桔子皮中多糖的提取分离和含量分析.doc

桔子皮中多糖的提取分离和含量分析.doc 湖南人文科技学院毕业论文() 桔子皮中多糖的提取分离和含量分析 彭 伟 指导老师 申湘忠 (湖南人文科技学院化学与材料科学系 湖南娄底 417000) 摘 要:将桔子皮烘干，粉碎，先用80%的乙醇溶液于80?回流2个小时，除去单糖和低聚糖， 再用石油醚脱脂、Sevag法除蛋白得到浅黄色桔子皮多糖，经提纯后得到灰白色桔子皮多糖。通 过正交实验法研究了浸提温度、浸提时间、料水比三因素对桔子皮多糖提取的影响。初步筛选出 桔子皮多糖最佳提取条件为:料水比1?35，浸提温度90?，浸提时间120min。用硫酸—苯酚法 对桔子皮多糖含量进行测定，结果表明:桔子皮多糖换算因子为3.15，桔子皮多糖平均质量分数 为2.36%，桔子皮多糖测定相对偏差(RSD)为2.14%。 关键词:桔子皮;多糖;提取;分析 Extraction and Analysis of Polysaccharide from Orange skin Peng wei Teacher Shen Xiangzhong (Department of Chemisty and Material Science,Hunan Institute of the Humanities,Science and Technology,Loudi Hunan ,417000) Abstract: Orange skin was dried and smashed,first it was refluxed with 80% ethanol solution under 80? for 2h,after the sugar and oligosaccharides were removed,then it was degreased with oil ether until the liquid is colorless,and the proteins were eliminated with Sevag method.After depuration,the iron grey Orange skin polysaccharides were obtained.The three factors(extraction temperature,extraction time,the material hydraulic modulus) influencing the extraction of polysaccharide in the orange skin was studied through the orthogonal design. Screened the Orange skin polysaccharide optimum extraction conditions initially: the material hydraulic modulus is 1:35,extraction temperature is 90?,extraction time is 120min.The contents showed that conversion factor of polysaccharide in Orange skin is 3.15, the average quality scores of the polysaccharide is 2.36 percent, the amount of polysaccharide relative standard deviation (RSD) is 2.14 percent. Key words:orange skin;polysaccharide;extraction;analysis 1 湖南人文科技学院毕业论文(设计) 桔子皮，在我国的传统医药中又叫陈皮，系芸香科植物橘树的成熟果实之干燥果皮，味苦、辛，性温。归肺、脾经。功能理气化痰、健胃除湿、降低血压等，主要用于治疗胸腔胀满，食少吐泻，咳嗽痰多等症，因此是一种很好的中药材。桔子皮除含有多糖外，还含有大量的对人体有益的维生素B和C，香精油，芳香油，麝香草酚等有机物。桔子皮中的多糖被制成保健品和食品着色添加剂肯定具有重要的开发价值。