浅谈hplc法检测咸鸭蛋中非法添加苏丹红染料

浅谈hplc法咸鸭蛋中非法添加苏丹红染料 . 浅谈HPLC法检测咸鸭蛋中非法添加苏丹红染料 杨沫银 内蒙古食品药品检验所(010020) 摘要:目的:完善检测方法，更好的监控非法添加物。方法:采用高效液相色谱法，改变提取溶剂。结果:苏丹红?、?、?、?分别在0μg/ml,2.56μg/ml范围呈良好线性关系，回收率在66%,80%之间，方法最低检出限在3.3μg/Kg,7.5μg/Kg(按蛋总重计算)之间。结论:方法简便，结果准确。 关键词:咸鸭蛋 高效液相色谱法 苏丹红 Abstract Objective: To perfect the method of measure method, Better monitoring of illegal additives. Method: Adopt HPLC to change the solvent extraction. Results: the calibration curve showed a good linearity with the range of 0μg/ml -2.56μg/ml for sudan , the range of recovery was 66%-80%, the limit of detection was 3.3μg/kg-7.5μg/kg (According to calculation of the total egg). Conclusion: the methed is simple and the result is accurate. [1]苏丹红属于化工染料，有?、?、?、?号四种。据文献报道，该物质具有偶氮结构，对人体的肝、肾器官有明显的毒副作用。经毒理学研究明，苏丹红具有致突变 [2]性和致癌性，国家明令禁止添加于食品中。本方法参照相关文献，将其提取方法进行了修订，改进后的方法具有分离效果好、灵敏、准确等优点。 1.样品来源:市售。 2.仪器与试药: 2.1 仪器 美国安捷仑-1100高效液相色谱仪，紫外-可见检测器，离心机，旋转蒸发仪等。 2.2 试剂 乙睛、丙酮、甲酸、为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为纯。 2.3 对照品 苏丹红由D-86199 Augsburg,Gemany提供 苏丹红?、苏丹红?、苏丹红?、苏丹红?纯度?85%。 2.4 层析用氧化铝(中性 100目,200目):105?干燥2h，于干燥器中冷却至室温，每100g中加入2ml水降活，混匀密封，放置12h后使用。 2.5 氧化铝层析柱:在层析柱管(1cm×5cm的注射器管)底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至3cm高，轻敲实后加一薄层脱脂棉，用10ml正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用。 . . 3.色谱条件: 3.1 色谱柱:Agilent ZORBAX SB- C18 3.5μm 4.6mm×150mm 3.2 流动相: A:0.1%甲酸的水溶液?乙睛 (85?15) B:0.1%甲酸的乙睛溶液?丙酮( 80?20) 流速:1ml/min;柱温:30?;检测波长478nm;进样量:10μl。梯度条件见表1 表1 梯度条件 流动相 时间(min) A% B% 0 25 75 10.0 25 75 25.0 0 100 32.0 0 100 35.0 25 75 40.0 25 75 4.方法学考察 4.1 溶液制备 4.1.1 对照品溶液的制备 分别精密称取苏丹红?、苏丹红?、苏丹红?、苏丹红?各10.0mg(按实际含量折算)，置250ml量瓶中，加乙醚溶适量使溶解，加正己烷稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密吸取标准储备液0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ml，置25ml量瓶中，加丙酮稀释至刻度，即得。此标准系列浓度为0、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56μg/ml。 4.1.2 供试品溶液的制备 称取粉碎样品2g,4g(准确至0.01g)，置50ml离心管中，加入水3m，l匀浆1min将其分散成糊状，加入正己烷?丙酮(3?1)6ml，充分匀浆5min，3000rpm离心10min，吸出正己烷液，于下层再加入次正己烷(4ml、4ml)，匀浆，离心，合并3次正己烷液，加入无水硫酸钠1g脱水，滤过，滤液置旋转蒸发仪蒸干并保持5分钟，用正己烷溶解并缓缓转移至已处理氧化铝层析柱上，用正己烷少量多次冲洗浓缩瓶，一并注入层析柱，用40ml正己烷洗脱至流出液无色，蒸干，残渣用丙酮适量使溶解并定容至2ml，过微孔滤膜(0.45μm)，即得。 . . 4.2 含量计算 按公式(1)计算苏丹红含量 C×V R = ????? ??????????????????(1) M R:样品中苏丹红含量，单位为mg/Kg; C:由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，单位为μg/ml; V:样液定容体积，单位为m l; M:样品质量，单位为g。 4.3线性关系的考察 分别精密称取苏丹红?、苏丹红?、苏丹红?、苏丹红?各10 mg(按实际含量折算)，置250ml量瓶中，加乙醚适量使溶解，加正己烷稀释至刻度，摇匀。精密吸取0ml、0.1ml、0.2 ml、0.4 ml、0.8 ml、1.6ml，置25ml量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10μl进样，按上述色谱条件测定。