【doc】食品中金黄色葡萄球菌单增李斯特氏菌和副溶血性弧菌的MPCR法检测

【doc】食品中金黄色葡萄球菌单增李斯特氏菌和副溶血性弧菌的MPCR法检测 食品中金黄色葡萄球菌单增李斯特氏菌和 副溶血性弧菌的MPCR法检测 一 25一中国动物检疫2006年第23卷第2期 文章编号:1005—944X(2006)02—0025—04 食品中金黄色葡萄球菌单增李斯特氏茵 和副溶血性弧茵的MPCR法检测 何浩罗公平')苏永泉徐贵升张健昊永生邹殿文 (黑龙江省绥芬河出入境检检疫局绥芬河157300) 摘要:为快速检测食品中的金黄色葡萄球菌(sA),单增李斯特氏茵(LM)和副溶血性弧茵(VP).根据各茵 的相关基因引物.分别扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因-rluc单增李斯特氏茵溶血素.上的hlyA 基因和副溶血性弧茵的热稳定直接溶血素基因一tdh,建立一种MPCR快速检测食品中致病茵的.结果 明,三条特异性扩增片段分男1】为279bp,243bp和202bp.经DNA测序证明其序列与模板被扩增片段一致.该 方法具有良好的灵敏性和特异性 关键词:MPCR;金黄色葡萄球茵;单增李斯特氏茵;副溶血性弧茵 金黄色葡萄球菌(Staphylococ. CUSaureus),单增李斯特氏菌(Lis teriamonocytogenes)和副溶血性弧 菌(Vibrioparahaemolyticus)均是分 布极为广泛的致病菌.由这些细菌 引起的食物中毒严重危害人体健康 ] .是食品安全卫生中的重要检测 项目. 金黄色葡萄球菌产生多种毒素 和酶.可引起食物中毒或感染,发生 频率较高,临床资料表明,由该菌引 起的发病率逐年上升.并有升高的 趋势.尤其是引起儿童全身性感染 的最主要病原菌[6]:单增李斯特氏 菌是胞内致病菌,新生儿,孕妇,老 年人,体弱者,免疫功能低下及接受 免疫抑制治疗的人群.发生李斯特 氏菌食物中毒的机会较多.李氏 溶血素0与内毒素是单增李斯特 氏菌最主的致病因子与侵袭性因子 [8]:副溶血性弧菌是嗜盐性海洋细 菌【9].人们常因食用带有大量该菌 的海产品而致病.我国沿海地区由 副溶血性弧菌引起的食物中毒占食 物中毒人数的2O%左右[1.该菌的 主要致病因子是其产生的多种溶血 毒索,主要有不耐热溶血素(TLH). 耐热直接溶血素(TDH)和相对耐热 溶血素(TRH)[Ill 我国对致病菌的检验仍沿用传 1)黑龙江出入境检验检疫局哈尔滨150001 统的细菌培养及鉴定方法.检验步 骤繁琐.检验周期长,检验灵敏度 低.应用PCR法可克服以上缺点. MPCR方法可同时检测多种致病 菌,快速,简便,灵敏度高. 1材料和方法 1.1试验材料 1.1.1菌种 试验用菌株(表1)分别购 自哈尔滨医科大学,北京陆桥公司, 中国药品生物制品检定所和中科院 微生物研究所 1.1.2试剂 细菌培养基购自北京陆桥公 司.TaqDNA聚合酶,10xPCR buffer,Marker,Tris,EDTA,HCl,乙 酸,EB及琼脂糖等购于上海博亚生 物工程公司.细菌DNA提取试剂盒 购于华舜生物工程公司. 1.1.3引物 根据金黄色葡萄球菌编码耐热 单增李斯特 核酸酶的nuc基因【l2】, 氏菌溶血素O上的hlyA031和副溶 血性弧菌的热稳定直接溶血素 (tdh)基因04基因分别设计三对引 物.由上海博亚生物工程公司合成. 表1试验用标准菌株 目的细茵引物序列长度(bp)扩增长度(bp) 中国动物检疫2006年第23卷第2期一26— 1.1.4仪器 PCR仪:TGL一16G高速离心 机;DYY一2电泳仪;Imagemaster. VDS影像分析摄录系统 GeneQuant11pharmaciaBiotech 定量仪 1.2试验方法 1.2.1菌株培养 用GB4789相关方法将各冻干 菌株用相应的增菌液进行增菌,纯 培养,计数 1.2.2DNA模板的制备 热裂解法提取DNA 试剂盒法提取DNA采用华舜 公司的细菌DNA提取试剂盒 1.2.3DNA定量 用GeneQuantIIpharmacia Biotech定量仪定量DNA的浓度. 