有关桔子皮中色素、类黄酮、果胶等物质的研究很多，而对桔子皮多糖的有关研究则少见报道。 多糖类物质是生命代谢不可缺少的重要物质，它是由多个单糖或其衍生物聚合而成的大分子活性化合物。对多糖的研究，最早是在20世纪40年代，但其作为广谱免疫促进剂而引起人们的极大重视则是在60年代，经过40余年的不断发展，人们对多糖这一类重要生命物质产生了新的认识，使这一学科成为目前生命科学中研究最活跃的领域之一。自20世纪60年代多糖的生理活性功能被发现后，有关多糖的研究日益受到世界各国的重视。近年来发现植物多糖具有抗病毒、增强免疫力、抗肿瘤、延缓 [1][2]衰老、降血糖、抗凝血等多种功效，而且多糖作为药物其毒性极小。据 Franz等报道，已有近百种植物的多糖被分离提取鉴定出来。这类多糖来源广泛且没有细胞毒性，应用于生物体毒副作用小，因此对植物多糖的研究已成为医药界的热门领域。所 [3]以多糖物质的研究将成为继蛋白质和核酸之后的探索生命奥秘的第三里程碑。 目前，多糖的主要提取分离有水提取法、微波辅助提取法和索氏提取法。吉 [4]林大学生命科学院孟凡欣等采用了水提法提取了刺五加中的刺五加多糖，广东省农 [5]业科学院生物技术研究所的唐小俊等也使用该技术提取了荔枝中的荔枝多糖;微波辅助提取法是近年来发展起来的一项提取多糖的技术，国内外学者先后运用该技术提取了辣椒中的辣椒素、大蒜中的大蒜辣素、苹果中的果胶、银杏中的黄酮苷、甜菜及 [6][7][8]甘蔗中的糖分，葡萄中糖苷类风味物质真菌中的总脂肪酸和麦角醇;也是一种较常用的方法，四川理工学院生物工程系的游建明采用索氏提取法提取了生姜中的生 [9]姜黄酮。塔里木大学农业工程学院的候旭杰等采用该技术提取了野生巴楚蘑菇中的 [10][11]野生巴楚蘑菇多糖。马钊发明了洋葱多糖的常规提取法，即水提取法。这些研究表明，植物多糖的提取和研究正在向一个更为广阔的空间发展。 [12]从植物中提取多糖，一般先用石油醚、乙醚等有机溶剂提取，除去脂溶性杂质。然后根据不同的溶解度选择一种溶剂进行萃取，常用的为水、稀盐、稀酸、稀碱等溶剂。但获得的多糖提取物中，常会有无机盐、蛋白质、色素及醇不溶的小分子有机物(如低聚糖)等杂质，必须分别除去。植物多糖可能会有酚类化合物而颜色较深，还需对其进行脱色使其应用范围更加广泛。常用的脱色方法有:离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法(纤维素、硅藻土、活性炭等)。 2 湖南人文科技学院毕业论文(设计) [13]多糖含量的测定常采用比色法或滴定法。比色法使用历史悠久，20世纪40, [14]50年代就先后报道了咔唑—硫酸法、蒽酮—硫酸法和苯酚—硫酸法测定多糖含量，目前使用最广泛的是后两种。其原理是根据多糖在硫酸的作用下水解成单糖分子，并迅速脱水生成糠醛衍生物，再将其与苯酚或蒽酮缩合成有色化合物，在适当的波长和一定的浓度范围内，吸收值与糖浓度呈线性关系，从而可通过比色测定其含量。滴定法主要是采用Fehling还原滴定法，此法是多糖水解成还原性的单糖后，以次甲基兰做指示剂，用标定过的碱性酒石酸酮溶液直接进行还原滴定，根据样液消耗的体积计算其含量。本法快速简便，不需精密仪器，对所有多糖均适用。近年来，高效液相色谱法(HPLC)越来越多地用于测量植物中的多糖，它分析速度更快，可以直接进样，不必制备成衍生物，而且有较高的分辨率。 本文采用醇析水提法提取桔子皮多糖，探讨了桔子皮多糖的提取条件并对其进行了含量测定和光谱分析。 1 主要材料及仪器设备 1.1 主要材料 材料:新鲜桔子皮(自备)。将桔子皮烘干,在粉碎机中粉碎，过60目筛,将样品粉末置于棕色磨口瓶中保存备用。 试剂:石油醚(AR: 天津大茂化学试剂厂);无水乙醇(AR:湖南汇虹试剂有限公司);浓硫酸(AR:湖南省株州开发区石化玻璃有限责任公司试剂厂);苯酚(AR:长沙市湘科精细化工厂);葡萄糖(AR:广州化学试剂厂);三氯甲烷(AR:长沙分路口塑料化工厂);正丁醇(AR:湖南师大化学试剂厂)。 标准葡萄糖溶液(0.04mg/mL):精确称取105?干燥恒重的葡萄糖0.02g，加入适量蒸馏水溶解，定量转移到500mL的容量瓶中，定容到刻度，摇匀，即得到葡萄糖标准溶液。 