二维高效液相色谱法分析小儿清热止咳口服液中麻黄类.doc

二维高效液相色谱法分析小儿清热止咳口服液中麻黄类.doc 二维高效液相色谱法分析小儿清热止咳口 服液中麻黄类 【关键词】 多维高效液相色谱;,,离线;,,麻黄碱;,,伪麻黄碱;,,甲 基麻黄碱 摘要:目的探讨小儿清热止咳口服液中麻黄类生物碱的含量分 析方法。方法依据中药成分的复杂性和多样性，通过研制离线的二 维高效液相色谱系统，解决成分复杂的中药样品的分离和痕量组分 的定量问。一维柱为Agilent公司的Asahipak ODP50 (4.0 mm× 125 mm)，5 μm 粒径，二维柱为八方公司的Aichrom BondAQ C18 (4.6 mm×250 mm)，5 μm 粒径;缓冲溶液为20Mmol的 KH2PO4，用H3PO4和三乙胺调pH值为2.7;一维及二维的流动相 均为缓冲溶液/乙腈(97/3，V/V)，流速为0.8 ml/min;柱温为 30?;DAD检测器的检测波长为210 nm。结果麻黄碱、伪麻黄碱 和甲基麻黄碱在进样量分别为0.36,3.6 μg，0.34,3.5 μg， 0.32,3.3 μg范围内进样量与峰面积线性关系良好，平均回收率分 别为97.4%，98.6% 及100.2%。结论 中药样品的分离明显改善， 并且这个系统可用于中药的直接进样分析。 关键词:多维高效液相色谱; 离线; 麻黄碱; 伪麻黄碱; 甲基麻黄碱 Abstract:ObjectiveTo estabish a methad for determination of ephedrine alkaloids in xiaoerqingrezhike Oral Liquid. Methods2D-HPLC system ns of tensions n (4.0 mm×125 mm, 5μm) and Aichrom Bond-AQ C18 column (4.6 mm×250mm，5 μm) respectively . Separation of both dimensions ed obile phase of Acetonitrile-0(02 mol・L -1 KH2PO4 (pH ine) ( 3:97, volume ratio). Flol/min , column temperature (ResultsThe linear range for ephedrine、pseudoephedrine and methylephedrine ethylephedrine aceutical has been substantially improved, and the technology is suitable to analys traditional Chinese medicine ensional HPLC，MD-HPLC)利用两个或更多的色谱柱对复 杂样品中的待分析组分进行分离，在柱之间利用切换阀将经过初次 分离的全部或部分组分选择性地转入另一根或多根不同类型的色谱 柱中进一步分离,1~6,。与常规的单柱分离相比，该技术具有更高 的选择性、更大的峰容量和更好的分辨率。该技术操作简单，弥补 了常规单柱色谱的不足，是一种具有发展潜力的分离分析方法。麻 黄碱类药物，麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱具有相似的结构，其 中麻黄碱和伪麻黄碱属于同分异构体，是中药麻黄的主要有效成 分。麻黄类药物在临床上广泛用于治疗伤风、哮喘和过敏等症。许 多含麻黄的中成药、中西复方制剂中都含有麻黄碱类药物 ,7~10,。目前有关麻黄碱类生物碱的报道已有很多，但由于中药样品中所含物质成分复杂，药物含量极低，直接进样分析困难。采用二维色谱技术可以实现中药样品直接进样分析，过程简单，结果准确。 1 器材 Agilent 1100系列高效液相色谱仪由脱气机，双元泵，自动进样器，柱温箱及二极管阵列检测器和化学工作站组成。其中柱温箱具有六通切换阀、可进行柱切换。对照品:麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱均购自中国药品生物制品检定所;样品为郑州市协和制药厂生产的小儿清热止咳口服液;实验用水为娃哈哈纯净水，用0.45 μm的微孔过滤膜过滤;KH2PO4，H3PO4，三乙胺为分析纯;甲醇和乙腈为色谱纯。 2 方法与结果 2.1 对照品与样品制备精确称取适量麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱对照品，置50 ml容量瓶中加纯水至刻度，摇匀，配制成浓度分别为450，436，412 mg/L的溶液。取10 ml小儿清热止咳口服液，置50 ml容量瓶中加纯水至刻度，摇匀，经0.45μm的微孔过滤膜过滤。所有样品保存于4?冰箱中备用。 2.2 色谱条件色谱柱为一维柱为Agilent公司的Asahipak ODP50 (4.0 mm×125 mm)，5μm 粒径，二维柱为八方公司的Aichrom BondAQ C18 (4.6 mm×250 mm)，5μm 粒径;缓冲溶液为20Mmol的KH2PO4，用H3PO4和三乙胺调pH值为2.7;一维及二维的流动相均为缓冲溶液/乙腈(97/3，V/V)，流速为0.8 ml/min;柱温为30?;DAD检测器的检测波长为210 nm。先将样品在第一维色谱柱中进行预分离，然后利用六通阀进行柱切换，将第1维分离后感兴趣的组分切换至第二根色谱柱，第1维柱中不感兴趣的组分被洗脱走，然后在第二维色谱柱中将感兴趣的组分进行进一步分离。 2.3 样品测定及色谱图按上述色谱条件对小儿清热止咳口服液样品及标准品进行2DHPLC分析，其二维的色谱图见图1。与标样混合物的色谱图比较，可知峰1~3分别对应麻黄碱、伪麻黄碱及甲基麻黄碱。同时用二极管阵列检测器在线扫描各个峰的紫外光谱，发现各个峰对应的紫外吸收峰符合麻黄类生物碱的紫外吸收特征。 a标样的二维色谱图 b小儿清热止咳口服液的二维色谱图 1.麻黄碱 2.伪麻黄碱 3.甲基麻黄碱 图1 标样及小儿清热止咳口服液的二维色谱图(略) 2.4 麻黄类生物碱的工作曲线分别取上述标准溶液0.5，1，3，4，5 ml配制成一系列质量浓度的标准混合溶液，用峰面积(Y)对质量浓度(X，mg/L)作回归分析得到3种麻黄类生物碱的回归方 程、相关系数、线性范围及最低检出限(S/N=3)列于1中。从表1可知，麻黄类生物碱的线性相关性较好。 2.5 小儿清热止咳口服液中麻黄类生物碱的测定按上述色谱条件对将所配制的小儿清热止咳口服液样品作HPLC分析，测得麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱的含量分别为:470.01 ，145.33，41.46 mg/L 。 2.6 精密度实验在上述色谱条件下，用同一麻黄类生物碱的混合标准溶液进样分析，共进样5次，进样40 μl/次，测定它们的峰面积，并求得峰面积的相对标准偏差(RSD)如表2所示。 表1 麻黄类生物碱标准品的标准曲线(略) 表2 样品5次测定的标准偏差(略) 2.7 回收率实验采用加样回收实验。在已知含量的样品中，分别精确加入3种不同质量浓度的麻黄碱标准溶液，同样按样品分析方法进行测定，测得样品回收率见表3。从表3看出，样品回收率较高。 表3 回收率测定结果(略) 3 本实验采用2DHPLC法测定了小儿清热止咳口服液中麻黄类生物碱的含量。由于中药样品中所含物质成分复杂，药物含量极低,直接进样分析困难。采用我们自己研制的离线的多维高效液相色谱技术，可以实现中药样品的直接进样分析,过程简单,结果准确。