硫化氢与大鼠大脑中动脉舒张EDHF机制的关系 精灵论文

硫化氢与大鼠大脑中动脉舒张EDHF机制的关系 精灵 硫化氢与大鼠大脑中动脉舒张 EDHF 机制的 关系 周方杰，陈志武 (安徽医科大学药理学教研室，合肥 230032) 摘要:目的:探讨硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)与大鼠大脑中动脉(middle cerebral artery， dothelium-derived hyperpolarizing factor，EDHF) MCA)舒张作用的内皮源性超极化因子(en 机制的关系。方法:应用离体血管舒缩功能测定方法，检测乙酰胆碱(acetylcholine，ACh) )硫氢化钠(sodium hydrosulfide，NaHS))L-半胱氨酸(L-cysteine，L-Cys)对大鼠离体 MCA 的舒张作用。血管用 NO 合酶抑制剂(L-NAME，3×10-5 mol/L)和 PGI2 合酶抑制剂 (Indo，1×10-5 mol/L)预处理后，用 ACh 诱导血管产生非 NO、非 PGI2 舒张反应。结果: 在 30 mmol/L KCl 收缩的大鼠 MCA 上，ACh (10-7,10-4.5 mol/L)可浓度依赖性舒张大鼠 MCA，血管用 L-NAME (3×10-5 mol/L)和 Indo (1×10-5 mol/L)预处理后，ACh 对 MCA 仍 具有明显的舒张作用 (P<0.01)。在 1×10-3 mol/L 浓度时具有阻断钙激活钾通道的四乙胺 (tetraethylammonium，TEA)或内源性 H2S 合成酶——胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ -lyase, CSE)的抑制剂——DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine，PPG，1×10-4mol/L)均 可明显取消 ACh 诱导大鼠 MCA 的这种非 NO、非 PGI2 介导的舒张。NaHS (10-5,10-2.5 mol/L，H2S 供体)可浓度依赖性舒张 MCA，但可被 1×10-3 mol/L TEA 显著地抑制;L-Cys (10-5,10-2.5 mol/L，CSE 底物)也可诱导 MCA 舒张，但去除血管内皮或 PPG(1×10-4 mol/L) 可显著抑制 L-Cys 的舒张作用。结论:在大鼠 MCA 中，ACh 诱导的非 NO、非 PGI2 舒张 反应，即 EDHF 反应可能是 H2S 介导的。 关键词: 内皮依赖性超极化因子;大脑中动脉;血管舒张;钙激活钾通道;硫化氢 Relation of hydrogen sulfide to the mechanism of EDHF-mediated dilation in rat middle cerebral artery Zhou Fangjie, Chen Zhiwu (Dept. of Pharmacology, Anhui Medical University，Hefei 230032) Abstract: Objective To study relation of hydrogen sulfide (H2S) to the mechanism of endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF)-mediated dilation in rat middle cerebral artery (MCA). Methods: The relaxant effects of acetylcholine (ACh), sodium hydrosulfide (NaHS) and L-cysteine (L-Cys) on isolated rat MCAs were detected by vasomotoricity experiment in vitro, respectively. Non-NO-non-PGI2 relaxation was induced by ACh in the presence of Nω-nitro-L–arginine-methyl-ester (L-NAME) and indomethacin (Indo). Results: In the isolated rat MCAs preconstricted by 30 mmol/L KCl, ACh (10-7-10-4.5) had the concentration-dependent relaxation, the ACh-induced