,将血液和组织取出。为了判断菌血症,将血液按:和 琼脂平板上,在 :用稀释,取出上稀释液涂在 培养后记录菌落数。组织含菌量按描述的方法检测】。取 肝脏或脾脏组织用髂试剂盒提取总,然后用细菌特异的引物来实 施。 定量,将产物在%琼脂糖凝胶上电泳,并采集紫外线下照片。图像 用软件进行分析。产物条带的亮度可用来估测细菌含量。已知浓 度 的.细菌用作对照。 上游引物:; 下游引物:盯。 .流式细胞术分析脓毒症时淋巴细胞凋亡和淋巴细胞稳态 / 脓毒症时大量淋巴细胞死于凋亡。我们用两种不同的办法 和标记检测淋巴细胞的凋亡并检测后细胞和细胞的稳态。 .周的小鼠在后麻醉处死,取出胸腺和脾脏用 研磨成 单细胞悬液并计数脾细胞用裂解液去除红细胞。分别取出个胸腺 和脾细胞用 /和进行标记,并用.和分别标记 细胞和细胞。标记好的细胞用流式仪进行分析。 细胞凋亡是细胞的基本生理活动之一。它在胚胎发育、组织损伤 修复、内环 境的稳态维持等方面起着重要的作用。 是一种依赖性磷脂结合 蛋 白,分子量为.。细胞凋亡早期,位于细胞膜胞浆面的磷脂酰丝氨酸山东大学博士学位论文 可以与以高亲和 ,会翻到胞膜表面,而 力特异性结合。将 标记荧光染料作为荧光探针,利用流式细胞 仪或荧光显微镜即可检测细胞凋亡。是一种核酸染料,它不能透过完整的细 胞膜。但能够透过凋亡中晚期的细胞和坏死细胞的细胞膜而使细胞核红染。 将 与搭配使用,可以用来区分凋亡早期、晚期的细胞以及坏死细 胞。 /标记的大致步骤如下: 制备/标记液:将原液稀释于孵育液, 并加入 原液。混匀。 将个细胞用洗一遍,并离心。弃上清。将细胞重悬于 /标记液,避光孵育。 清洗两遍,用流式细胞仪进行分析。 细胞在发生凋亡时,会激活一些内切酶,这些内切酶会切断核小体间 的基因组。细胞凋亡时抽提进行电泳检测,可以发现.的 。基因组断裂时,暴露的可以在末端脱氧核苷酸转移酶 的催化下加上荧光素标记的,从而可以通过荧光 显微镜或流式细胞仪进行检测,这就是法检测细胞凋亡的原理。 标记的大致步骤如下: 制备固定液缓冲的%多聚甲醛,.,通透液.%柠 檬酸钠溶液中溶解.%的 ,用之前制备。 取×个细胞用洗三遍。 将细胞重悬于固定液,室温孵育。 离心。弃上清。 清洗一遍。离心,弃上清。 将细胞重悬于通透液,冰上孵育。 清洗两遍。离心,弃上清。、 附裂解液的制备:双蒸水中溶解. 、. . ,在溶质完全溶解后用.%的调节值至..。然后在 无菌环境中用的滤网过滤除菌,无菌状态常温保存。 .统计学分析 应用统计软件进行数据分析。生存率用.,分析,两组数据 比较用双侧检验。各组数据以均数标准差表示,.为差异有统计学 意义。山东大学博士学位论文 结果和讨论 .对脓毒症小鼠有保护作用 我们用作为脓毒症模型研究在多种微生物引起的脓毒症中的 作用。之前的文章报道敲除小鼠能抗内毒素血症引起的死亡【】。 我们的实验结果与这个报道并不完全一致。.敲除小鼠更易死于引 起的脓毒症.,图。导致敲除小鼠%的死亡率,但 野生型小鼠死亡率只有%。这个结果说明在脓毒症中起到重要的保 护作用;在内毒素血症和脓毒症中起的作用是不同的。 .对引起的肺损伤的影响 肺组织大量表达.。等用诱导的内毒素血症模型证明, .的缺失对引起的肺损伤有保护作用,表现为肺活性较低, 肺水肿较轻,肺毛细血管膜渗透性较低。我们用诱导脓毒症时肺损伤, 并检测脓毒症时对肺活性,肺水肿和毛细血管膜渗透性的影响。 如图所示,术后 活性明显增加,但敲除小鼠和野生 型小鼠没有差别。肺水肿用术后的肺湿/干重比来衡量。野生型小鼠 组和假手术组的肺湿/干重比没有差别,这跟以往的报道一致,对野生型小鼠来 说并不加重肺水肿【】。