[教学设计]什么是克隆技术

[]什么是克隆技术 什么是克隆技术 克隆～是Clone 的译音～意为无性繁殖。 "Clone"一词起源于希腊文"Klone"～原意是用"嫩枝"或"插条"繁殖。 现在"克隆"的含义已不仅仅是简单的"无性繁殖"～凡来自一个祖先～经过无性繁殖出的一群个体～也叫"克隆"。这种来自一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫"无性繁殖系"～简称无性系。在自然界～有不少植物具有先天的克隆本能～如番薯、马铃薯、玫瑰等插枝繁殖的植物。而动物的克隆技术～则经历了由胚胎细胞到体细胞的发展过程。克隆技术即无性繁殖技术。克隆羊多利,Dolly,～就是首次利用这种技术克隆成功的～它在工程史上揭开了新的一页。 多利羊的叫声响遍全球～ 这只不同凡响的小羊是由英国爱丁堡大学罗斯林学院(Edinburgh‘s Roslin Institute)的胚胎学家伊恩.威尔马特(Ian Wilmut)领导的科研小组从一只成年绵羊的乳腺细胞克隆出来的。 首先～威尔马特和他的同事们从一只不知姓名的Finn Dorset种白色妊娠绵羊的乳腺刮下若干个膜细胞。通常～这类细胞在10%的绵羊胎儿血清中能保持活性,血清是血液的液体成分～它富含类似于食物的细胞营养物质。但是～威尔马特意识到～利用使细胞处于休眠状态的标准技术～即将它们臵于浓度降低为0.5%血清之中～不仅可以使这些细胞"忘记"它们是乳房细胞～而且能使它们"记住"发育成整只绵羊的遗传指令。 这是一个重大的突破。以前～其他科学家不理解使细胞遗传物质和接受细胞遗传物质的卵细胞二者在发育上同步的重要性。以往～在其它实验室～基因在由卵细胞激活的发育过程中行进得过于超前。然而～威尔马特从Finn Dorset种母羊摘取的细胞并没有开始分裂DNA～并将之转译成绵羊特质,stuff of sheep,。处于休眠状态的乳房细胞的基因极易与卵细胞结合。然后～科学家从形体较小的苏格兰黑面羊摘取卵细胞～通过手术去除其细胞核,DNA的载体,。 威尔马特及其研究小组把白羊的乳腺细胞放入黑羊的已去除细胞核的卵细胞中～以一种弗兰肯斯坦,Frankensfein,式的技巧～用电脉冲使这些细胞的膜不仅结合在一起～而且两个细胞即刻合而为一。 下一步～利用标准的人工繁殖技术～将如此合成的卵细胞植入一只黑面母羊体内。4个月之后～这只举世震惊的小羊羔诞生了。人们发现它的颜色是白的～这暗示它与黑面母羊??它的生身之母不属于同一个品种。用几个月的时间进行了DNA ～最终证实～多利确实是一个学复制品,biological copy,。 二、克隆技术的发展 早在本世纪50年代～美国的科学家以两栖动物和鱼类作研究对象～首创了细胞核移植技术～他们研究细胞发育分化的潜能问题～细胞质和细胞核的相互作用问题。 英国牛津大学的科学家在1960年和1962年～先后用非洲一种有爪的蟾蜍,非洲爪蟾,进行过克隆试验。试验方式是光用紫外线照射爪蟾卵细胞～破坏其中的核～然后依靠高超的外科 手术从爪蟾蝌蚪的肠上皮细胞、肝细胞、肾细胞中取出核～并把这些细胞的核精确地放进已被紫外线破坏了细胞核的卵细胞内～经过精心照料～这些换核卵中终于有一部分长出了活蹦乱跳的爪蟾～这种爪蟾 不是经过精细胞和卵细胞州结合产生的～所以是克隆爪蟾。 1986年英国科学家魏拉德森首次把胚胎细胞利用细胞核移植法克隆出一只羊～以后又有人相继克隆出牛、羊、鼠、兔、猴等动物。而美国最近克隆猴取得成功～日本科学家也声称他们繁殖出200多头"克隆牛" 。以上所述的克隆动物～都是用胚胎细胞作为供体细胞进行细胞核移植而获得成功的。目前～克隆技术在英国又有了新的进展～他们把这一技术应用于人类造血事业。英国的PPL公司是克隆技术的经济后台～它的主管罗思詹姆斯博士说:"从研究多利中我们知道～我们可以用一个细胞制要的组成部分～也就是血浆。"他们与罗斯林研究所合作研究一种带有人类基因的牛和羊。他们先把动物体内的血浆取出～再取代人类的血浆～这种改变了基因的牛和羊体内就含有人类血浆的重要成分～通过对这些动物的饲养、再克隆或繁殖～就可以得到稳定可靠而且相对便宜的血资源～据统计在英国每年价值可达150万英镑。可谓效益匪浅。 我国的克隆技术也毫不逊色。60年代～学家童第周对金鱼、鲫鱼进行细胞核移植～1978年又成功地进行了黑斑蛙的克隆试验～他将黑斑蛙的红细胞的核移入事先除去了核的黑斑蛙卵中～这种换核卵最后长成能在水中自由游泳的蝌蚪。1979年春～中国科学院武汉水生研究所的科学家用鲫鱼囊胚期的细胞进行人工培养～经过385天59代连续传代培养后～用直径10微米左右的玻璃管在显微镜下从培养细胞中吸出细胞核～在此同时～除去鲫鱼卵细胞的核～让卵细胞留出空间作好接纳囊胚细胞核的准备～一切准备就绪后～把玻璃管吸出的核移放到空出位臵的鲫鱼卵细胞内～得到了囊胚细胞核的卵细胞在人工培养下大部分夭亡了～在189个这种换核卵细胞中～只有两个孵化出了鱼苗～而最终只有一条幼鱼度过难关～经过80多天培养后长成8厘米长的鲫鱼。这种鲫鱼并没有经过雌、雄细胞的结合～仅仅是给卵细胞换了个囊胚细胞的核～实际上是由换核卵产生的～因此也是克隆鱼。 鱼类换核技术的成熟和两栖类换核的成功～使一批从事良种培育的科学家激动不己～既然鲫色的囊胚细胞核取代鲫鱼卵细胞核后能得到克隆鱼～那么异种鱼换核能否得到新的杂种鱼呢,我国科学家首先提出了这个问题～也首先解决了这个问题～他们设法把鲤鱼胚胎细胞的核取代了鲫鱼卵细胞的核。鲤鱼细胞核和鲫鱼卵细胞质居然能相安无事～并开始了类似受精卵分裂发育的过程～最后长出有"胡须"的"鲤鲫鱼"～这种鱼有"胡须"～生长快～完全像鲤鱼～但它的侧线鳞片数和脊椎骨的数目与鲫鱼相同～而且鱼味鲜美不亚于鲫鱼。