费氏丙酸杆菌谢氏亚种和植物乳杆菌中亚油酸异构酶的分离纯化

费氏丙酸杆菌谢氏亚种和植物乳杆菌中亚油酸异构酶的分离纯化 ( ) 中国农业科技导报 , 2009 , 11 2 : 49 - 55 Jou rna l of A gricu ltu ra l Sc ience and Techno logy 费氏丙酸杆菌谢氏亚种和植物乳杆菌中 亚油酸异构酶的分离纯化 11 , 2 1 刘 王丽敏 ,吕加平 ,鹭 ( 1. 中国农业科学院农产品加工研究所 , 农业部农产品加工与质量控制重点开放实验室 , 北京 100193; ) 2. 中国科学院微生物研究所 , 北京 100190 摘 要 :采用盐析 、Sep hac ryl S2200HR 凝胶过滤层析 、D EA E Sep ha ro se F. F. 离子交换层析相结合的方法 ,分别 ( )()建立了来源于费氏丙酸杆菌谢氏亚种 P. feuden reich ii ssp. sherm an ii和植物乳杆菌 L. plan ta rum 的亚油酸 异构酶的分离提取 。结果明不 同来源的亚油酸异构酶 在纯化的过程中表现出不 同的 洗 脱 特 性 , P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii亚油酸异构酶的分子质量约为 56 kD a, L. plan ta rum 亚油酸异构酶的分子质量为50. 65 kD a。不同来源亚油酸异构酶的分离纯化方法存在差异 。 ( ) ( ) ( 关键词 :共轭亚油酸 CLA ;费氏丙酸杆菌费氏亚种 P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii; 植物乳杆菌 L. plan ta2 ) rum ;亚油酸异构酶 ( ) 中图分类号 : Q939. 97 文献标识码 : A 文章编号 : 1008 20864 20090220049 207 Iso la t ion an d Pur if ica t ion of L in o lea te Isom era se from P. f reu den re ich ii ssp . sh e rm a n ii an d L . p la n ta rum 1 , 2 1 1WAN G L i2m ing, LV J ia2p ing, L IU L u ( 1. Key L abo ra to ry of A gro2food P roce ssing and Q ua lity Con tro l, MOA , In stitn te of A gro2food Sc ience and Techno logy, Ch ine se A cadem y of A gricu ltu ra l Sc ience s, B e ijing 100193; )2. In stitu te of M ic rob io logy, Ch ine se A cadem y of Sc ience, B e ijing 100190 , Ch ina A b stra c t: U sing sa lting2ou t m e thod, com b ined w ith Sep hac ryl S2200HR ge l filtra tion ch rom a tograp hy and D EA E Sep ha ro se F. F. ion exchange ch rom a tograp hy, lino lea te isom e ra se wa s iso la ted and p u rified from P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii and L. plan ta rum , re sp ec tive ly. lino lea te isom e ra se from d iffe ren t sou rce s showed d iffe ren t e lu tion cha rac te ristic s in the p u rifica tion p roce ss. The mo lecu la r we igh t of lino lea te isom e ra se from P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii wa s 56 kD a, and tha t from L. plan ta rum wa s 50. 65 kD a. The re su lt ind ica ted tha t b ig d iffe rence s existed in the p u rifica tion m e thod of lino lea te isom e ra se due to the ir d iffe ren t sou rce s. ( ) Key word s: con juga ted lino le ic ac id CLA ; P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii; L. plan ta rum ; lino lea te isom e ra se [ 6 , 7 ] ( ) con juga ted lino le ic ac id, CLA 是 化法 、脱 水 法 、溴 化 /脱 溴 化 氢 法 等 。