c—myc对大鼠黄体细胞人绒毛膜促性腺激素诱导的孕酮和雌二醇生

c—myc对大鼠黄体细胞人绒毛膜促性腺激素诱导的孕酮和雌二醇生 c—myc对大鼠黄体细胞人绒毛膜促性腺激 素诱导的孕酮和雌二醇生 (67一f7O 生殖医学杂志1998年9月第7卷第3期 C—myc ? 167? 对大鼠黄体细胞人绒毛膜促性腺激素 诱导的孕酮和雌二醇生成的影响厶 郑月慧徐斯况海斌方廉. 33j'2 摘要应用离体细胞体外孵育法研究了反义c—myc寡脱氧核苷酸(反义c—mycODN)对大鼠黄体 细胞人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导的孕酮(P)和雌二醇(E.)生成的影响及其与外源性cAMP和ca. 的关系.结果发现,反义c—mycODN能呈剂量相关方式抑制黄体细胞hCG诱导的P和Ez的生成.在浓 度分别为lO和5/lmol/L时的抑制作用即具有显着意义(尸<O.05);而无义tat寡脱氧核苷酸则无此作 用.反义c—mycODN对黄体细胞hCG诱导的P和E.产生的抑制作用能被加入10mol/L二丁酰 cAMP逆转,钙离子通道阻断剂维拉帕米对此种抑制作用具有协同效应.结果提示,c—myc癌基因参与 黄体细胞hCG诱导的P和E.生成的调控. 关键词c—myc反义寡脱氧核苷酸黄体细胞孕酮雌二醇卜Ic Effectofc-myconthehumanchorionicgonadotropininduced progesteroneandestradiolproductionofratlutealcells ZHENGYuehui,XUSifan,KUANGHaibing,FANGLian DepartmentofPhysiology,JiangxiMedicalCollege,Nanchang330006 Objective:Theeffectofc—mycantisenseoligodeoxynucleotides(antisensec— mycODN)onthehu— manchorionicgonadotropin(hCG)inducedprogesteroneandestradiolproductionofisolate dratluteal cellsandtheirrelationshipwithcAMPandCawereinvestigated. Design:Labortorystudies. Setting:LabortoryinDepartmentofPhysiology,JiangxiMedicalCollege. Methods:Incubationofisolatedratlutealcellsinvitro. Results:Antisensec—mycODNinhibitedthehCG— inducedprogesteroneandestradiolproductionin adose— dependentmanner,attheconcentrationof10/~mol/Land5/~mol/Lrespectively,theinhibiti ons weresignificant(尸 <O.05)whencomparedwiththecontro1.ButnonsensetatODNhadnosimilaref— fectonlutealcells.FutherexperimentsshowedthattheinhibitionofantisenseC-mycODNon thehCG inducedprogesteroneandestradiolproductioncouldbereversedbydbcAMP(10一 mol/L).Verapamil (10一mol/L)hadsynergisticeffectontheinhibitoryfunctionofantisensec—mycODN. Conclusion:ItispossiblethatcAMP.Ca一 dependentpathwaymaypromoteexpressionofthe protooncogenes,which,inturn,mayleadtOregulationoflutealcellfunction. Keywords:c—mycAntisenseoligodeoxynucleotideLutealcellsProgesterone Estradiol 最近文献?