有趣的现象是,对敲除小鼠,组和 假手术组也没有肺水肿的差别,说明脓毒症时.敲除小鼠没有额外的肺 水肿形成。接下来我们用离体肺灌流模型来计算肺毛细血管滤过系数致,这 是肺血管内皮通透性的定量指标。如图所示,.敲除小鼠组和 假手术组的蟛值没有差别。野生型小鼠组的蚝值比假手术组略有增加, 但差别无统计学意义。值得注意的是,对野生型小鼠来说,刺激可以使局 值明显增加【】,而刺激后的硒值仅是刺激的/,说明引起 的肺损伤明显轻于引起的肺损伤。综合以上数据我们得出结论手术并 不引起敲除小鼠明显的肺损伤。因此,小鼠术后的高 死亡率并不是由肺损伤引起的。 .敲除小鼠在脓毒症时炎症反应失控山东大学博士学位论文 机体在面临细菌感染时会迅速启动固有免疫产生大量的炎症因子作为机体 的第一道防线。但是这种失控地大量产生的炎症因子也是脓毒症死亡的一大原因 【。为了研究为什么敲除小鼠更易死于脓毒症,我们检测了术 后小鼠体内炎症因子水平。在术后、、、后取小鼠血清检测炎症因 子水平。如图所示,敲除小鼠和野生型小鼠在脓毒症时的炎症反应 有明显不同。野生型小鼠表现出典型的急性期反应,.和.在脓毒症早 期大量产生然后在接下来的时间水平逐渐降低。与野生型小鼠不 同, .敲除小鼠在脓毒症期间炎症因子的生成水平一直很高。.敲 除小鼠血清和.水平在术后内持续升高,并且在时比野 生型小鼠高.倍。这说明在没有的时候小鼠会在脓毒症时有持续的 难以控制的炎症因子产生。 在脓毒症时,是除细胞因子之外的另外一个固有免疫的重要成分。 在细菌感染时巨噬细胞上的表达会显著上调,产生大量的来杀菌和调 节免疫反应。但是过多的是有毒性作用的,会引起氧化应激导致细胞损 伤。我们已知.能通过与结合而抑制活性,而且 敲除小鼠在刺激后有表达的一过性下调【】。因此我们猜测 .敲除小鼠在脓毒症时会产生过多的。通过检测血清亚硝酸盐/硝酸 盐含量我们可以估测脓毒症时是否影响产生。出乎意料 的是敲除小鼠和野生型小鼠在脓毒症时有类似的产生。两组小鼠 在脓毒症早期.都迅速产生大量的,并在接下来的时间产 生逐渐下降图。这些结果说明脓毒症时.敲除小鼠死亡率较高的 原因并不是过多的产生。 之前有文章报道.可以通过对巨噬细胞的影响来调节炎症反应。 刺激可以上调巨噬细胞上.的表达【】。并且有研究证明. 可以抑制刺激时巨噬细胞产生的细胞因子,,。用和 腹腔巨噬细胞论证了抑制炎症因子产生,。作者还证明 对.信号传导通路有抑制作用。该作用是通过直接结合从而阻止 、 、 与和的联系,以及抑制/ 的活化而实现的。为了论证.在体内是否对巨噬细胞有影响,我们 用.敲除小鼠在脓毒症时有较高的细菌负荷 参与了胞吞和吞噬作用。一些体外实验证明参与了细菌 侵入细胞的过程,,。最近的一篇文章报道在感染铜绿假单胞菌时 .敲除小鼠有较多的细菌负荷【】。这些实验说明在脓毒症时 可能在细菌的清除过程中起到了一定作用。为了进一步研究.影 响脓毒 症的机制,我们检测了对细菌负荷的作用。我们用涂盘法计算 术后小鼠血液中的含菌量。如图所示,在术后,虽然因为小鼠个体 差异大差别无统计学意义.,.敲除小鼠仍然表现出较多的细 菌数的趋势。我们还检测了术后小鼠肝脏和脾脏中的含茵量。 敲除小鼠比野生型小鼠有明显更多的脏器含菌量图和。 在敲除小鼠中我们注意到一点,小鼠体内增强的炎症反应与减弱 的杀菌能力好像有所不一致。有两个重要的作用可以解释这个矛 盾现 象。用细胞和腹腔巨噬细胞论证了.抑制炎症因子产生 【,。巨噬细胞是体内细胞因子的主要来源,这就解释了脓毒症时. 敲除小鼠体内增强的全身炎症反应;用体外吞噬实验证明敲除小鼠 来源的腹腔巨噬细胞吞噬大肠杆菌的功能受损。巨噬细胞也是清除细菌的重 要成分。