生 物 合共轭亚油酸 ( )由必需脂肪酸亚油酸 lino le ic ac id, LA 衍生的 18 成法是采用特定的酶或微生物催化相应的底物而 碳 共 轭 双 烯 酸 的 多 种 位 置 和 几 何 异 构 体 的 总 [ 8,10 ] 生成 CLA 。微生物亚油酸异构酶即可将 LA [ 1 ] 称 。天然 CLA 主要存在于反刍动物牛 、羊等的 [ 2 ] 异构化生成 CLA。因此 通 过对 不同 来 源的 亚油 乳脂 及 其 肉 制 品 中 。大 量 的 动 物 实 验 表 明 酸异构酶提取纯化 ,有利于了解亚油酸异构酶的 CLA 能 够 有 效 抑 制 癌 症 的 发 生 , 抗 动 脉 粥 样 硬 化 ,减少脂肪积累 ,改善 ?型糖尿病的代谢参数和 酶学性质及作用机理 ,为生物法合成 CLA 提供理 [ 3,5 ] 免疫调节等 。目前 CLA 的生 产 方法 主要 为 论基础 。 [ 11 ] 化学合成法和生物合成法 。化学合成法包括异构 ( Kep le r等 首 次 从 溶 纤 维 丁 酸 弧 菌 B u2 ) ty rivib rio f ibriso lvensA 238 中分离提取出亚油酸异 收稿日期 : 2008 209 227; 修回日期 : 2009 203 206 ( ) 基金项目 :国家 863 计划项目 2006AA10 Z345 和 2006AA10 Z302 资助 。 作者简介 :王丽敏 ,助理研究员 ,博士 ,主要从事工业微生物学研究 。通讯作者 : 吕加平 ,研究员 ,主要从事乳品加工及微生物方面的 研究 。 Te l: 010 262815542; E2m a il: lvjp586 @ vip. sina. com ) f reuden reich ii ssp. sherm an iiCGMCC 1. 2227 购自 构酶 ,但因该酶为细胞膜结合酶 ,粗酶在缓冲液中 溶解不好 。随着现代分离技术的发展 ,特别是高 中国 科 学 院 微 生 物 菌 种 保 藏 中 心 ; L actobacillus ( )分辨率电泳 、凝胶色谱和离子交换色谱的普遍应 plan ta rum SY为中国农业科学院农产品加工所 用 ,为 亚 油 酸 异 构 酶 的 分 离 提 供 了 有 效 手 段 。 乳品实验室保存菌种 。 [ 12 ]( Ro sson等 依次 采 用盐 析 、离 子 交 换 层 析 D E2 1. 3 菌体细胞的培养与收集 ) ( A E25 PW 色谱柱 、聚焦色谱 、凝胶过滤层析 1. 6() L. plan ta rum : 取 2 % V /V 菌体细胞接种于) cm ×55 cm Sup e rdex22000 , 得 到 了 较 为 理 想 的 L MR S培养基中活化 2 次 , 37 ?微氧培养 24 h; 当actobacillus reu teri亚油酸异构酶粗酶液 ,并 对该 ()菌液浓度 OD 为 1 时 ,接入 5 L 发酵罐 ,接种 600 酶的理化特性进行了描述 。目前已从溶纤维丁酸 () 量为 2 % V /V ; 在发酵液中加入浓 度 为 6 m g / ()() 弧菌 B. f ib riso lvens嗜酸乳杆菌 L. acidoph ilus mL 葵花 籽 油 , 37 ?微 氧 培 养 12 h, 搅 拌 速 度 为() 111854、植物乳杆菌 L. plan ta rum L 229、保加 利 200 rpm; 然 后 , 用 布 氏 漏 斗 过 滤 发 酵 液 , 4 ?,()亚乳杆菌 L. bu lga ricus等菌株中得到亚油酸异 5 000 ×g 离 心 10m in 收 集 细 胞 , 再 用 含 有 10 [ 13,17 ] 构酶 。mmo l /L N aC l, 10 %甘油 , 2 mmo l /L 二硫苏糖醇缓 一般而言 ,酶的不同来源 ,其酶学性质有很大( ) 冲液 , 0. 1 mo l /L 磷酸钾缓冲液 pH 6. 0 冲洗菌 ( ,在 对 费 氏 丙 酸 杆 菌 谢 氏 亚 种 P. 差异 f reuden2 体细胞 2 遍 ,将菌体细胞保存于 - 18 ?。 ) ( reich ii ssp. sherm an ii和 植 物 乳 杆 菌 L.plan ta2 ( P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii : 取 2 % V /)rum 转化生成 CLA 的研究中发现 ,不同菌株转化 ) V 菌 体 细 胞 接 种 于 MR S 培 养 基 中 活 化 2 次 ,生的成 CLA 异构体在组成 、生成速度等方面均存 () 30 ?微氧培养 48 h; 当菌液浓度 OD为 1 时 , 600 在差异 ,但对造成此差异机制的研究不多 。为了 () 接入 5 L 发酵罐 ,接种量为 2 % V /V ; 在发酵液 更好地了解微生物转化 LA 生成 CLA 的机理 ,本中加入浓度为 12 m g /mL 葵 花籽 油 , 30 ?