vasorelaxation was partly inhibited in the presence of 3×10-5mol/L L-NAME and 1×10-5 mol/L Indo, but the left relaxation was still significant. ACh-induced vasorelaxation in the presence of L-NAME and Indo was almost abolished by tetraethylammonium (TEA, an inhibitor of calcium-activated K+ channels at 1×10-3 mol/L) or 1×10-4 mol/L DL-propargylglycine (PPG, an inhibitor of endogenous synthesis of H2S). NaHS, a donor of H2S, at the range of 10-5 , 10-2.5 mol/L, had the concentration-dependent relaxation, NaHS-induced vasorelaxation was abolished by 1×10-3 mol/L TEA. In the endothelium-intact rat MCAs, L-Cysteine 基金项目:高等学校博士点专项科研基金(20070366005);国家自然科学基金(30840104) 作者简介:周方杰(1985-)，女，硕士研究生，心脑血管药理学 通信联系人:陈志武(1963-)，男，教授，博士生导师，心脑血管药理学. E-mail: wzcxiong@mail.hf.ah.cn led to a concentration-dependent relaxation that was prevented by 1×10-4 mol/L PPG. However, L-Cys lost relaxation in the endothelium-denuded rat MCAs. Conclusion: In the rat MCA, ACh-induced non-NO- non-PGI2 relaxation, the so-called EDHF dilation might be mediated by H2S. Key words: endothelium-derived hyperpolarizing factor; middle cerebral artery; vasorelaxation; calcium-activated K+ channel; hydrogen sulfide 0 引言 血管内皮受到有效的刺激后,内皮细胞可以产生分泌一氧化氮(nitric oxide, NO))前列 环素(prostacyclin, PGI)和 EDHF 等舒张物质，它们和内皮素)血栓素 A(thromboxane A， 222[1]TXA)等血管收缩因子共同作用，调节血管局部的紧张程度和血流量，其中 NO 和 PGI发 22 现较早,其性质和作用机制均得到广泛而且透彻的研究,但有关 EDHF，尤其在脑血管中的作 用研究还很少。 [2][3]EDHF 系由血管内皮细胞在血管的切应力或一些激动剂如 ACh、缓激肽(bradykinin , [4][4][5]BK)、P 物质(substance P, SP)、ATP等刺激时产生。EDHF 由内皮细胞释放后，可作 用于血管平滑肌细胞，使之发生超极化并产生舒张。目前研究表明从动物到人类的很多血管 上均有 EDHF 反应的存在，但对 EDHF 的化学本质，尤其是脑血管中的 EDHF 尚不清楚。 硫化氢(hydrogen sulfide , HS)长期以来一直是被看成是对机体有害的气体分子。目 2 [6]前有大量研究表明 HS 是机体中气体信号家族的重要的一员,与 NO、一氧化碳一起被称 2[7]为“三人执政”。在哺乳动物细胞中，合成 H S 的酶主要有胱硫醚-β-合成酶 2 (cystathionine-β-synthase, CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)。CBS 存在神 [8]经细胞中,而 CSE 是心血管系统中产生 HS 的唯一的酶。CSE 不仅在血管平滑肌细胞中表 2[9]达，但近来也发现其在血管内皮细胞中的表达。本文就大鼠 MCA 中 EDHF 介导的舒张作 用与 HS 的关系进行了研究。 