盐生杜氏藻和青岛大扁藻的超低温保存

盐生杜氏藻和青岛大扁藻的超低温保存 卯一舰 植物2000.42(4):399—4O2 ActaBottmicaS’mica 盐生杜氏藻和青岛杏扁藻的超低温保存s劬.2 辽 鹏 116029 程爱华f; (辽宁师范大学生物系,大连) 摘要:采用两步法冷冻技术超低温保存盐生杜氏藻(瑚”P池sa//na(Dura1)Teod.)和青岛大扁藻(期s一 ‘妣:KylinB).当二甲基亚砜(DMSO)浓厦分别为5%和20%.平衡时间均为30min;预冻温度及 保持时间分别为一40?,60l和一30?,30n;化冻后分别在0?和室温下采用慢速稀释法去陈DI~S0时,盐生 杜氏藻和青岛大扁藻都达到了最高存括率,分别为68.5%和78.3%. 关键词:遗圭塾垦蔓鼋墨旦萎;跫堡iE丑液氮)珥料pM 中图分类号:o33文献标识码:A丈章编 号:0577-’7496(2000)04-0399-04 CryopreservalionofDunalieilasalinaandPiatymonas helgolandicavar.tsingtaoensis D0ng,HDa-Peng,CHENGAi-Hua W,~NGQi-Hua,ZI-La~NGEn— (DI一孵醮?},[Norma/Un/vers,Dallan116029,China) Abstract:Dunaliellasalina(IXma1)Teod.andP/azymonas砘r如 KylinV~tI”.u/ngtaoens/sWPA’~ c~opreservedinliqLInitrogenwithatwo—stepcryopreservationmethod.W ith5%and20%dimethyl— sulphoxyde(DMSO)concenlrationrespectivelythrough3omin~S1]ibtiumtime,andunder一400C,60min and一 300C,30rainrespective~asp.mgtemperatureandsustainedtime,andbyngslowdilution methodtoremoveDMSOfromthesampleat00Candroomtemperaturerespectivelyaftersamplethawing.D. salinaandP.helgoIandicava~.tsingtaoensisgainedthehighestsurvivalratesthatwere68+5%and78.3% respectivdy. Keywords:Dunalielhtsalina;Platymonashelgolandica;cryopreservafion(1iquidnitrogen) 近50年来,由于超低温保存技术的建立和发 展,已有多种植物的细胞,组织和器官实现了超低温 冰冻保存.已有研究表明,在超低温(通常指液氮温 度,一06?)条件下,细胞的全部代谢活动近于完 全停止,因而可以保持种质的遗传稳定性,达到长期 保存的目的[1一.近年来随着微藻在海产养殖中 的广泛应用,采用超低温技术保存海洋饵料微藻也 日益受到关注”.盐藻和青岛大扁藻都是重要 的饵料微藻对盐藻冰冻保存的研究表明,采用高 盐培养基培养和经过冷驯化后,使用高浓度甘油作 保护剂时可获得较高的存活率_】5-I6_,但该方法既费 时又费力,操作过程十分繁琐_].而二甲基亚砜 (DMSO)由于其穿透能力大大高于甘油,因此在操作 上要简便得多,并已证明对多种海藻有良好的保护 效果.但已有研究表明,DMSO对藻类有一 定的毒性?,而且将DMSO用做盐藻的冰冻保护 剂时,存活率很低I8_.本文对盐藻的两步法超低 温保存技术作了进一步探讨,在DMSO毒性实验基 础上优选出适用于冷冻保存的最适DMSO浓度和平 衡时间,并对保护剂的去除方法及预冻温度和预冻 时间作了优化,以探讨用较简便的操作方法获得较 高存活率的各caS/n/ca42卷 Lubian方法J. 1.3两步法冷冻 1.3.1DMSO的加入和冷冻在室温下离心收获 藻类,用新鲜培养基再悬浮至所需密度,取1mL藻 液于2mL冻干管中,再加入1mL预先配制的为所 需浓度2倍的DMSO溶液,混匀,平衡不同时间后, 移入KF.4型低温浴槽(辽阳恒温仪器厂制),以0.6 ?/mill速率降温至一30?,停留15min,移人液氮 中. 1.3.2化冻和DMSO的去除将在液氮中保存24 h的冻干管取出,立即放入40?恒温水浴中迅速摇 动,直到最后一个冰晶消失后分别移人室温和0? 冰水浴中,如表3所述,按不同方式用培养基稀释样 品. 1.3.3预冻温度和预冻时间预冻温度分别设置 一 30?和一4o?.预冻时问为在所需预冻温度下 停留的时问,分别为0,15,30和60min. 1.3.4存活率的测定参照Canavate及Lubian[12一 的方法,将稀释后的经过冰冻保存处理的藻细胞样 品与未冰冻的对照藻细胞样品进行再培养.