微 氧培 文研 究 了 P. feuden reich ii ssp. sherm an ii 和 L.养 36 h,搅拌速度为 200 rpm;然后 ,用布氏漏斗过 滤发酵液 , 4 ?, 5 000 ×g离心 10m in收集细胞 ,再 p lan ta rum 亚油酸异构酶的分离纯化方法 ,为进一 用含有 10 mmo l /L N aC l, 10 %甘 油 , 2 mmo l /L 二 步开展亚油酸异构酶酶学性质及作用机理的研究 ( ) 硫苏糖醇缓冲液 , 011 mo l /L Tris缓冲液 pH 7. 5 打下基础 。冲洗菌体细胞 2遍 ,将菌体细胞保存于 - 18 ?。 1. 4 菌体细胞的破碎 1 材料与方法 取 5 g菌体细胞溶于 50 mL 缓冲液中 ,加入1. 1 主要仪器与试剂 () 2 % W /V 溶 菌 酶 轻 轻 搅 拌 混 匀 , 37 ?保 温 1 h (CXG常压生物电脑层析系统 上海沪西分析 后 ,在冰 、N aC l、甲醇溶液中破碎细胞 ,经超高压均 ) (仪器厂 ; U 23010 双道紫外 /可见分光光度计 日 质机破壁 ,工作压力 140 M Pa,重复处理 3 次 。破 ) 本 H itach i公司 ; D YY26C 型 电 泳 仪 、D YCY 31A ( ) 壁细胞悬液离心 10 000 ×g, 1 h, 4 ?后取上清 () 电泳槽 北京六一仪器厂 ; NCJJ 20. 005 /150型超 为粗酶液 ,液氮保存备用 。 () 高压均质破碎机 廊坊通用机械有限公司 ; 750 1. 5 硫酸铵分级沉淀 () W 超声波细胞破碎仪 德国科尔帕莫公司 ; B IO 2[ 14 ] 硫酸铵分级沉淀方法参照苗士达等 方法 。(TECH 25B G自动控制发酵罐 上海保兴生物设备 ) ( 工程 有 限 公 司 ; DM 227 透 析 袋 Sino2Am e rican 1. 6 盐析及浓缩处理 ) B io tech公司 。 经硫酸铵分级沉淀所得酶沉淀用少量缓冲液LA 标准品 、CLA 标准品 、低分子量标准蛋白 质购自 Sigm a 公司 ; 牛血清白蛋白 、D EA E2Sep ha2 [ 12 ] 溶解后进行盐析和浓缩处理 ,浓缩的酶液于液 ro se F. F. Sep hac ryl S2200HR 购 自 Pha rm ac ia 公 氮中保存备用 。司 ; Tris购自 Am re sco公司 ; 无水硫酸钠 、甲醇 、氯 仿等均为国产分析纯 。 1. 7 D EA E2Sepha ro se F. F. 离子交换层析 1. 2 菌种 D EA E2Sep ha ro se F. F. 离子 交换 层 析 参 照 苗 [ 14 ]( ( 士达等 方法 ,并作适当改动 。交换柱 1. 0 cm × 费氏 丙 酸 杆 菌 谢 氏 亚 种 P ropion ibacterium 2期 王丽敏等 :费氏丙酸杆菌谢氏亚种和植物乳杆菌中亚油酸异构酶的分离纯化 51 ) 20 cm 用含有 0 mo l /L N aC l缓冲液平衡 ,以 310 mL /m in的速度洗 脱 3 个 柱 体 积 , 直 至 流 出 液 的 2 结果 pH 与缓冲液相同 。随后进行梯度洗脱 ,洗脱液含 2. 1 硫酸铵分级沉淀有 0 ,0. 7 mo l /L N aC l、10 %甘油 , 2 mmo l /L 二硫 ( 苏糖 醇 缓 冲 液 , 011 mo l /L 磷 酸 钾 缓 冲 液 pH 根据不同蛋白质在不同浓度的中性盐中形成 )( ) (610 L. p lan ta rum 或 011 mo l /L Tris缓冲液 pH 沉淀顺序不同的性质 ,采用硫酸铵分级沉淀的方 ) f reuden reich ii ssp. sherm an ii;流速为 3. 0) ( 7. 5 P. 法对目的蛋白进行初步分离 ,硫酸铵分级沉淀过mL /m in;温度为 0,4 ?;每管收集 3 mL。对洗脱 程中上清液酶活力 及蛋 白 质含 量的 变 化情 况如 液进行 280 nm 跟踪检测 ,收集含酶活部分 。图 1所示 。 1. 8 Sepha cry l S2200 HR凝胶过滤层析 ( )Sep hac ryl S2200HR 柱 1. 6 cm ×50 cm 经含 有 0. 2 mo l /L N aC l 缓 冲 液 平 衡 , 洗 脱 液 为 含 有 012 mo l /L N aC l、10 %甘油 , 2 mmo l /L 二硫苏糖醇 缓冲液 ; P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii洗脱流速 为 0. 3 mL /m in, L. p lan ta rum 洗脱流速为 0. 1 mL / m in;温度为 0 ,4 ?;每管收集 3 mL。对洗脱液进 行 280 nm 跟踪检测 ,收集含酶活部分 。 1. 9 酶活的测定 LA 的 乳 化 方 法 : 300 m g LA 与 0. 36 mL Tween280混和 ,加入 5 mL 去离子水 ,超声波乳化 μ20 m in, 0. 22 m 微孔过滤膜过滤除菌 。 