1.2.4特异性试验 分别用每对引物扩增目的菌株 及表1中其它所有菌株.观察各对 引物的特异性并摸索单重PCR的 最佳反应条件.同时应用三对引物. 扩增表l中所有菌株.观察多重 PCR条件下引物的特异性.并摸索 最佳反应条件.将扩增产物测序.确 定特异性 PCR反应体系: 模板DNA3l(三种菌各1) 0.2uM/L引物3(E~ff~l物各1) 2.5mM/LdNTP6Ixl 5U/Taq酶1Ixl 10xPCRbuffer10lxl(含M) 用去离子水补充至总体积100 l. 反应条件:95?预变性5min: 94?变性lmin;55oC退火45S:72oC 延伸lmin;此过程35个循环:72? 延伸10min,4~C保存. PCR结果检测: 配制1.6%琼脂糖凝胶.100 ml,加5l的10I~l/ml的EB,使之 终浓度为0.5~l/ml,将4l的扩增 液与1l溴酚兰载样液混合加样, 以DL2000的Marker为标准.以10 V/cm电压电泳30—40min.用凝胶 成像分析仪分析 1.2.5灵敏性试验 将三种菌的DNA做l0倍递增 稀释.并采用上述PCR方法扩增观 察灵敏度 1.2.6模拟试验 将金黄色葡萄球菌,单增李斯 特氏菌和副溶血性弧菌增菌液加入 到种菌均为阴性的鳕鱼片中.均 质后增菌,做PCR检测其灵敏性. 并与常规方法比较.验证MPCR方 法的可行性和实用性 2结果与分析 2.1特异性试验及方法建立 用上述引物成功实现对金黄色 葡萄球菌,单增李斯特氏菌,副溶血 性弧菌的扩增.各引物分别扩增目 的菌株及多对引物同时扩增目的菌 株均为特异性扩增.阴性对照无扩 增产物.金黄色葡萄球菌的扩增产 物为279bp.单增李斯特氏菌的扩 增产物为243bp,副溶血性弧菌的 扩增产物为202bp(见图l,图2). 将扩增产物回收.经测序证明与模 板扩增片段相符.进一步证明该反 应的特异性 扩增结果显示.试剂盒提取 DNA比热裂解法产量高因为杂质 对Taq聚合酶有抑制作用.影响扩 增结果,因此DNA的提取应注意去 除杂质 2.2敏感性试验 经测定SA浓度为47.8ug/m1. VP浓度为74.9ug/m1.LM浓度为 5O.0ug/ml.将模板1O倍递增稀释. 直到l0s,用2.1建立的方法扩增. 同时做阴性对照在103时可见清 晰的扩增条带.104处条带模糊不 清.105和阴性对照处则没有条带出 现.见图3.稀释到103时三种菌的 浓度分别为SA:0.048ug/ml,VP: 0.075ug/ml和LM:0.050ug/m1.此 为该反应体系中的最小检出浓度 2.3模拟试验 取SA,VP和LM三种菌加入 到三种菌为阴性的鳕鱼片中.将污 染样品的增菌液梯度稀释并培养计 数,同时做PCR检测,用来评价 M1234 2000bp 5OObp 250bp lt)0bp M:DL2fX)0DNAMarker; 1,SA;2,LM;3,VP; 4,阴性时照(包括SA,LM,VP'-对引物) 图1各引物单重PCR特异性 12M ?I_一2000bp ?I_一1000bp ?I_一500bp ?I_一2S0bp ?I_一100bp 1,阴性对照: 2,SA,LM,VP三时引物扩增所有茼株; 3,M:DL2000DNAMarker 圈2多重PCR检测sA,VP,LM的特异性 1234567M ..一2ooo~ 一t000bp 一5(~bp ..I-一200bp ?100bp 1,阴性对照; 2,SA:0.48ng/ml,VP:0.75ng/ml,LM:0.50ng/ml; 3,SA:4.8ng/ml,VP:7.5ng/ml,LM:5.0ng/ml; 4,SA:48ng/ml,VP:75ng/rnl,LM:50ng/ml; 5,SA:OASug/ml,VP:0.75ug/ml,LM:0.50ug/ml; 6,SA:4.Sug/ml,VP:7.5ug/ml,LM:5,(hag/ml; 7,SA:48ug/ml,VP:75ug/ml,LM:50ug/nd; M:DL2000DNAMarker 图3多重PCR检测sA,VP,LM的灵敏性 一 27一中国动物检疫2006年第23卷第2期 MPCR对样品的检测结果结果显 示MPCR方法对样品中金黄色葡 萄球菌最低检测限为l1个细菌/g, 每PCR反应体系中金黄色葡萄球 菌的最低检测限260个细菌:对样 品中单增李斯特氏菌的最低检测限 为l4个细菌/g,每PCR反应体系 的最低检测限为310个细菌:对样 品中副溶血性弧菌的最低检测限为 l2个细菌/g,每PCR反应体系的最 低检测限为220个细菌 3讨论 引物的设计与选择是多重PCR 成功与否的关键.