2 1 材料与方法 1.1 药品与试剂 乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)、吲哚美辛(indomethacin, Indo)、左旋硝基精氨酸甲酯 (Nω-nitro-L–arginine-methyl-ester, L-NAME)、四乙胺(tetraethylammonium，TEA)、硫氢化钠 (NaSH)、L-半胱氨酸(L-cysteine, L-Cys)、DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine, PPG) 均购自 sigma 公司;氯化钾( KCl)，由汕头市西陇化工厂出品;水合氯醛由中国上海白鹤化 工厂出品。 1.2 动物 SD 大鼠，雌雄各半，体重为 250,280g，均由安徽医科大学实验动物中心提供， 动物 合格证号:SCXK(皖)2005-001;实验室饲养温度:22 ? 3?。 1.3 方法 SD 大鼠，10%水合氯醛麻醉后，断头取出脑组织放入冰浴的生理盐溶液(physiological salt solution, PSS)中(mM:119 NaCl,4.7 KCl,24 NaHCO,1.18 KHPO,1.17 MgSO,0.026 3244 EDTA,1.6 CaCland 5.5 glucose,pH 7.4)，仔细分离出大脑中动脉(middle cerebral artery，2 MCA)，制成 5 mm 长的血管环片段，将该段 MCA 环置入血管灌流槽中，将两个拉制的微 量玻璃管套入 MCA 的两端，用 10-0 尼龙线将 MCA 结扎固定在微量玻璃管上，并结扎血管 分支以确保无渗漏。然后用通入含有 95%O+ 5%CO%混合气体的 37?的 PSS 液加压灌注 2 2 MCA 的血管内腔，灌注压:85 mmHg，灌注液流量:150 μl/min。在 MCA 的管腔外侧，即血管灌流槽中用通入同样气体的 37?的 PSS 液灌流。血管标本平衡 1h 后，在血管内腔的灌 流液中加入收缩剂 30 mmol/L KCl，待血管收缩恒定后，在血管内腔的灌流液中加入相应的 受试药品，在体视显微镜下观察测量并利用数码相机血管灌流槽中 MCA 的血管直径， 通过 MCA 的直径变化来研究药物的舒张或收缩血管作用。血管舒张率用下列公式计算: 血管舒张率(%) = ( D- D)/( D- D)×100 % x min max min D:血管平衡 1 h 时的直径，D:加入收缩剂后血管收缩稳定时的直径，D:加入 maxminx各浓度舒张剂后的血管直径。 实验按下列分组进行: 1.3.1 ACh 对大鼠 MCA 的舒张作用 -7- 4.5 在 30 mmol/L KCl 收缩大鼠 MCA 血管内腔中，用含 10,10mol/L ACh 的 PSS 液 持续灌流，观察 ACh 对血管的舒张作用。 1.3.2 ACh 诱导的大鼠 MCA 的非 NO 、非 PGI舒张反应 2 -5 -5 用含 3×10mol/L L-NAME 和 1×10mol/L Indo 的 PSS 液预灌流大鼠 MCA 血管内腔 30 min 后，再按上述方法观察 ACh 的舒张作用。 1.3.3 TEA 和 PPG 对大鼠 MCA 非 NO、非 PGI反应的影响 2 -5 -5 在血管内腔灌流液中加入 3×10mol/L L-NAME、1×10mol/L Indo 和 K通道阻断剂 Ca -4 TEA(1 mmol/L)或 CSE 抑制剂 PPG(1×10mol/L)预灌 30min 后，再观察 ACh 对大鼠 MCA 的舒张作用。 1.3.4 NaHS 对大鼠 MCA 舒张作用及 TEA 对其的影响 -5-2.5 按上述方法观察 10-10mol/L NaHS 对大鼠 MCA 的舒张作用，并观察其舒张作用能 否被预灌流 1 mmol/L TEA 所影响。 1.3.5 L-Cys 对大鼠 MCA 舒张作用及去内皮和 PPG 对其的影响 -5-2.5按上述方法观察 L-Cys(10-10mol/L)对大鼠 MCA 的舒张作用。另设二组分别观察 其舒张作用能否被去内皮或预灌流 1 mmol/L TEA 所影响。 1.4 统计学处理 实验数据均以均数?标准差( x ? s)表示，采用单因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)进行组间两两比较。P<0.05 表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 ACh 对大鼠 MCA 的舒张作用及其非 NO 非、PGI机制 2 如图 1 所示，在用 30mmol/L 的 KCl 预收缩的大鼠 MCA 上，ACh 可产生浓度依赖性 的舒张作用，最大舒张率为 75.4 ? 