酶活力 [ 14 ]测定参照苗士达等 方法 , 1 个亚油 () 酸异构酶活力单位 U 定义为 : 在上述实验条件 μ下 ,每 m in生成 1 g CLA 所需要的酶量 。 1. 10 蛋白质含量的测定 [ 18 ] 图 1 硫酸铵沉淀上清液酶活及蛋白质含量的变化 蛋白质含量的测定采用 B radfo rd 方法 ,以 F ig. 1 Enzym e ac tivity and p ro te in con ten t in sup e rna tan t 牛血清白蛋白作为标准蛋白质 。 by ammon inm su lp ha te p rec ip ita tion. 1. 11 SD S2PA GE鉴定酶纯度 1A 可 以 看 出 , 在 硫 酸 铵 饱 和 度 在 从图 ( 酶纯度的鉴定采用 SD S2PA GE SD S - 聚丙烯 6214 %时 , P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii亚油酸 )酰胺凝胶电泳 方法进行 ,分离胶浓度 12 % ,浓缩 异构酶粗酶蛋白质沉淀下来 ,饱和度继续增加时 胶浓度 4 % 。 上清液中的蛋白质浓度下降不大而酶活在逐渐减 少 ,至饱和度 80 % ,90 %时酶活变化不明显 , 此 1. 12 分子质量的测定 时上清液的酶活很低而沉淀物中酶活达最高 。而 测定酶蛋白分子质量时根据样品和标准蛋白 ()对菌株 L. plan ta rum 图 1B 而言 ,当硫酸铵饱和 的 SD S2PA GE图谱 ,测定样品和标准蛋白的相对 度为 60 %时 ,其上清液中蛋白质浓度降低 44 % , 随着硫酸铵饱和度的增加 ,蛋白质含量呈现缓慢 迁移率 R的值 ,用标准蛋白的 R值对相应的分子 ff 降低的趋势 ,当饱和度在 80 % ,90 %时酶活变化 量的对数作标准曲线 ,根据纯酶样品的 R值求出 f( ) 趋势不显著 P < 0105 。因此通过预试验选取硫 其分子质量 。 酸铵 饱 和 度 为 80 % 作 为 硫 酸 铵 分 级 沉 淀 的 饱 1. 13 数据分析 和度 。 0 作 图 , 显 著 水 平 为 采用 M ic roca l O rigin 6. 0. 05 ,所有试验重复 3 次 。 2. 2 L. p la n ta rum 亚油酸异构酶的分离纯化2. 2. 2 凝 胶 过 滤 层 析 本 研 究 选 用 Sep hac ryl ( )S2200HR 1. 6 cm ×50 cm 进行凝胶过滤层析 ,其 L. p lan ta rum 亚油酸异构酶的分离纯化采用 凝胶类型是 X - 链葡聚糖 /双丙烯酰胺 ,分离范围 D EA E Sep ha ro se F. F. 分 离出 含有 高 酶活 性的 蛋 ( ) Sep hac ryl S2200HR 进 行 较宽 5 ,250 kD a,具有很高的化学稳定性和机 白质 峰 , 进 一 步 采 用 浓缩 。械强度 ,适用面较广 。 2. 2. 1 离子交换层析根据文献报道 ,不同来源 图 3 是 L. p lan ta rum 亚油酸异构酶粗酶液经 的亚油酸异构酶在不同条件下有其相应的解离状 离子交 换 层 析 得 到 的 高 酶 活 性 的 蛋 白 质 峰 3 (( )态 。本研究选择 D EA E Sep ha ro se fa st flow 1. 0 cm图 2 经 Sep hac ryl S2200HR 进 一 步 分 离 的 层 析 )×20 cm 作为阴离子交换剂 ,缓冲液 pH 6. 0。图谱 ,从图中可以看出 , 通过 D EA E Sep ha ro se F. F. 结合 Sep hac ryl S2200HR 可以得到 L. plan ta rumL. p lan ta rum 亚油酸异构酶经 80 %硫酸铵分 级沉淀后 ,其离子交换层析洗脱图谱如图 2所示 。 亚油酸异构酶的单一蛋白质峰 。收集具有酶活力 的峰 ,经 SD S2PA GE鉴定纯度 ,所得到的电泳纯酶 从图 2A 可以看出 ,在整个线性洗脱阶段 ,当 N aC l 浓度为 0 mo l /L、0. 068 mo l /L、0. 45 mo l /L 和 0. 6 液于液氮中保存 ,留作酶一级结构的研究及酶学 mo l /L 时分别出现 4个蛋白质峰 。收集各蛋白质 性质分析之用 。 峰 ,并检测各管酶活力 ,结果显示峰 3和峰 4为亚 () 油酸异构酶峰 ,其中峰 3酶活最高 见图 2B 。由 此可见 ,在 L. p lan ta rum 菌体中有大量的杂蛋白 可以通过离子交换层析除去 。 图 3 Sep hac ryl S2200分离纯化峰 3的层析图 F ig. 3 Sep hac ryl S2200 ge l ch rom a tograp h ic sep a ra tion of frac tion 3. 2. 3 P. f reu den re ich ii ssp. sh e rm a n ii亚油酸异 构酶的分离纯化 2. 3. 1 凝胶过滤层析 以含有 0. 2 mo l /L N aC l、 10 %甘 油 和 2 mmo l /L 二 硫 苏 糖 醇 的 0. 