这种人工克隆新鱼种的出现为鱼类育种开辟了新途径。 1990年5月～西北农业大学畜牧所克隆一只山羊。1992年～江苏农科院克隆一只兔子。 1993年～中科院发育学研究所与扬州大学农学院合作～克隆一只山羊。1995年7月～华南师大与广西农大合作～克隆一头奶牛、黄牛杂种牛。1995年10月～西北农大克隆6头猪。 1996年12月～湖南医大克隆6只老鼠。同年中国农科院畜牧所克隆一头公牛犊。1997年3月～中国科学院动物研究所研究员陈大元率先提出了克隆大熊猫的设想。1999年～陈大元领导的小组将大熊猫的体细胞植入去核后的兔卵细胞中～成功地培育出了大熊猫的早期胚胎～克隆大熊猫面临的两个关键问题中的一个已经解决。 三、克隆技术的影响 小羊多利是世界上第一个利用体细胞克隆成功的动物。 克隆多利的成功～从理论上说明了高度分化的细胞～经过一定手段处理之后～也可回复到受精卵时期的合子功能,说明了在发育过程中～细胞质对异源的细胞核的发育有调控作用。它对遗传疾病的治疗、优良品种的培育和扩群等提供了重要途径～对物种的优化、 对转基因动物的扩群均有一定作用。另外～利用克隆技术可以大量复制珍稀动物～挽救濒危物种～调节大自然的生态平衡～为人类造福。 自克隆小羊多利成功后～世界各国引起强烈的反响～以致梵蒂冈教廷和美国总统克林顿都对之发了评论。有的人把它看作福音～有的人则把它视为祸水。 克隆技术取得突破～给人类带来极大的好处～最大的好处是培养大量品质优良的家畜～丰富人们的物质生活～使畜牧业的成本降低～效率提高～还可提供某些药物原料以提高人类免疫功能等。在小羊多利之前～英国 罗斯林研究所曾培育出一只奶中含治疗血友病药物原料的转基因羊～一家公司以50万英镑的高价买去。如果利用体细胞大批"复制"这只羊～就可挽救更多患者的生命。 英国PPL公司已培育出羊奶中含有治疗肺气肿的a一,抗胰蛋白酶的母羊。这种羊奶的售价是6千美元一升～一只母羊就好比一座制药厂。用什么办法能最有效、最方便地使这种羊扩大繁殖呢,最好的办法就是"克隆"。同样～荷兰PHP公司培育出能分泌人乳铁蛋白的牛～以色列LAS公司育成了能生产血清白蛋白的羊～这些高附加值的牲畜如何有效地繁殖,答案当然还是"克隆"。母马配公驴可以得到杂种优势特别强的动物---骡～然而骡不能繁殖后代～那么～优良的骡如何扩大繁殖,最好的办法也是"克隆"。我国的大熊猫是国宝～但自然交配成功率低～因此己濒临绝种。如何挽救这类珍稀动物"克隆"为人类提供了切实可行的途径。除此之外～克隆动物对于研究癌学、研究免 疫学、研究人的寿命等都有不可低估的作用。 不可否认～"克隆绵羊"的问世也引起了许多人对"克隆人"的兴趣～例如～有人在考虑～是否可用自己的细胞克隆成一个胚胎～在其成形前就冰冻起来。在将来的某一天～自身的某个器官出了问题时～就可从胚胎中取出这个器官进行培养～然后替换自己病变的器官～这也就是用克隆技术为人类自身提供"配件"。最新传出的消息却令全世界尤其是伦理学家严重不安。一项以"治疗疾病、用于器官移植"为名的"克隆"项目～竟然第一次复制了人类胚胎～这对于人类是福是祸～实在难以预料。 当代史证明～克隆技术只能复制出外貌特征相同的～不能克隆出被复制者原有的才能。人的才能受后天的制约。所以～即使有人能克隆出酷似上的伟大领袖、伟大科学家那样的人物～也仅在外貌上相同～却缺乏伟大领袖、伟大科学家那样的、气质、才能。 四、克隆技术的应用前景 克隆技术已展示出广阔的应用前景～概括起来大致有以下四个方面:,1,培育优良畜种和生产实验动物,,2,生产转基因动物,,3,生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法,,4,复制濒危的动物物种～保存和传播动物物种资源。以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一～转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器～以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多～除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外～转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长～已进行了10多年～但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验～5，6个药品进入2期临床试验,而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困 难所导致的成本过高和调控失灵～以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状～是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命～动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移～可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时～采用转基因体细胞系～可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前～先把目的外源基因和标记基因,如LagZ基因和新霉素抗生基因,的融合基因导入培养的体细胞中～再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆～然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中～最后生产出的动物在理论上应是100,的阳性转基因动物。