流体剪切力与17―β雌二醇对MC3T3―E1细胞增殖活性协同作用的研究

流体剪切力与17―β雌二醇对MC3T3―E1细胞增殖活性协同作用的研究 流体剪切力与17―β雌二醇对MC3T3―E1细胞增殖活性协同作用的研究 [摘要] 目的 探讨对体外培养的成骨细胞增殖活性促进作用最佳的17-β雌二醇的浓度及作用时间、流体剪切力(FSS)的力值及作用时间，以及此双因素共同作用对成骨细胞增殖活性的影响。 成骨细胞系MC3T3-E1细胞 传代培养后，分别对其施加不同浓度的17-β雌二醇和不同力值的FSS，采用MTT法检测细胞的增殖情况，并检测ALP活性，筛选出最佳的浓度及力值;再将二者共同作用于MC3T3-E1细胞，检测其增殖情况和ALP活性。结果 浓度为10-8 mol?L-1的17-β雌二醇作用5 d时，MC3T3-E1细胞的增殖及ALP活性优于其他17-β雌二醇处理组;FSS力值为12×10-5 N作用60 min时细胞的增殖及ALP活性大于其他FSS处理组。当二者同时作用于MC3T3-E1细胞时，细胞的增殖活性大于任一单因素处理组。结论 17-β雌二醇和FSS对成骨细胞活性的促进作用皆有一个适宜的阈值;二者具有协同作用，对成骨细胞分化及增殖功能的影响优于单一因素作用。 [关键词] 17-β雌二醇; 流体剪切力; 协同作用; 成骨细胞 [中图分类号] Q 25 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.016 正常状态下骨形成与骨吸收处于一种平衡状态，该平衡是由成骨细胞介导的新骨形成和破骨细胞介导的骨吸收作用来实现的。MC3T3-E1细胞株是成骨分化研究中的经典细胞株，很多学者将其用于骨形成机制的研究[1]。影响成骨及破骨细胞增殖及活性的因素有很多，雌激素和应力是影响成骨细胞活性及增殖的重要因素[2]。 研究[3-4]明:雌激素对成骨细胞的功能有促进作用。还有学者[5]发现:流体剪切力(fluid shear stress，FSS)能够活化成骨细胞的跨膜受体，促进成骨细胞增 殖。Yeh等[6]通过研究证实:雌激素可以通过雌激素受体增加成骨细胞对FSS的敏感性。本实验采用MC3T3-E1成骨细胞系，对其施加不同浓度的17-β雌二醇及不同力值的FSS，探讨17-β雌二醇、FSS以及二者共同作用对成骨细胞增殖活性的影响。 1 材料和方法 1.1 实验材料 MC3T3-E1第3代细胞株(ADCC公司，美国)。17-β雌二醇、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、MTT(Sigma公司，美国)，胰蛋白酶(Gibco公司，美国)，含105 U?L-1青霉素及100 mg?L-1链霉素的α-MEM培养基、胎牛血清(Gibco公司，美国)，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)试剂盒(南京建成生物有限公司)，Triton X-100(Fluka公司北京原生生物 技术有限公司分装)。Multiskan MK3酶联免疫检测仪(Thermo公司，美国)，平行板流室加力装置(四川大学华西口腔医学院FSS课题组提供)。 1.2 细胞培养及传代 将第3代MC3T3-E1细胞系用α-MEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清、105 U?L-1青霉素及100 mg?L-1链霉素)在37 ?、5%CO2潮湿环境下培养，2,3 d换 液1次，待细胞均匀一层铺满培养瓶底部时，用0.25%胰蛋白酶消化获得细胞，用于后续实验。 1.3 实验方法 1.3.1 17-β雌二醇处理分组 将用于17-β雌二醇处理的细胞等分为A、B、C、D、E共5组，每组再分为4个小组，分别标记为A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4……以此类推。