苯酚溶液(5,):取苯酚100g，加入铝片0.1g，NaHCO0.05g，蒸馏收集180?,3 182?馏分。称取12.5g精制苯酚加入适量水溶解后转移至250mL容量瓶中定容，置冰箱内备用。 1.2 仪器设备 电热恒温水浴箱(上海浦东物理光学仪器厂);101-2AB型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司);四两装高速中药粉碎机(武义县屹立工具有限公司);FA2104(N)系列电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司);200分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司);RE52-05旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);FT-IR360红外光谱仪(美国尼高力公司);SHB-?循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限 3 湖南人文科技学院毕业论文(设计) 公司) 2 实验方法 2.1 提取 2.1.1 桔子皮多糖的提取工艺流程 样品处理?脱脂?浸提?抽滤除渣?减压浓缩?去色素?脱蛋白?抽滤?乙醇沉淀多糖?真空干燥?精制多糖 2.1.2 桔子皮多糖的提取过程 称取50.00g样品粉末，置于500mL圆底烧瓶中，加入500mL80%的乙醇，回流2h， [15,16]脱去表面脂肪、抽滤、风干，重复1次。脱脂后的样品，在恒温水浴中热水浸提2h，过滤后，滤渣在相同条件下重复浸提1次。将两次浸提液减压过滤,去除滤渣,合并两次滤液。将合并滤液在真空旋转蒸发器中浓缩至小体积，得粗多糖。往粗多糖里加入1: [17]1的石油醚，去色素。挥干溶剂后，用Sevag试剂(氯仿?正丁醇=4?1)除蛋白，连续操作多次，直到完全脱除蛋白为止。在脱蛋白后的多糖溶液中加入3倍95%乙醇，沉淀用乙醇、丙酮及乙醚反复洗涤，经抽滤、真空干燥后得到精制多糖。 2.2 桔子皮多糖提取条件设计 选取料水比、浸提温度、浸提时间作为影响桔子皮多糖提取率的因素, 首先对每 [18]个因素拟定5个水平,在单因素实验基础上进行正交实验，选出最佳提取条件，再确定提取次数。 2.3 多糖的提纯及光谱分析 桔子皮粗多糖先用石油醚去色素，挥干溶剂后，向其加入Sevag试剂(氯仿:正丁 -1醇=4:1)除蛋白，振荡20 min，在3000 r?min的转速下，离心15 min，合并上清液测其体积，继续加相应体积的氯仿和正丁醇，并重复上述操作，直至氯仿层与正丁醇层之间无白色沉淀。然后加入4倍体积的无水乙醇，置冰箱24 h,抽滤，收集沉淀。真空干燥至恒重，即得精制桔子皮多糖。 红外光谱测定时取0.02g多糖, 与2.0g 经干燥的KBr粉末在玛瑙研钵中研细后压片测定,根据红外光谱的测定结果进行分析。 2.4 标准曲线的制作 取葡萄糖于105 ?干燥至恒质量,精确称取20mg,加蒸馏水溶解,定容至500mL。分别吸取0.2mL、 0.4mL、 0.6mL、 0.8mL、 1.0mL、 1.2mL、1.4mL、1.6mL的葡萄糖标准液，置于10mL试管中，各加水补足至2mL，加入体积分数为5%的苯酚1mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5mL，静止 10 min，摇匀，室温放置20min后于490 nm测吸光度，以2.0mL水按同样显色操作作为空白，以蒸馏水为空白，葡萄糖质量浓 4 湖南人文科技学院毕业论文(设计) 度C(μg/ml)为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。以吸光度(A)对葡萄糖质量浓度(C)作回归处理，得回归方程: A=0.0098C+ 0.063，相关系数r = 0.990，n=8。 2.5 换算因子的测定 精密称取干燥至恒重的精制桔子皮多糖20 mg，置于小烧杯中，加入适量的蒸馏水，水浴加热使其溶解，冷却后转入500mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，作多糖储备液。