采用此法～Schnieke等,Bio Report～1997,已成功获得6只转基因绵羊～其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因,新霉素抗性基因,～3只带有标记基因～目的外源基因整合率高达50,。Cibelli,Science～1997,同样利用核移植法获得3头转基因牛～证实了该法的有效性。由此可以看出～当今动物克隆技术最重要的应用方向之一～就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。 胚胎干细胞,ES,是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞。科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型～来替代那些受损的体内组织～比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内。科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞～使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠ES细胞分化为内胚层细胞。这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目前～科学家已成功分离到人ES细胞,Thomson等1998～Science,～而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能。把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚～把重组胚体外培养到囊胚～然后从囊胚内分离出ES细胞～获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞～肌肉细胞和血细胞,～用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗～而非得到克隆个体～科学家们称之为“治疗克隆”。 克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的～它为研究配子和胚胎发生～细胞和组织分化～基因表达调控～核质互作等机理提供了工具。 五、克隆技术存在的问题 尽管克隆技术有着广泛的应用前景～但离产业化尚有很大距离。因为作为一个新兴的研究领域～克隆技术在理论和技术上都还很不成熟～在理论上～分化的体细胞克隆对遗传物质重编,细胞核内所有或大部分基因关闭～细胞重新恢复全能性的过程,的机理还不清楚,克隆动物是否会记住供体细胞的年龄～克隆动物的连续后代是否会累积突变基因～以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。 在实践中～克隆动物的成功率还很低～维尔穆特研究组在培育“多莉“的实验中～融合了277枚移植核的卵细胞～仅获得了“多莉”这一只成活羔羊～成功率只有0.36,～同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有1.7,和1.1,～即使是使用“檀香山”技术～以分化程度较低的卵丘细胞为核供体～其成功率也只有百分之几。 此外～生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。以克隆牛为例～日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去,到2000年2月～日本全国已共有121头体细胞克隆牛诞生～但存活的只有64头。观察结果表明～部分犊牛胎盘功能不完善～其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平,有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育,克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向～这些都可能是死亡的原因。 即使是正常发育的“多莉”～也被发现有早衰迹象。染色体的未端被称为端粒～它决定着细胞能够分裂的次数:每一次分裂端粒都会缩短～而当端粒耗尽后细胞就失去了分裂能力。1998年～科学家发现“多莉”的细胞端粒比正常的要短～即其细胞处于更衰老的状态。当时认为～这可能是用成年绵羊的细胞克隆“多莉”造成的～使其细胞具有成年细胞的印记～但这一解释目前受到了挑战～美国马萨诸塞州的医生罗伯特?兰扎等用培养的衰老细胞克隆牛～得到6头小牛～出生5，10个月后发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长～有的甚至比普通新生小牛的端粒还长。现在还不清楚这一现象的原因～也不清楚为何与“多莉“的情况有巨大差别。但这一实验说明～在一些情况下克隆过程能改变成熟细胞的分子钟～使其“恢复青春”～关于这种变化对克隆动物寿命的影响～还有待于进一步观察。 除了以上的理论和技术障碍外～克隆技术,尤其是在人胚胎方面的应用,对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明～世界各科技大国都不甘落后～谁也没有放弃克隆技术研究。