盐生杜 氏藻再培养4d,青岛大扁藻再培养7d后测细胞密 度.根据预先完成的不同接种密度的未经冰冻处理 的藻细胞的生长曲线可以推算出上述冰冻样品和对 照样品在再培养开始时所具有的活细胞密度.二者 的百分比值即为冰冻保存的存活率,详见王起华 等 上述实验至少重复2次,每次实验设置3个平 行样品,除特殊说明外,文中数据为6个平行样品的 平均值及标准差. 2结果和讨论 2.1DMSO毒性实验 DMSO浓度和处理时间对盐生杜氏藻和青岛大 扁藻的生长的影响表明,DMSO对两种藻都有一定 的毒性,毒性大小随DMSO浓度的增加和(或)作用 时间的延长而加大.而且盐生杜氏藻比青岛大扁藻 对DMSO更敏感(表1).这一结果与闰立强等, Canavate及h2o]的结果相似.闰立强等-Lg]发 现,DMSO对两种蓝藻的毒性大小既与藻类种类有 关,也与DMSO浓度有关.Canavate及Lubian.对6 种分类系统不同的海洋微藻的深入研究进一步表 明,DMS0毒性大小还与其作用时间有关.我们的 实验结果指出,DMSO的使用浓度对盐生杜氏藻不 能超过10%,对青岛大扁藻应在20%以内.而处理 时阃的影响相对要小得多. 表1二甲基亚砜(DMSO)浓度和处理时间对藻类生长的影 响’ Table1Effectofdlmethylsulphoxyde(DUSO)~oncentrafior~and treaanenttimeonthealgae Datamea犯铲?SE(standarder瑚)0fthesurvival,udilufi~ methodA(?eTable3)alrccmtempeumae. 2.2mso浓度和平衡时间对存活率的影响 DMSO加入后,通常需要一定的平衡时间使其 渗透到细胞内,在室温下常用时间为15,30 min_llI”,l8l ,因此,我们比较了15和30rain的处理效 果.结果如表2所示,使用5%DMSO平衡30min 时,盐生杜氏藻可获得最大存活率,为23%,这和 Ben-Amotz及Gilb0a_1在相似条件下所得到的存活 率相近.在同样条件下保存—suec/ca时, Ben-Amotz报道了20%的存活率.目前尚未见冷冻 保存青岛大扁藻的报道.我们的结果表明,使用 20%DMSO平衡30rnin时,青岛大扁藻的存活率可 达到42%. 裹2二甲基亚砜(DMSO)浓度和平衡时间对冰冻保存存活 率的影响 T曲k2E伍鳅0fdjmd目dph?e(DMSO)concentrafiortsand their~lilibdumtime?theq.叩re8?埘0I1sttr~val? Dalaarethem曰蟹?SEdthesurfivalrate’岫廿lesample耐added DMSOinandnotcryapreserved瞄thecontrol,?Bgdilutlcnd|l0dA(9ee Table3)mI”OO111kmn 2.3D1.去除方法对存活率的影响 我们比较了不同稀释温度和稀释速率去除 D两种藻冰冻保存存活率的影响(表3;图1). 4期王起华等:盐生杜氏藻和青岛太扁藻的超低温保存 结果表明,稀释温度对存活率的影响极大,青岛大扁 藻在室温下稀释效果较好,而盐生杜氏藻需要在0 c下稀释才有较高的存活率.稀释速率对存活率也 有一定的影响.在适宜的稀释温度下,分步慢速稀 释要优于一步快速稀释 表3用稀释法去除二甲基亚砜(DMSO) Table3Renmvalofdimedaylsulphoxyde(DMSO)bydilution method D?1method A(rapidly) R(gradually) Operati~prel 0.卜2o.6 02—加4(5)一0.8(S)一1.6一(5)一5.6一(5 — 2o.6 c(dm儿y)i竺未们一..一”?一”?一 Dilutirgat00froom【enI岫Thenunr&bdf0thebracketsstand hthediluti~volume(mL),andinthebracketsstandforthes~talned time(n). 80 860 ? 三40 1 皇2o 0 ABCABC Roomtemperature(?)0(?) 图1.稀释温度和稀释速率对冰冻保存存活率的影响. Fj窖.1.Effectofdilutiontemperatureanddilutiontaleonthecry— opreservatS.onlvalrate. r5%d~ethylsulphccqMe(DMSO),f0r P/azy’mon~Ad~/a,u//caviii”tslr,~aoemt’susing20%删.the 删l1ililm1timeis30minhbothofthem.A,B.Cme叽dilution method(seeTatde3).Othersaxethesame趟in2. 