报道,原癌基因参与卵巢功能 的调控.c—myc是一个结构特殊,功能众多的核 内癌基因,在大鼠离体卵巢颗粒细胞,大鼠在 体卵泡和黄体.以及人和猴卵巢中均有表 达,其表达强度随着卵泡发育和黄体退化的不 同阶段而改变,在发育中的卵泡及早期黄体中 c—mycmRNA及c—myc蛋白表达较多,随黄体 本课为国家自然科学基金资助项目 作者单位:330006南昌市江西医学院生理教研室生 殖研究室 退化,表达强度下降;促性腺激素在诱导卵巢产 生甾体激素增加前,也伴有c—myc表达的增 强[2].提示,c—myc癌基因与卵巢功能密切相 关.一般认为,cAMP是黄体生成素/人绒毛膜 促性腺激素(LH/hCG)调节黄体细胞甾体激素 分泌功能的第二信使,但一定浓度的ca对 LH诱导黄体细胞甾体激素分泌是必需的[6]. 为此,本实验研究了反义c—myc寡脱氧核苷酸 对大鼠黄体细胞hCG诱导的孕酮(P)和雌二醇 E)产生的影响,初步探讨其与外源性cAMP 和Ca.的关系,以进一步了解卵巢的生理调控 机制. 和 1.主要试剂:(1)孕马血清促性腺激素 (PMSG):天津实验动物中心产品,用生理盐水 配成100IU/O.2ml.(2)hCG:预处理动物所用 hCG为上海生物化学制药厂产品,用生理盐水 配成50IU/O.2ml;离体实验所用hCG为日本 三共I—N药品株式会社产品.(3)最低必需培养 基(MEM)培养液:美国LifeTechnologies产 品,内加25mmol/LHepes和1BSA,以及青 霉素100IU/ml和链霉素100t~g/ml,用7. 6%NaHCO.调至pH7.2,7.4.(4)二丁酰 cAMP(dbcAMP),维拉帕米(Verapamil)和胶 原酶:均为美国Sigma化学公司产品.(5)寡脱 氧核苷酸(ODN):上海生物工程中心合成.反 义c—mycODN,与c—myc第二外显子开头5个 三联码序列互补合成,并用硫代磷酸修饰,序列 为5'一AACGTTGAGGGGCAT一3';无义tat 0DN,与HIV—tat基因的5399,5413碱基序 列互补合成,并用硫代磷酸修饰,核苷酸序列为 5'一CATTTCTTGCTCTCC一3. 2.动物模型及黄体细胞孵育:选用25,29 天龄未成年健康雌性Sprague—Dawley(SD)大 白鼠,体重7O土4g,每鼠皮下注射(sc)PMSG 65IU,64小时后,每鼠SChCG35IU,于注射 hCG后7天断头处死,迅速取出卵巢,并剪碎. 置200IU/ml胶原酶培养液中消化,此后操作 生殖医学杂志1998年9月第7卷第3期 流程按文献[73进行.分装成每管含活细胞1× 1Oe个/ml,一组6份.预孵育3O分钟后,加入 处理试剂,继续孵育4小时,取上清液贮于一 2O?待测P和E2. 3.测试方法:(1)细胞活力;用0.2台盼 蓝染液测定.取细胞悬液和台盼蓝染液各一滴 室温下混匀,2o分钟后显微镜下检测.活力一 般在90以上.(2)P和E:用放射免疫法 (RIA)测定,放免药盒为天津九鼎医学生物工 程有限公司产品.测定时设有内,外质控血清, 批间及批内变异系数分别为6.9和3.7. 4.统计处理:结果以(土s)表示,应用组 间均数t检验. 结果 1.不同浓度反义c—myc寡脱氧核苷酸对大 鼠黄体细胞hCG诱导P和E生成的影响:黄 体细胞在孵育4小时后,基础P和E生成量分 别为34.51?6.28ng/10.个细胞和5.29土 2.42pg/lO个细胞,5IUhCG使P和E2生成 量分别增至263.94土43.22ng/lO个细胞和 18.32土4.15pg/lO个细胞,与基础组比较均 有非常显着差异(尸<o.01,一6).表明黄体细 胞对hCG反应良好.反义C—mycODN对黄体 细胞hCG诱导的P产生有抑制作用,随着反义 c—mycODN浓度的增加,黄体细胞P生成量不 断下降,两者有明显的线性关系(y一一0.95,P <0.05);在浓度为10~mol/L时,对hCG诱导 的P生成呈显着的抑制作用(尸<0.05),增至 20/~mol/L时则有非常显着的抑制作用(P< 0.01).