1 mo l / ( )L Tris缓冲液 pH 7. 5 为洗脱液 ,流速为 0. 3 mL / m in, 每 管 收 集 3 mL , 分 离 纯 化 P. f reuden reich ii () ssp. sherm an ii亚油酸异构酶 见图 4 。在整个洗 脱阶段出现了 2个蛋白质峰 ,两者无重叠 ,洗脱效 果较 好 。经 检 测 P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii 亚油酸异构酶粗酶液中高分子量的成分由于在填 () 料颗粒间隙中流动 ,因此最早被洗脱下来 峰 1 , 图 2 L. plan ta rum 亚油酸异构酶 D EA E Sep ha ro se F. F. 离子交换层析图谱而此部分正是具有酶活性的部分 。同时大量的杂 F ig. 2 D EA E Sep ha ro se F. F. ion exchange ch rom a to2 蛋白质仍然吸附在填料中 ,被洗脱下来的时间也 grap hy of L. plan ta rum LA isom e ra se. 稍有滞后 。因此利用 Sep hac ryl S2200凝胶过滤层 A:洗脱图谱 ; B:蛋白图谱 析可以除 去 P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii 中 的 A: The e lu tion ch rom a tograp hy; B: The p ro tein ch rom a tograp hy. 大量杂蛋白质 。 2期 王丽敏等 :费氏丙酸杆菌谢氏亚种和植物乳杆菌中亚油酸异构酶的分离纯化 53 2. 4 亚油酸异构酶分子质量的测定 亚油酸异构酶粗酶液经过硫酸铵分级沉淀 、 离子交换层析 、透析 、浓缩和凝胶过滤层析得到单 一蛋白峰的酶液 ,通过 SD S2PA GE 电泳可进一步 确定其分子质量 。 根据亚 油 酸 异 构 酶 和 标 准 蛋 白 质 的 SD S2 PA GE 图 , 测定亚油酸异构酶和标准蛋白的相对 迁移率 R值 ,用标准蛋白质的 R值对分子质量的 ff 对数 作 标 准 曲 线 , 如 图 7 所 示 。将 P. f reuden2 ( )reich ii ssp. sherm an ii R= 1. 822 和 L. plan ta rum f 图 4 P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii亚油酸异构酶 ( )R= 1. 778 亚油酸异构酶的相对迁移率带入回 f Sep hac ryl S2200凝胶过滤层析归方程 ,得到 P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii亚油 F ig. 4 Sep hac ryl S2200 ge l ch rom a tograp h ic sep a ra tion of 酸异构酶的 分 子量 约为 56 kD a, L. p lan ta rum 亚 P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii LA isom e ra se. 油酸异构酶的分子量为 50. 65 kD a。 2. 3. 2 离子交换层析 经凝胶过滤层析得到的 ()高酶活性部分 峰 1 经 D EA E Sep ha ro se F. F. 离 子交换层析分离纯化的洗脱图谱见图 5。在整个 线性洗脱阶段 ,出现 2 个蛋白峰 ,当 N aC l浓度为 () 0145 mo l /L 时峰 2具有酶活性 见图 6 。 图 7 标准蛋白质与纯酶在相同 SD S2PA GE电泳条件下 的分子质量与相对迁移率关系 F ig. 7 Mo lecu la r we igh t de te rm ina tion of LA isom e ra se by SD S2PA GE. 3 讨论 图 5 D EA E Sep ha ro se F. F. 分离纯化峰 1的层析图 F ig. 5 D EA E Sep ha ro se F. F. ion exchange ch rom a to2 grap h ic sep a ra tion of frac tion 1. 在探讨离子交换层析和凝胶过滤层析的不同 顺序对目的蛋白的影响预实验中发现 ,单纯地采 用离子交换层析或凝胶过滤层析对 L. plan ta rum 亚油酸异构酶的分离效果均不理想 。从 L. plan2 ta rum 和 P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii的亚油酸 异构酶在离子交换层析和凝胶过滤层析洗脱图谱 存在很大差异也间接说明了两株菌的亚油酸异构 酶内部结构的不同 。因此在实际的分离纯化过程 中 ,需要根据目标微生物的特点采取相应的分离 纯化措施 。 在预实验中 ,凝胶过滤层析不能对 L. p lan ta2 rum 亚油酸异构酶进行分离 ,其蛋白质峰交织在 图 6 D EA E Sep ha ro se F. F. 