吸取多糖储备液0.4mL于带塞试管中，加蒸馏水至2.0 mL，按测定标准曲线的方法测其吸光度，按下面公式计算换算因子。m为称取的多糖质量 (mg)，Cf 为多糖中葡萄糖的质量浓度 (μg/mL)，D为多糖的稀释倍数，做平衡实验4次，求其平均值。 m, fCD， 2.6 样品中桔子皮多糖的含量测定 2.6.1 样品溶液的制备 称取桔子皮干粉2.0g，置于250mL圆底烧瓶中，加入80%乙醇回流2 h，抽滤，滤渣自然风干后，置于250 mL圆底烧瓶中，按最佳提取条件提取，趁热过滤，残渣用蒸馏水洗涤3次，洗液并入滤液中，冷却后移入500 mL容量瓶定容。 2.6.2 样品溶液中桔子皮多糖含量测定 精密吸取3.5.1所得样品溶液0.4 mL于带塞试管中，加蒸馏水至 2 mL，按测定标准曲 [19]线的方法测其吸光度 (A)，由回归方程计算样品液中葡萄糖质量浓度 (C) ，按下面公式计算样品中多糖的质量分数()。C为样品溶液中葡萄糖质量浓度(μg/mL)，D , 为样品溶液的稀释倍数，为换算因子，m为称取桔子皮干粉的重量(g) 。 f CDf，，,,，100% m 3 结果与讨论 3.1 桔子皮多糖提取条件的确定 3.1.1 料水比的确定 在多糖提取前，先用乙醇对样品进行预处理，以除去单糖、二糖等干扰组分，将乙醇处理后的样品自然风干后再进行浸提。分别称取2.0g桔子皮粉末5份，采用料液比为1?20、1?25、1?30、1?35、1:40分别在温度为80?，时间为2h条件下提取，过滤，滤液转入250mL容量瓶中，定容至刻度，分别吸取溶液0.4mL于带塞试管中，加蒸馏水至2mL，按测定标准曲线的方法测其吸光度(A)，比较不同的料水比对多糖得率的影响，结果见表1。 5 湖南人文科技学院毕业论文(设计) 表1 料水比对多糖得率的影响 料水比g/mL 1:20 1:25 1:30 1:35 1:40 得率(%) 2.231 2.254 2.278 2.286 2.252 由表1可知,桔子皮多糖得率在相同的提取条件下随液固比的增加而逐渐增大,但当液固比大于1:35时，多糖得率不再增加，反而下降，所以料水比选择1:35为适宜。 3.1.2 浸提温度的确定 分别称取2.0g桔子皮粉末5份,以1?35的料液比加入蒸馏水，分别置于60?、70?、80?、90?、100?恒温水浴中，浸提2h，过滤，滤液转入250mL容量瓶中，定容至刻度，分别吸取溶液0.4mL于带塞试管中，加蒸馏水至2mL，按测定标准曲线的方法测其吸光度(A)，比较不同的温度对多糖得率的影响，结果见表2。 表2 浸提温度对多糖得率的影响 浸提温度 60? 70? 80? 90? 100? 得率(%) 2.935 3.317 4.400 5.231 5.276 由表2可知,在60,100?温度范围内，随着温度升高，多糖得率呈上升趋势，但是90?以后变化幅度较小。考虑到温度太高会破坏多糖生物活性，色泽加深，黏度加大，所以浸提温度选择90?为宜。 3.1.3 浸提时间的确定 分别称取2.0g桔子皮粉末5份,以1?35的料液比加入蒸馏水，置于90?恒温水浴中，分别浸提 60min、90min、120min、150min、180min，过滤，取上清液测定多糖吸光度，比较不同的时间对多糖得率的影响，结果见表3。 表3 浸提时间对多糖得率的影响 浸提时间 60min 90min 120min 150min 180min 得率(%) 1.986 2.221 2.216 1.908 1.033 由表3结果可知，多糖得率在90min之前增加，120min后，缓慢下降，可能是由于长时间高温提取导致多糖分解所致，所以浸提时间选择90min即可。 3.1.4 提取次数的确定 称取2.0g桔子皮粉末，在1:35的料液比和80?浸提温度下，浸提时间为90min，重复操作4次，测定提取次数对多糖提取率的影响，结果见表4。 6 湖南人文科技学院毕业论文(设计) 表4 提取次数对多糖提取率的影响 提取次数(次) 1 2 3 4 提取率(%) 96.33 3.25 0.36 0.06 总提取率(%) 96.33 99.58 99.94 100 上述实验结果表明，二次提取基本可将绝大部分多糖浸提出来，因此以后实验均采用二次浸提。 