黄体细胞hCG诱导的E产生也随反义 c—mycODN浓度的增加而下降,在浓度为5 t~mol/L时,下降有显着意义(P<o.05).无义 tatODN对黄体细胞hCG诱导的P和E生成 均无明显影响(表1). 2.二丁酰cAMP对反义c—myc寡脱氧核 苷酸抑制大鼠黄体细胞hCG诱导的P和E生 成的影响:从表2可见,10mol/LdbcAMP能 使黄体细胞hCG诱导的P和E生成明显增 生殖医学杂志1998年9月第7卷第3期 加;而2Ot~mol/L反义c—mycODN使hCG诱 导的P和E.生成明显下降;当二者共同作用 时,使反义c—mycODN的抑制作用完全逆转,P 和E.的水平接近仅用dbcAMP组. 表1不同浓度反义c—myc寡脱氧核苷酸 对大鼠黄体细胞hCG诱导的P和E 生成的影响(士s) o263.94土43.2218.32土4.15 5220.71土14.O8l1.88土3.16 1O176.O3土14.75'11.O9土2.16' 20155.43土2O.O51O.29土1.25 z.呲s..s 注:n一6,与.浓度比较,P<o.05,一P<o.Ol,每组 均加入hCG5IU/ml 3.维拉帕米对反义C—myc寡脱氧核苷酸抑 制大鼠黄体细胞hcG诱导的P和E.生成的影 响:实验结果显示,10mol/L维拉帕米使大鼠 黄体细胞hCG诱导的P和E.生成量分别下降 28和37;而2Ot~mol/L反义c—mycODN 使黄体细胞hCG诱导的P和E.生成量分别下 ?169? 降42;二者共同作用时,P和E.生成分别下 降66和63,呈协同效应(表3). 讨论 本实验应用人工合成的反义15聚c—myc 寡脱氧核苷酸,因其能与c—myc基因的始 序列互补,从而在翻译水平抑制该基因的表达; 为了增加其膜通透性并防止进入细胞后受到核 酸酶的降解,在磷酸基团上给予了硫代化修饰. 从结果可见,反义c—mycODN能呈剂量相关性 抑制大鼠黄体细胞hcG诱导的P和E.的生 成,而无义tatODN由于与c—myc无同源互补 序列,未观察到类似的作用.表明c—mycODN 的作用是序列特异性和剂量依赖性的.研究证 实,c—myc存在于鼠,猴和人的卵巢中,且其表 达量在卵泡和黄体发育的不同阶段呈现动态 变化;促性腺激素在诱导卵泡发育和黄体生成 时伴有c—myc癌基因表达量的改变,而且这种 改变伴随着卵巢内分泌功能的改变.故而推测 c—myc参与了卵巢功能的调控[2].本实验证 明,c—myc与卵巢黄体细胞hCG诱导的P和E. 生成密切相关. 表2二丁酰cAMP对反义c—myc寡脱氧核苷酸抑制大鼠黄体细胞hCG诱导的P 和E生成的影响(5-t-s) 注:n一6,与hCG组比较,'P<O.05,一P<0.01,与hcG+反义c—mycODN组比 较,zXzXp<0.01 表3维拉帕米对反义c—myc寡脱氧核苷酸抑制大鼠黄体细胞hCG诱导的P和E 生成的影响(5-t-) 注:n=6,与hCG组比较,P<0.05,一P<0.01,与hCG+I~Rc—mycODN组比 较,zxp<0.05,zXzXp<0.01 ?17O? 在大鼠颗粒细胞及猪睾丸间质细胞的体外 培养时发现,促性腺激素和一些生长因子能通 过cAMP和蛋白激酶C依赖性途径使c—myc 癌基因表达增强,而后伴有性腺内分泌功能的 改变[2;c—myc和c—fos,c—myb同属核内癌基 因,其表达的调控机制应有相似之处,我们发 现,cAMP能诱导黄体细胞c—fos和c—myb的 表达,并伴有P和E.生成的增加(待发表资 料).因此cAMP与黄体细胞中c—myc表达可 能有关.本实验观察到,当dbcAMP与反义 c—mycODN共同作用时,后者对黄体细胞hCG 诱导的P和E.生成的抑制作用基本解除,P和 E.生成量接近于单独用dbcAMP的水平.这种 作用是否与cAMP通过诱导c—myc表达的增 强有关,值得重视.钙对c—myc表达有何影响尚 不清楚.在大鼠睾丸支持细胞观察到与c—myc 同类的核内癌基因c—fos,Ca.对诱导其表达是 必需的[9].本实验选用钙离子通道阻断剂—— 维拉帕米,以观察在黄体细胞胞浆中Ca.浓度 下降时,对反义c—mycODN抑制黄体细胞 hCG诱导的P和E.