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鸡胚原代细胞的培养
[实验目的]
掌握鸡胚原代细胞培养操作的基本程序,观察单层细胞生长情况。 [实验材料]
9 ~10日龄鸡胚,Hank`s液(已含0.5%乳蛋白水解物),0.25%胰蛋白酶,NaHCO,双抗,3牛犊血清,手术剪,眼科镊,培养皿,细胞瓶,三角瓶,玻璃珠(置于三角瓶内),漏斗,纱布(置于漏斗中),30ml注射器,10ml注射器,塞子若干,蛋座,水浴锅。 [实验内容及操作程序]
1、 配液 在Hank`s液中加入青、链霉素,使其含量为青霉素1000IU/ml,链霉素
100ug/ml...
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鸡胚原代细胞的培养
[实验目的]
掌握鸡胚原代细胞培养操作的基本程序,观察单层细胞生长情况。 [实验材料]
9 ~10日龄鸡胚,Hank`s液(已含0.5%乳蛋白水解物),0.25%胰蛋白酶,NaHCO,双抗,3牛犊血清,手术剪,眼科镊,培养皿,细胞瓶,三角瓶,玻璃珠(置于三角瓶内),漏斗,纱布(置于漏斗中),30ml注射器,10ml注射器,塞子若干,蛋座,水浴锅。 [实验内容及操作程序]
1、 配液 在Hank`s液中加入青、链霉素,使其含量为青霉素1000IU/ml,链霉素
100ug/ml。胰蛋白酶用含有青链霉素的Hank`s液(简称H液)按1:9比例稀释。用
7.5%NaHCO调整pH至7.2~7.4(玫瑰红色)。 3
2、 取胚及剪碎 将胚蛋气室端向上竖直于蛋座上,用碘酊消毒气室,以镊子击破卵壳并
弃之,注意不能让蛋壳碎屑掉入气势内,撕破卵膜并揭之,继撕破绒尿膜、羊膜,
用镊子夹住或勾住鸡胚脖子部位,取出胚胎于平皿中。剪去头部、翅爪及内脏,用H
3液洗去体
血液。用灭菌剪刀剪碎鸡胚,使其成为约1mm大小的碎块,用H液小心
洗涤2次。
3、 消化 将洗涤好的胚胎碎块转移入三角瓶中,尽量不要让组织块沾到平皿壁上,按组
织块量约3~5倍胰酶,加上瓶塞,37?水浴约20min左右,每隔5min轻轻摇动1次。
待液体变混而稍稠,中止消化。
4、 分散 取出三角瓶后静置1min,让组织块下沉后轻轻倒去胰酶,塞好瓶塞,用力振
摇三角瓶,以使细胞分散下来。加入H液,轻轻振荡,待组织块下沉后,通过漏斗
中的纱布将H液过滤于细胞瓶中,小心不让组织块一并倒出。继续用力振摇三角瓶,
加H液过滤,重复两次,最后一次连同组织块一起倒入漏斗。
5、 加入血清 在过滤好的细胞悬液中加入牛犊血清,使血清含量为10%。塞好瓶塞,轻
摇细胞瓶混匀。
6、 分装 将加入血清的细胞悬液分装至各个细胞瓶中,约占细胞瓶容积的10%左右。塞
紧瓶塞,将细胞瓶横卧,瓶上注明组别、日期,置37?温箱培养。4h后细胞可贴附
于瓶壁,每隔24h观察一次,24~36h生长成单层细胞,此时可吸取培养液,更换维
持液,并接种病毒。
1
附:[主要试剂配制]
1、Hank`s液
原液A NaCl 8g
?7HO 2g MgSO42
KCl 8g
Mg Cl?6HO 2g 22
2.8%CaCl 100ml 2
双蒸水 加至100ml
先将固体成分加于800ml双蒸水中,加温到50~60?溶解,再加入 CaCl溶液,最2
后加双蒸水补足到1000ml。加氯仿2ml,摇匀后4?贮存。
原液B NaHPO?12HO 1.2g 242
KHPO?2HO 1.2g 242
葡萄糖 20g
0.4%酚红 100ml
双蒸水 加至100ml
将上列各物混合后使其溶解,加氯仿2ml,摇匀后4?贮存。
Hank`s工作液
原液A 1份
原液B 1份
双蒸水 18份
工作液分装到盐水瓶中,115?灭菌10min,使用前以7%NaHCO3调节pH到7.2~7.6。
2、0.4%酚红溶液配制
酚红 0.4g
0.1%NaOH溶液 11.28ml
将酚红置于研钵中,边研磨边缓缓加入NaOH溶液,直到所有颗粒完全溶解,置于
100ml两杯中,最后加双蒸水至100ml,摇匀后,保存于4?冰箱备用。 3、O.5%乳蛋白水解物溶液配制
5g 乳蛋白水解物
2
1000ml Hank`s液
将乳蛋白水解物放入1000mlHank`s液中,待完全溶解后,摇匀分装于100ml的盐水瓶中,每瓶95ml,115?灭菌10min,保存于4?冰箱内备用。
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