在A、B、C、D组的培养基中分别添加浓度为10-10、10-9、10-8、10-7 mol?L-1的17-β雌二醇，每一大组的4个小组分别培养1、3、5、7 d。E组为对照组，不加17-β雌二醇，其余处理同实验组。设置30个重复样本。 1.3.2 FSS处理分组 将用于FSS处理的细胞等分为a、b、c、d、e、f共6组，每组再分为3个小组，分别标记为a1、a2、a3、b1、b2、b3……以此类推。将各组细胞接种于放置在六孔板中的盖玻片上，移入细胞培养箱静置培养至细胞完全贴壁。采用平行板流室加力装置分批次对a、b、c、d、e组细胞分别施加每平方厘米力值为2×10-5、6×10-5、12×10-5、20×10-5、25×10-5 N的力，每组中3个小组的作用时间分别为15、60、120 min。f组为对照组，不施加FSS，其余处理同实验组。设置30个重复样本。 1.3.3 FSS+17-β雌二醇双因素处理分组 经上述实验筛选出17-β雌二醇的最佳浓度和最佳培养天数后，设置双因素作用组?、FSS组?、17-β雌二醇组?、对照组?。各组细胞的接种方法同1.3.2，其中?、?组添加最佳浓度的17-β雌二醇进行培养，?、?组添加等量DMSO培养，常规培养经1.3.1步骤筛选出的最佳天数后，?、?组 施加经1.3.2步骤筛选出的最佳力值及时间。设置30个重复样本。 1.3.4 MTT检测 在规定时间内，将实验样本用0.25%胰蛋白酶消化获取悬浮细胞，将细胞分别置于EP管离心5 min，接种于96孔板中，添加适量培养基，静置培养6 h至细胞完全贴壁后，每孔加入5 g?L-1的MTT溶液20 μL，37 ?继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，然后置于酶联免疫检测仪上检测，波长为490 nm，光密度A值。空白对照组做相同处理。 1.3.5 ALP活性检测 获取细胞及接种方法同上，根据ALP试剂盒的说明，分别加入试剂1、2液50 μL离心5 min后加入试剂3液50 μL，置于酶联免疫检测仪上检测，选择520 nm波长，记录吸光度A值。空白对照组做相同处理。 1.4 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，同一时间组内比较采用单因素方差分析，不同时间组间两两比较使用秩和检验，检验水准为双侧α=0.05。 2 结果 2.1 17-β雌二醇处理组 不同浓度17-β雌二醇作用不同时间后，经MTT检测得到的A值见表1。从表1可见:同一处理时间，C组(10-8 mol?L-1组)多优于其他实验组，实验组多优于E组(对照组);各处理时间组的表现趋势相同，均随着17-β雌二醇浓度的增高，成骨细胞活性增强，达到高峰后逐渐回落。各时间组的增长百分比结果见图1，可见各时间段的曲线趋势大致相同，随着17-β雌二醇浓度的升高，曲线升高，达到峰值后开始回落，其中5、7 d组中D组(10-7 mol?L-1组)呈现明显负增长，5 d组中C组(10-8 mol?L-1组)明显高于其他各组。 ALP结果的分析趋势与MTT相同，表现为C3组成骨细胞分化活性最佳。 2.2 FSS处理组 2.2.1 细胞形态观察 倒置相差显微镜下观察可见:FSS作用前细胞呈多角形、梭形，排列无序(图2左); FSS作用后细胞呈长梭形，细胞长轴沿力的方向排列(图2右)。 2.2.2 MTT检测结果 不同力值的FSS作用不同时间后，MTT检测结果见表2:每个作用时间组内，随着力值增大，A值呈上升趋势，到达高峰后，随着力值继续增大，A值则呈下降趋势;在3组数据中，作用60 min组明显高于其他组。经统计学检验，1组(作用15 min组)内各实验组与对照组的差异无统计学意 义(P>0.05);2组(作用60 min组)内，c2组(12×10-5 N)优于其他各组，e2组(25×10-5 N)低于对照组(P 2.2.3 ALP检测结果 ALP检测结果见表3。