在藻类冷冻保存中使用DMSO作保护剂时,对 其使用浓度的研究较多”.1,川,而对其去除方法 的研究很少,通常都采用室温下一步快速稀释 法l1】l”.1,关于稀释温度和稀释速率对存活率的影 响尚未见报道.在高等植物细胞的冷冻保存研究 中,DMSO等保护剂的去除通常在接近0?的较低 温度下进行,认为低温可以降低细胞代谢活动并减 少保护剂毒性从而提高细胞稳定’性.但Finkle及 Ulfichl2-却发现甘蔗和水稻细胞在0?下去除保护 剂是有害的,而在室温(22?)下可获得较高的存活 率这说明不同的实验材料对保护剂的去除方法有 不同的要求.我们的实验表明,在藻类细胞冰冻保 存中,DMSO的去除方法应根据藻类材料的特点来 选择,而稀释温度和稀释速率可能是影响存活率的 主要因素之一. 2.4预冻温度和预冻时间对存活率的影响 在藻类两步法冰冻保存中,常用的预冻温度为 一 25?一一5O?,常用的预冻时间为0,60 min[11,16,18,22J .我们的实验结果表明,预冻温度和预 冻时间均影响两种藻的存活率,其中预冻时间影响 极大.盐生杜氏藻在一40?下预冻60rain时可达 到最高存活率.而青岛大扁藻在一30?预冻30 min时存活率较高(表4).Levy及zmJ用甘油作 保护剂保存盐藻时,曾在一8o?预冻18h下获得 5o%一100%的存活率.我们的实验结果也表明,采 用较低的预冻温度和较长的预冻时间对保存盐生杜 氏藻是有利的. 微藻的冰冻保存目前普遍采用两步冷冻法.这 是由于两步法操作较简单,不需要贵重的程序降温 设备,而且在优化条件下同样可以获得较高的存活 率l翌.IA~$Orl等l笠J曾指出,影响两步法冰冻保存 效果的主要外部因素包括预冻温度,预冻时间,降温 速率,化冻速率和抗冻保护剂的种类,浓度和使用方 法等.如前所述,我们用DMSO做保护剂,采用优化 的两步法拎冻技术冰冻保存盐生杜氏藻和青岛大扁 藻都获得了高达5o%以上的存活率,已达到长期保 存所要求的指标.与Levy和7删和Mortain- Bertrand等_]J保存盐藻的方法相比,我们不需对盐 生杜氏藻进行高盐培养和冷驯化,也避免了使用高 浓度甘油做保护剂所带来的操作上的繁琐和不便. 而关于青岛大扁藻的超低温保存,本文首次作了报 道.我们还证实了在去除DMSO时,稀释温度和稀 释速率对存活率有很大的影响,这是藻类超低温保 存研究中一个值得进一步探讨的问题. 表4预冻温度和预冻时间对存活率的影响 Table4Effectofprefreezingtemperatmeandsustainedtimeon thesurvivalrate 抽( sinse)01530 nl珊一30—48—3?5?1一一 一 4029.3?0.8525?5757.0?2.5685?5.5 口”7 ffr[:一3011.70?49.43.378.310.35.6 v[K1- 40—444?62一 Duna//d/asahhau~ng5%-1_m1一一je(DMSO)usir~raelbodB (Table3)fordilufi~aair0?:for4rw.t~/ag- taoe~/sus吨20%DMSO,d~.tingbymethodc(seeTable3)atroom劬 pematre|Il?Hi啪time30rainhbothofthem0the —…inTable2 402植物AetaBamrak~S/rd~42卷 参考文献 【1]KKKcry.preserva0nofplantCellsand0m. BocaRaton,Florida:CRCPresslne,1985. [2】anL-C(简夸成).TheCryopmservafionofC,etmp]asms. ChenL(陈维伦),TaoC,-Q(陶国清).PlantBiotech— nologyBeijing:SdeneePress,1987.191—209. 【inChinese) [3]JianL-C(简令成),SunD-L(孙德兰),SunL-H(孙龙 华J.,~Jdie$onfactominc0pIeser帅ofs吨l删ca]- lu曲mEBots(植物),1987,29:123—131.(in Chia~e) [4]TaagD-T(唐定台).YangZ-Q(杨志琦),Yan~taY. Cryopreservafionofprotoplast-derivedcellst~spensionsof rice(西L.).Aeta鼬S/n(植物),1988, 30:357—361.(inChinese) 【5]JianL-C(简令成),SunL-H(孙龙华).Ca~-ation ofthe岫*耻msinChinese峭ebe町.Ac妞BatSift (植物),l鸺9,31:66—6B.(inChinese) 【6】SunI,H{孙龙华),JianL-C(简夸成).Q’yogreserwtio~ ofsainfointissueculturesandtheirultrastructuraloh~erva- floe.Am勘,Sin(植物),1990,32:262—267.