9.0%，与溶媒组比较有显著性差异(P<0.01)。在血管 -5 -5 内腔灌流液中加入 L-NAME (3×10mol/ L)和 Indo (1×10mol/ L)预灌注 30 min 后，ACh 的舒张作用被减弱，但较未加阻断剂组比较仍有明显的舒张作用，其最大舒张率为 57.2 ? 9.1%，与溶媒组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结果表明，在排除了 NO 和 PGI的舒 2 张作用后，ACh 诱导大鼠 MCA 产生了非 NO、非 PGI介导的舒张作用。 2 图 1 ACh 对 30 mmol/L KCl 预收缩的大鼠 MCA 非 NO、非 PGI介导的舒张反应( x ? s，n=6)。L-NAME: 2 **#30 μmol/L，Indo:10 μmol/L;P<0.01 vs vehicle;P<0.05 vs ACh。 Fig 1 ACh-induced non-NO- non-PGIrelaxation in rat MCAs preconstricted by 30 mmol/L KCl ( x ? s, n=6).2 **#L-NAME: 30 μmol/L, Indo: 10 μmol/L; P<0.01 vs vehicle; P<0.05 vs ACh. 2.2 TEA 对大鼠 MCA 非 NO 非 PGI反应的影响 2 -5 -5 如图 2 所示，在血管内腔灌流液中加入 3×10mol/L L-NAME、1×10mol/L Indo 及 TEA -3 (1×10mol/L)预灌 30 min 后，ACh 对 30 mmol/L KCl 预收缩大鼠 MCA 的舒张作用几乎 被完全取消，其最大舒张率从 57.2 ? 9.1%降至 5.6 ? 3.5% (P<0.01)。 2.3 PPG 对大鼠 MCA 非 NO、非 PGI反应的影响 2 -4 如图 2 同时表明，ACh 对大鼠 MCA 的非 NO、非 PGI舒张作用也可被 1×10mol/L 的 2 PPG 显著抑制，其最大舒张作用从 57.2 ? 9.5%降至 9.3 ? 5.4% (P<0.01)。 图 2 TEA 和 PPG 对非 NO、非 PGI介导的大鼠 MCA 舒张反应的影响( x ? s，n=6)。L-NAME:30 μmol/L， 2 **##Indo:10 μmol/L，TEA:1 mmol/L，PPG:100 μmol/L;P<0.01 vs vehicle，P<0.01 vs ACh + L-NAME + Indo。 Fig 2 The Effects of TEA and PPG on the non-NO-non-PGI-mediated relaxation in rat MCAs ( x ? s, n=6).2**##L-NAME: 30 μmol/L, Indo: 10 μmol/L, TEA: 1 mmol/L, PPG: 100 μmol/L; P<0.01 vs vehicle, P<0.01 vs ACh + L-NAME + Indo. x 图 3 NaHS 对 30 mmol/L KCl 预收缩的大鼠 MCA 舒张及 TEA(1 mmol/L)对其作用的影响( ? s，n=6)。 **## P<0.01 vs vehicle，P<0.01 vs NaHS。 Fig 3 NaHS-induced relaxation in rat MCAs preconstricted by 30 mmol/L KCl and the effect of 1 mmol/L TEA **##on the vasorelaxation ( x ? s, n=6). P<0.01 vs vehicle, P<0.01 vs NaHS. 2.4 NaHS 对大鼠 MCA 的舒张作用及 TEA 对其作用的影响 如图 3 所示，在 KCl(30 mmol/L)预收缩的大鼠 MCA 上，HS 的外源性供体 NaHS 可 2 产生浓度依赖性的舒张作用，其最大舒张率为 73.3 ? 6.3%，与 Vehicle 组比较有显著的差异 -3 (P<0.01)。加入 K通道阻断剂 TEA(1×10mol/L)预灌流处理后，NaHS 舒张作用几乎被 Ca 完全取消(P<0.01)，最大舒张率降至 5.9 ? 4.2%。 2.5 L-Cys 对内皮完整和去内皮大鼠 MCA 舒张及 PPG 对其作用的影响 在 30 mmol/L KCl 预收缩的大鼠 MCA 上，HS 的生成底物——L-Cys 可产生浓度依赖 2 性的舒张作用，其最大舒张率为 78.0 ? 7.3%，与 Vehicle 组比较有显著性差异(P<0.01)(图 -4 4)。