经统计学分析，ALP的变化趋势与MTT结果基本相同，c2组(12×10-5 N作用60 min)成骨细胞的增殖活性最佳。 2.3 FSS+17-β雌二醇双因素处理组 将筛选出的最佳浓度(10-8 mol?L-1)17-β雌二醇和最佳FSS力值(12×10-5 N)用作双因素处理，不同处理组的MTT和ALP检测结果见表4。MTT数据分析结果显示:?组大于其他3组(P0.05)，但均大于对照组(P 3 讨论 随着我国国民结构的老龄化，骨质疏松患病率的增高、骨折危险性的增加及牙齿缺失后牙槽骨的吸收都成为现代医学亟需解决的问题。如何维持骨改建的平衡，促进骨的生长和重建，抑制或减缓骨吸收成为近年研究的热点。影响骨改建的因素很多， 雌激素和FSS刺激是其中2个重要的因素[2]，目前关 于这2种因素影响骨改建的研究也是一大热点。 雌激素是由卵巢分泌的一种性激素，能够维持机体的生理功能，可用来治疗由于雌激素缺乏所导致的各种疾病。这种替代疗法已得到普遍应用。雌二醇可以通过雌激素受体抑制成骨细胞凋亡，促进成骨细胞增殖，提高ALP活性，促使骨基质矿化。有研究[7]发现:成骨细胞是雌二醇的直接靶器官。本实验结果显示:成骨细胞的活性并不始终与17-β雌二醇的浓度呈正相关关系，在17-β雌二醇浓度为10-8 mol?L-1作用5 d时，细胞的增殖活性最佳，而随着浓度的继续升高，增殖活性开始降低。 机械应力是影响骨改建的另一个重要因素，适当的机械应力刺激能够促进骨组织的生长。在骨改建过程中，成骨细胞的增殖和分化有重要的作用。吴丹等[8]研究证实:FSS作用于成骨细胞后，其增殖能力提高，细胞活性增强。本研究结果表明:对体外培养的MC3T3-E1细胞施加FSS，力值为12×10-5 N作用60 min时，其促增殖效果最明显;加力后可见细胞长轴沿力的方向排列。FSS施加力值和时间长短不同，成骨细胞的反应也不同。随着力加载时间的延长，成骨细胞 对应力的敏感性减弱，这可能与其逐步适应了应力刺激有关。当力值较大时，细胞活性反而 降低，提示过大的应力非但不能促进成骨细胞的增殖反而会抑制其生长活性。在有关成骨细 胞的体外研究中，应注意FSS强度的取值范围。 Genetos等[9]研究证实:骨小管内液 体的流动对 成骨细胞的作用主要由剪应力介导。FSS加载装置有很多种，平行板流室加 载系统有其独特的优势，在平行板流动小室里，能够达到层流和二维流动，通过调节蠕动泵 来提供稳定有效的FSS，而且设备轻便，培养基更换方便，易于培养，易于镜下观察，加力 所需培养基的量也较少。本实验所采用的四川大学获取专利的FSS加载装置能够精确地控制 力值的大小[10]，较好地模拟了体内骨组织的成骨细胞受到的应力状态，其施加的FSS大小 均一，并且可以调节到很小的范围，得到的实验结果具有代表性。 成骨细胞受到10-8 mol ?L-1的17-β雌二醇和12×10-5 N的力影响时，细胞增殖活性明显高于单纯施加10-8 mol ?L-1的17-β雌二醇和单纯施加12×10-5 N的加力组，提示17-β雌二醇和FSS对成骨细 胞具有协同作用。这可能与二者提高了成骨细胞对彼此的敏感性有关，亦有可能与二者共同 促进某一离子通道的开放或者激活某一信号通路有关。 综上所述，由本实验可以得出以 下结论:浓度为10-8 mol?L-1的17-β雌二醇作用5 d时，成骨细胞的增殖活性优于其他 17-β雌二醇处理组;FSS力值为12×10-5 N作用60 min时，成骨细胞的增殖活性大于其他 FSS处理组;当二者同时作用于成骨细胞时，其增殖活性大于任一单因素处理组，此双因素 具有协同作用。本实验为探讨体外培养成骨细胞的骨代谢相关信号传导通路提供了一定的参 考。 [参考文献] [1] Genetos DC， Geist DJ， Liu D， et al. 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