分离纯化峰 1的洗脱谱图 () 一起 结果未给出 ,因此对于 L. plan ta rum 亚油 F ig. 6 E lu tion p rofile of frac tion 1 on D EA E Sep ha ro se F. F. ch rom a tograp hy. 酸异构酶的分离提取采用超高压均质破壁和硫酸 ,如来源于同属的费氏丙 组成和产量均存在差异 ( ) 铵分级沉淀后 ,使用 D EA E2Sep ha ro se F. F. 离子交 酸杆菌谢氏亚种 P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii换层析 , 透 析 、浓 缩 后 再 采 用 Sep hac ryl S2200HR 转化生成 CLA 的能力要强于费氏丙酸杆菌费氏 [ 31 ] ( ) 凝胶过滤层析 。 亚种 P. f reuden reich ii ssp. f reuden reich ii; P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii发酵液中 c9 , t11 2CLA对于 P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii 中 的 亚 ( ) ( ) 45. 68 % 和 t10 , c12 2CLA 37. 09 % 是 主 要 异 油酸异构酶 ,离子交换层析图谱上蛋白质峰不能 [ 22 ] 构体 ,而通过紫外光谱 、傅立叶变换红外光谱 、 () 分开 结果未给出 ,因此该酶的分离提取采用超 GC2M S联用的方法分析 L. helveticus L7生物转化 [ 1 ] 高压 均 质 破 壁 和 硫 酸 铵 分 级 沉 淀 后 , 先 使 用 生成产物发现其主要为 c9 , t11 和 t9 , t11 2CLA。 Sep hac ryl S2200HR 凝胶过滤层析 ,用进行 D EA E2 本文通过对来源于 P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii Sep ha ro se F. F. 离子交换层析 。和 L. plan ta rum 亚 油 酸 异 构 酶 的 分 离 纯 化 的 研 许多学者开展了对于微生物来源亚油酸异构 究 ,发现两种酶的洗脱特性存在差异 ,表明其具有 酶的分离与纯化的研究 ,凝胶过滤层析与阴离子 不同的酶学特性 ,从而揭示了不同菌株转化生成 交换层析方法的 结合 通 常是 非常 有 效的 提纯 方 CLA 的能力和异构体组成差异的原因 。 [ 14 ] ( 案 。苗 士 达 等 对 植 物 乳 杆 菌 L. plan ta rum )L T2 26 来源的亚油酸异构酶进行纯化的过程中 , 参 考 文 献 同样也采取离子交换层析与凝胶过滤层析相结合 刘晓华 ,曹郁生 , 陈 燕. 共轭亚油酸分析方法的研究进展 [ 1 ] 的纯 化 策 略 , 并 将 酶 纯 化 至 均 一 组 分 。 Su san ( ) [ J ]. 中国油脂 , 2004 , 29 7 : 48 - 50.[ 19 ]等 在 C lostridum sporogenes 来源 的 亚油 酸异 构 Schm id A , Co llom b M , Siebe r R. Con juga ted lino le ic ac id in [ 2 ] m eat and m ea t p roducts: a review [ J ]. M ea t Sc i. , 2006 , 73 酶的提纯过程中 ,采取的是离子交换层析 、等电聚 ( ) 1 : 29 - 41. 焦层析和凝胶过滤层析相结合的纯化方法 。在本 L in H , Boylston T D , L uedecke L O , et a l. . Con jugated lino2 [ 3 ] 研究中采用硫酸铵分级沉淀 、离子交换层析和凝 leic ac id con ten t of chedda r2typ e chee ses a s affec ted by p roce ss2 胶过滤层析的方法对 L. plan ta rum 和 P. f reuden2 ( ) ing[ J ]. J. Food Sc i. , 1999 , 64 5 : 874 - 878. B aum an B D E, Pe rfie ld? J W. CLA 2the m ilkfa t wonde r[ J ]. [ 4 ] reich ii ssp. sherm an ii亚油酸异构酶粗酶液进行分 D airy R e s. , 2002 , 6: 21 - 22. 离纯化 ,均得到了电泳纯的亚油酸异构酶 。 A lon so L , Cue sta E P, Gilliland S E. P roduction of free con ju2 [ 5 ] 实验通过 SD S2PA GE亚油酸异构酶的相对迁ga ted lino le ic ac id by L actobacillus acidoph ilus and L actobacil2 lus casei of hum an in te stina l o rigin [ J ]. J. D a iry Sci. , 2003 , 移率计 算 得到 P. f reuden reich ii ssp. sherm an ii 亚 ( ) 86 6 : 1941 - 1946. 