这一点上英国政府的态度非常具有代表性～在1997年2月底宣布中止对“多莉”研究小组投资后不到1个月～英国科技委员会就对克隆技术发表专题报告～表明英国政府将重新考虑这一决定～认为盲目禁止这方面的研究并不是明智之举～关键在于建立一定的规范利用它为人类造福。 一、克隆的早期研究 克隆一词是英文单词clone的音译～作为名词～c1one通常被意译为无性繁殖系。同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的～例外仅见于有突变发生时。自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆～例如:同卵双胞胎实际上就是一种克隆。然而～天然的哺乳动物克隆的发生率极低～成员数目太少,一般为两个,～且缺乏目的性～所以很少能够被用来为人类造福～ 因此～人们开始探索用人工的方法来生产高等动物克隆。这样～克隆一词就开始被用作动词～指人工培育克隆动物这一动作。 目前～生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”～以及其后各国科学家培育的各种克隆动物～采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植～是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核～经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中～重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同～细胞核移植技术～特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法～故人们往往把它称为动物克隆技术。 采用细胞核移植技术克隆动物的设想～最初由汉斯?施佩曼在1938年提出～他称之为“奇异的实验”～即从发育到后期的胚胎,成熟或未成熟的胚胎均可,中取出细胞核～将其移植到一个卵子中。这一设想是现在克隆动物的基本途径。 从1952年起～科学家们首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验～先后获得了蝌蚪和成体蛙。1963年～我国童第周教授领导的科研组～首先以金鱼等为材料～研究了鱼类胚胎细胞核移植技术～获得成功。 哺乳动物胚胎细胞核移植研究的最初成果在1981年取得——卡尔?伊尔门泽和彼得?霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。1984年～施特恩?维拉德森用取自羊的未成熟胚胎细胞克隆出一只活产羊～其他人后来利用牛、猪、山羊、兔和猕猴等各种动物对他采用的实验方法进行了重复实验。1989年～维拉德森获得连续移核二代的克隆牛。1994年～尼尔?菲尔斯特用发育到至少有120个细胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年～在主要的哺乳动物中～胚胎细胞核移植都获得成功～包括冷冻和体外生产的胚胎,对胚胎干细胞或成体干细胞的核移植实验～也都做了尝试。但到1995年为止～成体动物已分化细胞核移植一直未能取得成功。 二、克隆羊“多莉”的意义和引起的反响 以上事实说明～在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前～胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上～“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程～但这并不能减低“多莉”的重大意义～因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物～是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着:在理论上证明了～同植物细胞一样～分化了的动物细胞核也具有全能性～在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化,在实践上证明了～利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的～将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植～并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作～从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。 在理论上～利用同样方法～人可以复制“克隆人”～这意味着以往科幻小说中的独裁狂人克隆自己的想法是完全可以实现的。因此～“多莉”的诞生在世界各国科学界、政界乃至宗教界都引起了强烈反响～并引发了一场由克隆人所衍生的道德问题的讨论。各国政府有关人士、民间纷纷作出反应:克隆人类有悖于伦理道德。尽管如此～克隆技术的巨大理论意义和实用价值促使科学家们加快了研究的步伐～从而使动物克隆技术的研究与开发进入一个高潮。 三、近3年来克隆研究的重要成果 克隆羊“多莉”的诞生在全世界掀起了克隆研究热潮～随后～有关克隆动物的报道接连不断。