生成的影响.结果表明, 10mol/L维拉帕米能明显抑制hCG诱导的P 和Ez生成,与反义c—mycODN共同作用时,抑 制作用具有协同效应.这种协同效应是否因胞 内ca.下降从而进一步抑制c—myc表达值得 注意. 生殖医学杂志1998年9月第7卷第3期 参考文献 1郑月慧,徐斯凡,方廉.癌基因与性腺功能.生理科学进 展,1996,27:344. 2DelidowBC,LynchJP,WhiteBA,eta1.Regulationot protooncogeneexpressionandde0xyr|b0nucleicacidsyn— thesisingranulosacellsofperifusedimmatureratovaries. BiolReprod,1992,47:428. 3PiontkewitzY,Sundfe|dtK,HedinL.Theexpressionot c—mycduringfolliculargrowthandlutealformationinthe ratovaryinvivo.JEndocrinol,1997,152:395. 4PutowskiLT,SkrzypczakM,ZielewiczJ,eta1.Therele— vanceofc-myctothephysiologyofthehumanovary.Gy— necolEndocrinol,1997,11:5. 5FraserH,LunnSF,CowenGM,eta1.Inducedlutealre— gressionintheprimate:evidenceforapoptosisand changesinc—mycprotein.JEndocrinol,1995,147:131. 6DorflingerLJ,AlbertPJ,eta1.Calciumisaninhibtorot luteinizinghormone—sensitiveadenylatecyclaseinthe lutealcel1.End0crjn0l0gy,1984,l14:1208. 7郑月慧,徐斯凡,张保平,等.内皮素一1对大鼠排卵前卵泡 颗粒细胞产生孕酮的影响.中国应用生理学杂志,1997, 13:171. 8HallSH,BerthelonMC,AvalletO,eta1.Regulationof c—fos.c—Jun.Jun—B.andc—mycmessengerribonucleic acidsbygonadotropinandgrowthfactorsinculturedpig Leydigcel1.Endocrinology,1991,129:1243. 9JiaMC,RavindranathN,PapadopoulosV,eta1.Regula— tionofc—fosmRNAexpressioninSertolicellsbycyclic AMP,calcium.andproteinkinasecmediatedpathways. M0lCellBiochem.1996,156:43. (收稿:1997—11—22修回:1998—06—22) 第l2届世界儿童和青少年妇科会议在芬兰召开 由国际儿童和青少年妇科联合会及芬兰儿童和青少年妇科学会联合举办的第12 届世界儿童和青少年妇科会 议于1998年5月31日至6月3日在芬兰赫尔辛基隆重召开来自60多个国家大 约500多名代表参加了会议.生 殖医学杂志总编,北京协和医院葛秦生教授作为国际儿童和青少年妇科联合会会 员应邀参加了会议.共有65名代 表作了大会发言,250名代表张贴了他if]i~床和科研成果.会议分一个主会场和4个分会场同时进行.与会代表们 讨论了儿童青少年常见的妇科疾病,如:闭经,多囊卵巢综合征,功能性子宫出血以及妇科肿瘤,性发育异常,包括 特纳综合征及肾上腺皮质增生等疾病的诊断和处理,并围绕青少年的生长和发育,骨密度峰值的增加,青春期性教 育及性传播性疾病的预防等进行了热烈的讨论.美国着名生殖内分泌专家Samue1.S.C.Yen教授为大会作了题 为"多囊卵巢的病理生理和功能性闭经机制"的精彩报告.大会在热烈的气氛中闭幕,与会代表期待于第13届世界 儿童和青少年妇科会议上再见. (何方方)