油酸异构 酶 的 分 子 质 量 为 56 kD a, L. plan ta rum Yang L , H uang Y, W ang H Q. et a l. . P roduc tion of con juga2 [ 6 ] 亚油酸异构酶的分子质量为 50. 65 kD a 。该值低 ted lino le ic ac id s th rough KOH 2ca ta lyzed dehyd ra tion of ric ino2 [ 20 ] 于 Ro sson等 报道的 L. reu teri亚油酸异构酶分 leic ac id [ J ]. Chem. Phys. L ip id s, 2002 , 119: 23 - 31. 钮琰星 ,黄凤洪 , 郭 诤 ,等. 葵花籽油制备共轭亚油酸的研 [ 7 ] () 子质量 约 为 68 kD a , 但 P. f reuden reich ii ssp. 究 [ J ]. 食品科技 , 2004 , 4: 96 - 98.sherm an ii亚油酸异构酶的分子质量与 P. acnes亚 J iang J , B jörck L , Fondèn R. P roduc tion of con juga ted lino le ic [ 8 ] ()油酸异构酶分子质量 约为 55 kD a接近 。 Su san ac id by da iry sta rte r cu ltu re s[ J ]. J. App l. M ic rob io l. , 1998 , [ 19 ]( ) 85 1 : 95 - 102. 等 研究表明 C. spo rogenes亚油酸异构酶的分 L in T Y. Con juga ted lino le ic ac id concen tra tion a s affected by [ 14 ] [ 9 ] 子质量约为 45 kD a。苗士达等 报道的来源于 ( ) lactic cu ltu re s and add itives[ J ]. Food Chem. , 2000 , 69 1 : L. plan ta rum 亚 油 酸 异 构 酶 的 分 子 质 量 约 为 50 27 - 31. [ 13 ]Kim Y J , L iu R H. Inc rease of con juga ted lino le ic ac id con ten t kD a。曹健等 报道了来源于紫外诱变的嗜酸乳 [ 10 ] in m ilk by fe rm en ta tion w ith lac tic ac id bac te ria [ J ]. J. Food () 杆菌 L. acidoph ilus1. 1854 的 亚 油 酸 异 构 酶 分 ( ) Sc i. , 2002 , 67 5 : 1731 - 1737. [ 15 ] 子质量为 40. 7 kD a。张浩等 研究表明保加利 Kep le r C R , Tove S B. B iohyd rogena tion of un sa tu rated fa tty [ 11 ] 12 Δac id s. ? p u rification and p rop e rtie s of a lino lea te 2C IS , ()亚乳杆菌 L. bu lga ricus亚油酸异构酶分子质量 13 Δ2TRAN S 2isom e ra se from B u ty rivibrio f ibrisolvens [ J ]. J. 为 33 kD a。虽然不同研究报道的微 生物 来源 亚 B io l. Chem. , 1967 , 242: 5686 - 5692. 油酸异构酶分子量存在很大差异 ,但总体来说 ,微 [ 12 ] Ro sson R A , Grund A D. L ino lea te isom e ra se [ P ]. W o rld 生物来源亚油酸异构酶属于低分子质量蛋白 。 Pa ten t 100846 , 2001. 研究表明 ,不同菌株转化生成 CLA 的异构体 [ 13 ] 曹 健 ,魏 明 ,曾 实 , 等. 一株嗜酸乳杆菌突变株亚油酸异 2期 王丽敏等 :费氏丙酸杆菌谢氏亚种和植物乳杆菌中亚油酸异构酶的分离纯化 55 ( ) 构酶的纯化及性质 [ J ]. 食品与发酵工业 , 2004 , 30 2 : 48 [ 18 ] B radfo rd M. A rap id and sen sitive m e thod fo r the quan tita tion - 52. of m ic rogram quan titie s of p ro te in u tilizing the p rinc ip le of ( ) 2dye b ingd ing[ J ]. A na l. B iochem. , 1967 , 72 7 : 248 p ro tein[ 14 ] 苗士达 ,张中义 ,刘 萍 ,等. 植物乳杆菌亚油酸异构酶的分 ( ) - 254. 