但去除血管内皮血管或加入 1×10mol/L PPG 预灌 30 min 后，L-Cys 对 MCA 舒张作 用几乎被完全抑制(P<0.01)。 图 4 L-Cys 对内皮完整(+Endo)及去除内皮(-Endo)的大鼠 MCA 舒张及 100 μmol/L PPG 对其作用的 **##影响( x ? s，n=6)。P<0.01 vs vehicle;P<0.01 vs L-Cys (+Endo)。 Fig 4 L-Cys-induced relaxation in the endothelium-intact and -denuded rat MCAs and the effect of 100 μmol/L **##PPG on the vasorelaxations ( x ? s, n=6). P<0.01 vs vehicle, P<0.01 vs L-Cys (+Endo). 3 讨论 EDHF 的出现打破了血管内皮只通过 NO 和 PGI两种舒血管因子调节血管舒张的局面 2 [10]。EDHF 对包括人类等不同物种的不同血管均有明显的舒张作用，在心血管功能调节方面 有着重要作用。但由于对 EDHF 的化学本质的认识尚不十分清楚，因此，目前文献资料对 EDHF 功能的研究主要采用生物学功能测定的方法，即合用 NO 合酶和 PGI合成酶的抑制 2 剂以抑制 NO 和 PGI合成，排除了 NO 和 PGI作用后，观察 ACh)缓激肽或 ATP 等诱导 2 2 [11]血管的非 NO、非 PGI介导的舒张，即所谓的 EDHF 介导的舒张反应。 2 [12-13]虽然 HO及 EETs 等在许多物种的许多外周血管中已被证明具有 EDHF 样作用， 22 [14-15]但脑血管中 EDHF 反应与外周血管中 EDHF 反应有着较大的差异。在外周血管中具有 [3][16] EDHF 样作用的物质，在脑血管中却不一定也具有同样的作用，You和宋标等分别观察到大鼠 MCA 和脑基底动脉中 EDHF 的作用并不涉及到 HO，也不涉及 HO。 2222[7]HS 是继 NO 和 CO 之后发现的一种新的气体信号分子。心血管系统的 HS 主要由 22[8]CSE 催化 L-Cys 生成。Cheng 等发现，HS 和 NaHS 均能对在体外灌流的大鼠肠系膜动脉 2 段产生浓度依赖性的舒张作用，并且其舒张作用可被合用 K通道阻断剂 charybdotoxin 和 Ca [17]apamin 后或去除内皮显著减弱。HS 的这些作用较为符合 EDHF 的特征，并且在大鼠脑 2[18]基底动脉上，我们基本上已经证明 HS 可能为该血管中的 EDHF。 2 在大鼠 MCA 上，本研究观察到了 ACh 有明显的血管舒张作用，并且经 L-NAME 和 Indo 预处理后，ACh 仍具有一定的舒张作用。EDHF 反应的重要特征之一是可被 K通道阻断剂 Ca +[19-20]取消，TEA 为 K通道非选择性阻断剂，但在 1 mmol/L 时能特异阻断 K通道。本研究 Ca 进一步观察到 ACh 对大鼠 MCA 诱导的非 NO、非 PGI介导的舒张可为 1 mmol/L 的 TEA 2 所抑制，结果表明 ACh 可诱导大鼠 MCA 产生 EDHF 介导的舒张，这与 You 等在大鼠 MCA [3]观察的结果是一致的。 本研究发现 ACh 诱导的大鼠 MCA 的非 NO、非 PGI介导的舒张反应不仅为为 1 mmol/L 2 的 TEA 所抑制，也可为内源性 HS 合成酶——CSE 的抑制剂 PPG 所取消，提示着大鼠 MCA2 上的 EDHF 反应涉及到了 HS。是否与大鼠脑基底动脉一样，大鼠 MCA 中的 EDHF 反应也 2 是由 HS 所致,在大鼠 MCA 上，本研究首次发现，外源性 HS 的供体—NaHS 有舒张作用， 22 并可被 1 mmol/L TEA 显著抑制。HS 的合成底物 L-Cys 对大鼠 MCA 也有舒张作用，但去 2 除血管内皮或 PPG 可显著抑制 L-Cys 的舒张作用，提示 L-Cys 对 MCA 的舒张作用是内皮 S 还是内皮合成的 依赖性的，并且是通过生成 HS 而产生的。这些结果表明无论外源性 H22 内源性 HS 对大鼠 MCA 均有明显的舒张作用，并为 K通道抑制剂抑制，提示在大鼠 MCA 2Ca 上，HS 较为符合 EDHF 的特征。这与前述大鼠 MCA 上的 EDHF 介导的舒张反应涉及到 2 HS 也正是一致的。 2 综上所述，在大鼠 MCA 中，ACh 介导的非 NO、非 PGI反应，即 EDHF 反应可能是2 HS 介导的。 2 参考文献 [1] 李景文, 龙 村. 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