引物设计首先要保 证其特异性本试验中三对引物均选 白目的菌株的致病基因.金黄色葡萄 球菌的致病性源于其产生的毒素和 酶类.其中耐热核酸酶由nuc基因编 码.该基因为金黄色葡萄球菌所特有 而且序列高度保守:单增李斯特氏菌 的主要致病因子是李氏溶血素O与 内毒素.溶血素O上的基因hlyA高 度保守且特异性强:副溶血性弧菌的 致病性与其产生的不耐热溶血素 (TLH),耐热直接溶血素(TDH)和相 对耐热溶血素(TRH)有关.其中以 TDH为主.编码TDH毒素的基因为 tdh.TDH阳性株即神耐川试验阳性 株.国标GB4789.7中要求神耐川试 验阳性.故选择tdh基因设计引物. 三对引物扩增片段长度分别为279 bp,243bp,202bp,均为特异性片段. 多重PCR引物设计过程中不 仅要考虑其特异性.而且要尽量使 多对引物的退火温度一致.并且避 免同对引物或多对引物之间形成引 本试验在引物设计时使 物二聚体. 各引物的退火温度保持在55c【=.G+ C%的的含量在4O%一50%之间三 对引物之间不存在3端配对.并 尽可能地减少引物之间多个连续碱 基的同源性,相对减少了引物二聚 体的出现机率 在PCR体系的设计上.采用了 低引物浓度(0.2uM/L).低DNTP浓 度(0.15uM/L).以尽可能减少非特 异性扩增产物及引物二聚体的出 现.酶的浓度控制在1U/100l一 3U/100l,过高容易产生非特异性 扩增.过低则明显影响靶序列的产 量本试验中多重PCR体系中各菌 的最低检测限比单重PCR法略高. 但并不影响其灵敏性 本试验中由于各扩增片段长度 相差较小.因此琼脂凝胶的浓度必 须较高,通常在1.5%一1.8%,电泳时 间可适当延长.使各片段之间拉开 一 定的距离.便于判断 模板DNA的提取对PCR结果 的影响很大.模板中的杂质如蛋白 质,重金属等可抑制Taq酶的活性, 另外SDS,尿毒等使蛋白质变性的 物质也直接抑制酶的活性.因此,在 制备模板时菌量不能过多.否则裂 解不完全.菌体主蛋白含量过高.会 影响Taq酶的活性,造成假阴性.样 品处理过程中要尽量减少模板中混 入样品杂质.增菌过程有可稀释样 品中Taq酶抑制剂的含量.本次试 验中选择了细菌DNA提取纯化试 剂盒.DNA提纯效果比较好 PCR方法灵敏度非常高.这就 要求在实际操作中要非常小心.避 免由于污染而造成的假阳性结果 假阳性结果通常是由于扩增样品, 试剂,扩增产物及操作环境的交叉 污染等造成的.因此在试验的每一 个环节都要减少污染的机率.一旦 发生污染.应采用高压,紫外线照 射,更换试剂等方法及时处理. 本试验建立的MPCR方法将 传统方法中大量的生化试验转化为 一 次性扩增.具有操作简便,快速, 灵敏度高等特点.每批样品从增菌 到出结果只需48h,且便于批量检 测.而常规培养方法需要7d或更长 的时间,不宜大批量操作.因此使用 本方法做样品初筛.结合国标或行 标可大大缩短检测周期.降低检验 成本.适合口岸快速通关的需要 参考文献 【l】TadaJ,eta1.Detectionofthe thermostabledirecthemolysingene (tdh)andthethermostabledirect hemolysin-relatedhemolysingene (trh)ofVibrioparahaemolyticusby polymerasechainreaction[J].Mole CellProbes,1992,30:2118. 