离纯化及其性质研究 [ J ]. 食品与发酵工业 , 2005 , 31 3 : [ 19 ] Su san S P, M ing D D , A lan D G, et a l. . Pu rifica tion and 12 - 15. cha rac te riza tion of a m em b rane2bound lino leic acid isom e rase [ 15 ] 张 浩 ,曹 健 , 张国艳. 保加利亚乳杆菌中的亚油酸异构酶 ( ) from C lostridum sporogenes [ J ]. Enzym e M ic rob. Techno l. , 的研究 [ J ]. 食品研究与开发 , 2006 , 27 7 : 102 - 107. ( ) [ 16 ] D eng M D , Grund A D , Schne ider K J , et a l. . L ino le ic ac id 2007 , 40 4 : 831 - 839. isom era se from P ropion ibacterium acnes: p u rifica tion, cha rac2 [ 20 ] Ro sson R A , D eng M D , Grund A D. Po lynuc leo tide encod ing te riza tion, mo lecu la r c lon ing, and he tero logou s exp re ssion [ J ]. a P ropion iba C rerium lino lea te isom e ra se and u se s thereof[ P ]. ( ) App l. B iochem. B io techno l. , 2007 , 143 3 : 199 - 211. U S Pa ten t 6706501 , 2004. [ 17 ] Fukuda S, Suzuk i Y, M u ra i M , et a l. . Iso la tion of a nove l [ 21 ] W ang L M , L v J P, Chu Z Q , et a l. . P roduc tion of con juga ted strain of B u ty rivibrio f ibrisolvens tha t isom e rizes lino leic ac id to lino le ic ac id by P ropion ibacterium f reuden reich ii [ J ]. Food ( ) con juga ted lino le ic ac id w ithou t hyd rogena tion, and its u tiliza2 Chem. , 2007 , 103 2 : 313 - 318. tion a s a p rob io tic fo r an im a ls [ J ]. J. App l. M ic rob io l. , [ 22 ] 王丽敏. 共轭亚油酸高转化量菌株筛选及其酶学性质研究 ( ) 2006 , 100 4 : 787 - 794. [ J ]. 北京 :中国农业科学院 ,博士学位论文 , 2007: 32.【863课介绍 】 课题名称 :亚油酸异构酶高产菌种选育及酶的制备技术研究 课题编号 : 2006AA10 Z302 课题内容 、目标 :,以期为 化 、酶学特性及其制备 、酶促工艺研究 ( ) 共轭亚油酸 con juga ted lino le ic ac id, CLA 酶促反应生产 CLA 探索一条捷径 。 是近 20 年来人类发现的最重要的功能性脂肪 课题进展 : 酸 ,大量的动物实验表明 CLA 能够有效抑制癌 分离筛选了 2 株优良菌株 ,建立了共轭亚 症发生 、抗动脉硬化 ,减肥 ,改善 ?型糖尿病 、免 油酸的简易测定方法 。研究了不同条件下的产 疫调节等作用 。目前 CLA 商业化生产方法主 酶活性及产酶适宜条件 ,分离纯化了丙酸菌和 要为化学合成法 ,但研究表明碱异构化法的产 乳酸菌种的亚油酸异构酶 ,并通过液谱与电喷 ( ) 物包 括 20 % , 35 % c9 , t11 2CLA、20 % , 35 %雾电离质谱技术 ES I2M S联用测定了酶的一 t10 , c12 2CLA 和其 他 异 构 体 , 同 时 还 会 残 留 环 级序列 ,分析表明两者具有一定的同源性 。研 化等副产物 ,存在一定不安全因素 ,而微生物酶 究了有氧 、微氧 、超临界流体等几种反应体系的 合成法反应条件温和 ,异构体组成较单一 ,与天酶转化工艺 ,其中 ,超临界流体的生化转化率最 然食物中 CLA 组成相似 。因此 ,筛选高产菌株 高 。另外 ,对筛选的一株优良菌株进行了离子 或构建高效表达工程菌生产工业用酶并通过酶 注入诱变处理 ,进一步筛选高产菌株 ,优化菌株 转化 方 式 制 备 高 活 性 共 轭 亚 油 酸 具 有 重 要的产酶条件 。已培养博士 2名 、硕士 1 名 ,申报 专利 4 项 ,发表论文 3篇 ,投稿论文 3篇 。意义 。 本课题通过高产酶菌株选育 ,产酶条件优