3.2 桔子皮多糖提取正交实验结果 根据以上单因素实验结果，选定料水比、浸提温度、浸提时间3项作为考察因素， 4做L(3)正交实验，因素水平、实验结果见表5。 9 表5 正交实验结果 实 因素 验 得率(%) 料水比(g/ml) 浸提温度(?) 浸提时间(min) 号 A B C 1 1(1?30) 1(80) 1(60) 2.209 2 1 2(90) 2(90) 2.326 3 1 3(100) 3(120) 2.123 4 2(1?35) 1 2 2.342 5 2 2 3 1.979 6 2 3 1 2.157 7 3(1?40) 1 3 2.086 8 3 2 1 1.962 9 3 3 2 2.118 K6.658 6.637 6.328 1 K6.478 6.267 6.786 2 K6.166 6.398 6.188 3 k2.219 2.212 2.109 1 k2.159 2.089 2.262 2 k 2.055 2.133 2.063 3 R 0.164 0.123 0.199 对上述数据进行方差分析，结果表明，料水比、浸提温度、浸提时间在桔子皮多糖得率中影响不同，其中浸提时间影响最大，其次是料水比的影响。由于极差的大小可以反应各因素对指标影响的程度，根据正交实验方差分析，可以判断出影响桔子皮多糖提取诸因素的主次关系依次为浸提时间(C),料水比(A),浸提温度(B)。 7 湖南人文科技学院毕业论文(设计) 从正交实验结果极差分析可知，因素A以第2水平为最好，因素B以第1水平为最好，因素C以第3水平为最好，最佳组合为ABC，即料液比1?35、提取温213 度80?、浸提时间120min。 3.3 桔子皮多糖的含量分析 3.3.1 换算因子的测定 结果见表6，测得桔子皮多糖换算因子 =3.15，RSD为0.71，说明本测定误差f 较少。 表6 换算因子的测定 样品号 A C(μg/ml) (平均) RSD/% ff 1 0.088 2.551 3.13 2 0.091 2.857 3.16 3.15 0.71 3 0.089 2.653 3.14 4 0.092 2.959 3.17 3.3.2 桔子皮多糖含量测定 结果见表7，本实验测得桔子皮中多糖质量分数为2.36%，RSD为2.14%，说明本测定误差较少。 表7 桔子皮多糖含量测定 样品号 A C(μg/mL) m(多糖总量/mg) w(多糖/%) w(平均多糖/%) RSD/% 1 0.141 7.595 47.094 2.35 2 0.142 8.061 48.298 2.41 2.36 2.14 3 0.140 7.857 46.289 2.31 3.3.3 桔子皮多糖红外光谱分析 -1从图1可见，在 3200,3600cm 出现1种宽峰 ,是羟基(O-H)的伸缩振动峰， -1-1其中3436.70cm处的峰是糖分子中羟基(O-H)的伸缩振动吸收峰，1629.02cm出 -1现的峰为-CHO的C=O键的伸缩振动峰。1000,1200cm的吸收峰则为C-H变角振 -1动所形成的峰，它和C-H的伸缩振动构成了糖类的特征吸收峰，400,1000cm的吸收峰是C-O伸展振动峰。 8 3436.70 1629.02 湖南人文科技学院毕业论文(设计) 100 1111.81 95 901.85 90 85 558.75 80 75 %Transmittance 70 65 60 55 50 4000 3000 2000 1000 Wavenumbers (cm-1)123 图1 桔子皮多糖的红外光谱图 4 结论 料水比、浸提温度、浸提时间是影响桔子皮多糖提取率的主要因素，本实验在单因素实验的基础上，采用正交实验优化了桔子皮多糖的提取工艺。结果表明:桔子皮多糖最佳提取条件为:料水比1?35，浸提温度90?，浸提时间120min，桔子皮多糖换算因子为3.15，桔子皮多糖平均质量分数为2.36%，桔子皮多糖含量测定相对标准偏差 (RSD)为2.14%。桔子皮多糖的提取分离和含量分析为进一步研究桔子皮多糖结构、理化性质及其生物活性奠定了基础。 参考文献: [1] 田庚元,冯宇澄,林颖.植物多糖的研究进展[J].中国中药杂志,1995,20 (7):441. 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