1997年3月～即“多莉”诞生后1个月～美国、中国台湾和澳大利亚科学家分别发表了他 们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过～他们都是采用胚胎细胞进行克隆～其意义不能与“多莉”相比。同年7月～罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊“波莉”,Polly,。这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。 1998年7月～美国夏威夷大学Wakayama等报道～由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠～其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代～这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。此外～Wakayama等人采用了与“多莉”不同的、新的、相对简单的且成功率较高的克隆技术～这一技术以该大学所在地而命名为“檀香山技术”。 此后～美国、法国、荷兰和韩国等国科学家也相继报道了体细胞克隆牛成功的消息,日本科学家的研究热情尤为惊人～1998年7月至1999年4月～东京农业大学、近畿大学、家畜改良事业团、地方,石川县、大分县和鹿儿岛县等,家畜试验场以及民间企业,如日本最大的奶商品公司雪印乳业等,纷纷报道了～他们采用牛耳部、臀部肌肉、卵丘细胞以及初乳中提取的乳腺细胞克隆牛的成果。至1999年底～全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管,子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。 2000年6月～中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”～但其中一只因呼吸系统发育不良而早夭。据介绍～所采用的克隆技术为该研究组自己研究所得～与克隆“多莉”的技术完全不同～这表明我国科学家也掌握了体细胞克隆的尖端技术。 在不同种间进行细胞核移植实验也取得了一些可喜成果～1998年1月～美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体～成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎～这一研究结果表明～某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。虽然这些胚胎都流产了～但它对异种克隆的可能性作了有益的尝试。1999年～美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎,我国科学家也用兔卵子克隆了大熊猫的早期胚胎～这些成果说明克隆技术有可能成为保护和拯救濒危动物的一条新途径。 四、克隆技术的应用前景 克隆技术已展示出广阔的应用前景～概括起来大致有以下四个方面:,1,培育优良畜种和生产实验动物,,2,生产转基因动物,,3,生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法,,4,复制濒危的动物物种～保存和传播动物物种资源。以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一～转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器～以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多～除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外～转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长～已进行了10多年～但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验～5，6个药品进入2期临床试验,而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵～以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状～是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命～动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移～可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时～采用转基因体细胞系～可以在实验 室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前～先把目的外源基因和标记基因,如LagZ基因和新霉素抗生基因,的融合基因导入培养的体细胞中～再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆～然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中～最后生产出的动物在理论上应是100,的阳性转基因动物。采用此法～Schnieke等,Bio Report～1997,已成功获得6只转基因绵羊～其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因,新霉素抗性基因,～3只带有标记基因～目的外源基因整合率高达50,。