(in Chinese) 【7]ChenP-L(胨品良),Hes-A(贺善安),JinW(金炜). Cry.p盹sem0IlofpollmfromEueonuru~?妇and . :艴?.Hu.AetamS/n(植物),1990, 291.fiIl0lir1ese) 32:288— 【8】LuoMz(罗美中),如嵋s-Y(蒋双英),TangH-x(汤辉 仙)C.,tyopreservationofpncelllinederivedfrom theprotoplastadtureofBre~icaoamp~risv.p. ActaBotSin(植物),1990.32:432—437.【 0l1ese1 [9】LiG-F(李国风),YeH-C{叶和春),D0IlgJ-W(董教 望),J|舳L-C(简令成),SunI-H(孙龙华).GIlL-M 【顾利民).c瑚6onofg日?iof咖如帅0. AaaBot胁(植物),1992.34:962—964.(in Chin~e) 【10】ljrIgL(粱立),xuB-F(徐秉芳),ZhengG-Y(郑从 义),ghouC(周嫦)P0u?c-ry~stionandpollen p,~tofl0aisolationinBr~k’acwDBpzeptwea. AcreBotSin(植物),1993,35:733—738.(in ChineseJ FendckC,DayJD.Cryopreserv~fionofTemm4~ suecwacture~加derdiffere~raJi/ieflr~n1esJ,q Phycd.1992.4:105—1?. Ca~avaleJP.Lu~alnLMSt?neaspectsonthectyop~ser- rationofmicroalgaeused?foodform日|irIespecies. c”L.1995.136:277—2帅. MaZ-Z(马志珍),丑删嚷J-H(张继红).s?on wk?meHlremaintemncespeciestechniqueofnfieroal- gaeformafieuhure.ChinJ只腼(中国水产科学), 1997,4:13—17.(inChmese) WangH(王起华),啦R-F(石若夫),ChengA-H(程爱 华).ldies0Iltheq唧0Ilofthreegoldenalg日e 唧,used?foodinmafieuhurec,盹 腼(中国水产科学),1999,2:89—92(inChinese) H.ZsmlrALong-teameryoeomervadonthehalotol— erant幽Duna//d/o.Trends‰,1994.如:3. Momin-Bem’a~A,EtehartF,deBot~mdMAmethodfor thectyoctmser~ationofDut,alldlasa!inafC5i:lmJ: Effectofandcoldadaptation.JPhy~f,1996.越: 346—352. 【17】SaksNMThepreservationofsaltmm’shalgaebycontrolled d?.fi’eez/ng.劬6蝴,1978,15:563—568. 【18】Ben-hmo~zA,GilhoaA.Cryopreservatlonofma血e唧cel- Maralgae.I.Asurceywithrerdtosize.cul— tttreage,pb口岫sym}【icactivityandch】0加pl叮?-to-eeUm- rioMar删Prog.1980.2:157—161. 【19】YahL-Q{闫立强),zlmS-R(赵树仁),c1.er.gA-H(程爱 华),WangH{王起华).Adyoneryoproteetantsfor theery~eservationoftwoblue-grt~algae.j”删T Notmo/(?宁师范大学).1993,16:153—155. {inChinese) 【20】Ca/~vateJP,LabianLM.Toleranceofsixmmanemiclool- gaetotheeryoptotoom~diu~thylsulfoxideandmethand., , 1994,3o:559—565. [21】FinkleBJ,UlrichJM.cr蹦?ec?removaltemperature BBafactorinthestavivalofnriceandsugarcaneceUs. C口-:.‰i:r.1982,19:329—335. 【22】LeesonEA,CannJP,M叩GJ.Maintenanceand pmtoz~.KirsopBE.MaintenanceofMicr~.sm Diego:Acade珂icPress.1984.140—157. (责任编辑:贺萍) 123456