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[12】SanderyM,StinearT,Kaue— nerC.Deetectionofpathogenic (下转第31页) 一 3l一中国动物检疫2006年第23卷第2期 栏目主持人:庞素芬 业 /\ 文章编号:1005—944X(2006)02—0031—02 化市奶牛结核病的检疫 史明基王建中刘果蔡斌(江苏省兴化市兽医卫生监督所225700) 2005年4月份我们对兴化市 844头奶牛用结核菌素皮内变态反 应试验进行了检疫.现报告如下: 1材料与方法 1,1材料 牛型提纯结核菌素(批号: 20040605.由农业部动物生产检疫 所生产),酒精棉,游标卡尺,2.5ml 注射器和针头.稀释用的灭菌的生 理盐水和带胶塞的灭菌小瓶等 1.2方法 1.2.1注射部位及术前处理将牛 编号后在颈侧中部上1/3处剪毛. 三月龄以内犊牛,在肩胛部进行.直 径约10cm.用游标卡尺测量术部 中央皮皱厚度,作好记录.如术部有 变化时.应另选部位或在对侧进行 1.2.2注射剂量不论牛只大小.一 律皮内注射1万国际单位即将牛型 提纯结核菌素稀释成每毫升含l0万 国际单位后,皮内注射0.1ml我们用 的是2.5ml注射器-贝0再加等量灭菌 的生理盐水皮内注射0.2ml冻干提 纯结核菌素稀释后当天用完 1.2.3注射方法先以75%酒精 消毒术部,然后皮内注入定量的牛 型提纯结核菌素.注射后局部应出 现小泡,如注射有疑问时.应另选 15cm以外的部位或对侧重做 1.2.4注射次数及反应皮内注射 后经72h时判定.仔细观察局部有 无热痛,肿胀等炎性反应.并以游标 卡尺测量皮皱厚度,作好详细记录 对疑似反应牛应在另,侧以同一批 菌素同一剂量进行第二回皮内注 射,再经72h后观察反应如有可 能.对阴性牛和疑似反应牛.于注射 后96h,120h再分别观察一次,以 防个别牛出现迟发性变态反应 1.2.5结果判定 阳性反应局部有明显的炎性 反应.皮厚差大于或等于4mm者, 其记录号为(+). 疑似反应局部炎性反应不明 显.皮厚差在2.13.9mm之间.其 记录号为(士). 阴性反应无炎性反应皮厚 差在2mm以下.其记录号为(一). 1.3各奶牛场奶牛分布情况f表11 表1兴化市奶牛分布情况(单位{头) 2检验结果 2.1按上述方法.我们用了一个月 左右时间分别对兴化市七家奶牛场 844头登记在册的奶牛进行了检 疫,结果见表2. 表2兴化市奶牛场检验结果(单位:头) 3处理措施 对检查出的阳性牛按以下方法 处理的: 3.1扑杀病牛和阳性牛: 3.2隔离:圈养和固定草场放牧方 式,对病畜同群畜实施隔离: 3.3无害化处理:所有扑杀的病 畜.采取焚烧的方式无害化处理: 3,4消毒:饲养场的金属设施,设 备等采取熏蒸的方式消毒:饲养场 的圈舍,场地,车辆等可选用10 30%石灰乳消毒墙壁用20%生石 灰乳粉刷;对饲养用具,牛栏(床)等 以3-5%来苏儿溶液进行洗刷消毒 数小时;饲养场的饲料,垫料等采取 焚烧处理:污染的粪便堆积在距离 牛舍较远的地方.采取堆积密封发 酵方式进行生物热发酵消毒 4小结与讨论 4.1此次检疫工作全部由基层兽 医进行.在此过程中笔者发现了很 多技术性的问.主要表现为以下 几个方面: 4.1.1游标卡尺读数不精确.按要 求应达到小数点后3位(精确到后 两位,估读一位共三位),而在实际 工作中只有一位数字.达不到标准. 4.1.2注射时效果达不到要求.有 的甚至没有注射到0.2ml 4.2检疫中各奶牛场结核病的阳 性率差异较大,可能原因是: 4.2.1动物个体差异较大.对疾病 的敏感性不一样: 4.2.2饲养环境不同.由于属于个 体养殖.其房舍和场地有较大的差 别.而恶劣的饲养环境不仅不利于 疾病的控制.而且还会影响到牛本 身的非特异性抵抗力; 4.2.3养殖场主人专业知识层次不 一 样.对发生疾病后的应对措施不 力.造成疾病不必要的传播; 4.2.4E奶牛场的阳性率明显高于 其他奶牛场经了解得知该场在其 引进新奶牛时未经充分的隔离观察 期就与原奶牛混养这在理论上就提 供了疾病传播的可能: 4.2.5在兽医站检疫过程中.注射