Cibelli,Science～1997,同样利用核移植法获得3头转基因牛～证实了该法的有效性。由此可以看出～当今动物克隆技术最重要的应用方向之一～就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。 胚胎干细胞,ES,是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞。科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型～来替代那些受损的体内组织～比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内。科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞～使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠ES细胞分化为内胚层细胞。这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目前～科学家已成功分离到人ES细胞,Thomson等1998～Science,～而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能。把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚～把重组胚体外培养到囊胚～然后从囊胚内分离出ES细胞～获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞～肌肉细胞和血细胞,～用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗～而非得到克隆个体～科学家们称之为“治疗克隆”。 克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的～它为研究配子和胚胎发生～细胞和组织分化～基因表达调控～核质互作等机理提供了工具。 五、克隆技术存在的问题 尽管克隆技术有着广泛的应用前景～但离产业化尚有很大距离。因为作为一个新兴的研究领域～克隆技术在理论和技术上都还很不成熟～在理论上～分化的体细胞克隆对遗传物质重编,细胞核内所有或大部分基因关闭～细胞重新恢复全能性的过程,的机理还不清楚,克隆动物是否会记住供体细胞的年龄～克隆动物的连续后代是否会累积突变基因～以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。 在实践中～克隆动物的成功率还很低～维尔穆特研究组在培育“多莉“的实验中～融合了277枚移植核的卵细胞～仅获得了“多莉”这一只成活羔羊～成功率只有0.36,～同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有1.7,和1.1,～即使是使用“檀香山”技术～以分化程度较低的卵丘细胞为核供体～其成功率也只有百分之几。 此外～生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。以克隆牛为例～日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去,到2000年2月～日本全国已共有121头体细胞克隆牛诞生～但存活的只有64头。观察结果表明～部分犊牛胎盘功能不完善～其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平,有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育,克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向～这些都可能是死亡的原因。 即使是正常发育的“多莉”～也被发现有早衰迹象。染色体的未端被称为端粒～它决定着细胞能够分裂的次数:每一次分裂端粒都会缩短～而当端粒耗尽后细胞就失去了分裂能力。1998年～科学家发现“多莉”的细胞端粒比正常的要短～即其细胞处于更衰老的状态。当时认为～这可能是用成年绵羊的细胞克隆“多莉”造成的～使其细胞具有成年细胞的印记～但这一解释目前受到了挑战～美国马萨诸塞州的医生罗伯特?兰扎等用培养的衰老细胞克隆牛～得到6头小牛～出生5，10个月后发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长～有的甚至比普通新生小 牛的端粒还长。现在还不清楚这一现象的原因～也不清楚为何与“多莉“的情况有巨大差别。但这一实验说明～在一些情况下克隆过程能改变成熟细胞的分子钟～使其“恢复青春”～关于这种变化对克隆动物寿命的影响～还有待于进一步观察。 除了以上的理论和技术障碍外～克隆技术,尤其是在人胚胎方面的应用,对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明～世界各科技大国都不甘落后～谁也没有放弃克隆技术研究。这一点上英国政府的态度非常具有代表性～在1997年2月底宣布中止对“多莉”研究小组投资后不到1个月～英国科技委员会就对克隆技术发表专题报告～表明英国政府将重新考虑这一决定～认为盲目禁止这方面的研究并不是明智之举～关键在于建立一定的规范利用它为人类造福。 摘自《世界农业》