以峰面积对进样量进行回归分析，绘制标准曲线。结果见表2 表2 标准曲线测定结果 序 号 1 2 3 4 5 6 苏丹红?浓度(μg/ml) 0 0.1608 0.3216 0.6433 1.2867 2.5735 峰面积积分值平均值 0 7.00485 14.21628 28.25115 54.9508 110.3807 回归方程(苏丹红?) y=42.78x+0.2488 r=0.9999 苏丹红?浓度(μg/ml) 0 0.1671 0.3342 0.6684 1.3368 2.6736 峰面积积分值平均值 0 7.0934 14.10284 29.97735 58.42848 117.8936 回归方程(苏丹红?) y=44.132x-0.1852 r=0.9999 苏丹红?浓度(μg/ml) 0 0.1599 0.3198 0.6396 1.2792 2.5585 峰面积积分值平均值 0 6.783685 13.03387 27.85217 54.41752 110.2893 回归方程(苏丹红?) y=43.122x-0.2311 r=0.9999 苏丹红?浓度(μg/ml) 0 0.1609 0.3218 0.6436 1.2872 2.5745 峰面积积分值平均值 0 5.946615 11.76104 24.9113 48.44117 99.15771 回归方程(苏丹红?) y=38.504x-0.3077 r=0.9999 4.4 回收率试验 取已知不含添加剂的空白样品2份，分别精密加入苏丹红对照品适量，按拟订的含量测定方法制备供试品溶液，测定每份样品中苏丹红的含量，计算回收率。结果见表3 . . 表3 回收率试验结果 编号 取样量(g) 对照品加入量(μg) 样品含量(μg) 回收率(%) 苏丹红? 1.2867 0.9173 71.28 苏丹红? 1.3368 0.9890 73.98 1 2.311 苏丹红? 1.2792 0.8536 66.72 苏丹红? 1.2872 1.0326 80.21 苏丹红? 1.2867 0.9982 77.57 苏丹红? 1.3368 0.9688 72.47 2 2.881 苏丹红? 1.2792 0.8881 69.42 苏丹红? 1.2872 1.0057 78.13 4.5方法最低检出限试验 取已知不含添加剂的空白样品，分别精密加入苏丹红对照品适量，按拟订的含量测定方法制备供试品溶液，测定每份样品中苏丹红的含量，计算最低检出限。结果见表4 表4 最低检出限测定结果 苏丹红? 苏丹红? 苏丹红? 苏丹红? 按总蛋重计算(μg/Kg) 3.3 7.1 7.1 7.5 按蛋黄重计算(μg/Kg) 9.4 20.4 20.4 21.5 5.实验结果 在选定的条件下，苏丹红(?、?、?、?)与样品中其他组分色谱峰可基线分离，分离度均大于1.5，且苏丹红?、苏丹红?、苏丹红?、苏丹红?色谱峰之间基线分离，分离度均大于1.5;按苏丹红(?、?、?、?)峰计算，理论板数(N)均在10000以上。对照品、供试品、加样回收试验、最低检出限试验的HPLC图谱见图1,4。 6.讨论 6.1 层析用氧化铝活化程度的考察 不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须根据具体购置的氧化铝产品略作调整，活度的调整采用标准溶液过柱，将1μg/ml的苏丹红的混合标准溶液1ml加到柱中，用5%丙酮正己烷溶液60ml完全洗脱，4种苏丹红在层析柱上的流出顺序为苏丹红?、苏丹红?、苏丹红?、苏丹红?，可根据每种苏丹红的回收率作出判断。苏丹红?、苏丹红?的回收率较低表明氧化铝活性偏低，苏丹红?的回收率偏低时表明活性偏高。为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左. . 右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于0.5cm。 [2]6.2溶解对照品溶剂的考察:文献中，对照品用乙醚溶解后，用正己烷定容，其中苏丹红?、苏丹红?、苏丹红?色谱峰峰形较好，但苏丹红?色谱峰峰形较差，改用丙酮定容后，苏丹红?、苏丹红?、苏丹红?、苏丹红?色谱峰峰形均较好，理论板数均达到10000以上，故确定对照品定容溶剂为丙酮。 [3]6.3提取方法的考察:采用欧洲标准方法，加样回收试验中，杂质峰较多，对照 [2]品色谱峰与样品中其他组分色谱峰不能基线分离，故未采用其方法;文献中，在洗脱样品时采用10ml,30ml正己烷淋洗氧化铝层析柱，直至流出液无色。弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60ml洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5ml，经0.45μm有机滤膜过滤后待测。但实际加样回收试验中发现正己烷淋洗液中含有绝大部分对照品，而含5%丙酮的正己烷洗脱液中几乎无对照品，故将方法改为:在洗脱样品时用约40ml正己烷洗脱氧化铝层析柱，直至流出液无色，收集、蒸干后，用丙酮转移并定容至2ml，经0.45μm有机滤膜过滤后待测，加样回收试验结果为回收率在66%,80%之间，结果较好，采用改进方法。 参 考 文 献 [1] 夏宁 苏丹红的种类及其对人类的危害 内肛科技2005年第四期 [2] 中华人民共和国国家标准GB/T1961-2005 [3] 欧洲健康与消费者保护综合委员会第四分委员会——生产与流通环节的食品安全第三部——物理化学危害监督 新方法声明:03/99(辣椒粉以及辣椒为主要成分的产品中苏丹红和胭脂树橙的含量分析) . . 图1 苏丹红对照品色谱图 图2 供试品色谱图 图3 加样回收试验色谱图 图4 最低检出限试验色谱图 . . 结束 ….o---o…..o . . Aqwsedbg word .