这种受损的吞噬细菌的能力就可以解释脓毒症时敲除小鼠体 内过多的细菌负荷。我们的实验揭示了在脓毒症时对机体细菌负荷的 影响。.是如何调节脓毒症时细菌的摄入和清除有待进一步研究。 脓毒症时.敲除小鼠胸腺细胞凋亡增多,淋巴细胞稳态失衡 通过对敲除小鼠的研究,人们发现.有抑制细胞增殖和 破坏组织稳态的作用。例如,.敲除小鼠的肺脏和心脏有细胞增多的现 象,,】。还有一些报道显示.对细胞凋亡也有调控作用。但是’ 山东大学博士学位论文 调控细胞凋亡还是有争议的,细胞类型不同和刺激物不同可能会产生 不同的结果。比如,用干扰抑制细胞的.蛋白表达可以 加强诱导的细胞凋亡【】;.敲除可以通过调节对高氧 引起的细胞凋亡有抑制作用。报道过用射线作为诱导凋亡的模 型, .敲除小鼠有更多的胸腺和脾细胞凋亡】。但也有报道阿霉素 诱导的心房内细胞凋亡需要的参与【】。淋巴细胞凋亡是脓毒症时一 个重要过程。.是否影响脓毒症时淋巴细胞凋亡还未有报道。 大量淋巴细胞凋亡是脓毒症时一大问题,】。有证据表明抑制凋亡会对 /和两种方法检测 脓毒症动物有保护作用【】。我们用 敲除小鼠和野生型小鼠在术后时淋巴细胞的凋亡情况。如图 所示,.敲除小鼠胸腺细胞凋亡明显增多,表现为 /‘的胸 腺细胞有倍增加图和。染色也得到相似的结论,.敲 除小鼠的胸腺细胞有倍增加图和。而且与野生型小鼠相比, .敲除小鼠胸腺细胞中亚群的比例降低,而‘‘和 。亚群的比例增加图,说明.敲除小鼠脓毒症时淋巴细 胞稳态失衡。虽然脾细胞凋亡在两组中没有差别图,敲除小鼠 脾淋巴细胞也有稳态失衡现象,表现为细胞比例增加,细胞比例 降低图。为了检测基础状态下.是否影响淋巴细胞稳态,我们分 析了没有做手术的小鼠的胸腺和脾细胞亚群的比例和细胞数,结果没有观 察到显著差异。说明.特异地调控脓毒症时淋巴细胞的凋亡和稳态。据 我们所知,这是第一个关于.是脓毒症时对淋巴细胞凋亡的一个负性调 节因子的报道。获得性免疫的组成细胞能负性调控最初的固有免疫,】。 敲除小鼠在脓毒症期间过多的淋巴细胞凋亡或许是使这种负性调控减 弱以至于炎症反应过强的原因。 凋亡是一个复杂的过程,有多种调控机制。凋亡信号通路中许多关键的分子 就位于中,如,肿瘤坏死因子受体盯,相关死亡结构 域蛋白,神经酰胺.。为这些信号分子的装配提供了一个平台。鉴 于.是形成的关键分子,能调控里的信号传导,我们 猜测.是通过调节里的信号传导来影响凋亡的。除了对凋亡信山东大学博士学位论文 号的直接调控,还可能参与了凋亡细胞的清除过程。用胸腺凋亡 胞的体外吞噬实验证明的缺失降低了腹腔巨噬细胞的吞噬能力】 因此敲除小鼠增多的胸腺凋亡细胞可能是巨噬细胞清除凋亡细胞的能 力减弱的结果。调节淋巴细胞凋亡的具体机制以及这个作用如何影响 炎症反应还有待进一步研究。 总而言之,我们用一种更接近临床的脓毒症模型来检测了 在脓毒症中的作用。我们的实验证明了在多种微生物引起的脓毒症中 是一个重要的生存要素。进一步的研究证明抗脓毒症的作用是通过调 节炎症反应、减少细菌负荷、抑制胸腺细胞凋亡等来实现的。我们的发现揭示了 .在脓毒症时的保护性作用,并为脓毒症的治疗提供了一个新的靶点。山东大学博士学位论文 结论 ..对脓毒症小鼠起到了保护作用,降低脓毒症小鼠的死亡率。 .抗脓毒症的作用是通过调节炎症反应、减少细菌负荷、抑制胸腺 细胞凋亡等来实现的。 .是较为理想的脓毒症动物模型。 山东大学博士学位论文 附图 图 ? 、一 罴 要 晶毋.之?;.×。 一西套,?~工山。、、一? 山东大学博士学位论文 图 一一,宁止卜一一,? 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