神经干细胞分化影响其对肝细胞因子趋化性迁移

神经干细胞分化影响其对肝细胞因子趋化性迁移 硕士学位论文题目 神经干细 胞分化 影 响其对肝 细胞因 子 的趋化性 迁移 魏友华研究生姓名 张焕相指 导 教 师 姓 名 细胞生物 学专 业 名 称 干细胞与 组织工 程研 究 方 向 2011 年4 月论 文 提 交 日 期 神经干细胞分化影响其对肝细胞因子的趋化性迁移中文摘要 中文摘要 神经干细胞 (neural stem cells, NSCs ) 高效迁移的发生 在神经系统发育和病理 条 件 下 神 经 系 统 损 伤 修 复 中 起 着 关 键 作 用 。 越 来 越 多 的 研 究 表 明 , 无 论 是 内 源 的 还是外源移植的 NSCs 都能够通过 趋化性迁移到 达脑损伤区域, 利用 NSCs 分化 特 性进 行 特 定 损 伤 部 位 细胞 的 定 向 分 化 而 取 代 损 伤 的 细 胞 参 与 到 损 伤 区 域 功 能 的 发 挥或分泌 不同营养因子来改善 损伤区域的微环境 来促进损伤区域的恢复。NSCs 的 这种趋化性迁移能力 为受损伤神经系统的 修复带来了希望, 但是 NSCs 在体内的趋 化 性 迁 移 行 为 是 个 复 杂 的 过 程 , 受 到 迁 移 过 程 中 微 环 境 的 变 化 以 及 细 胞 自 身 分 化 状态 等 因 素 的 影响 。 先 前 的 研 究 主 要 集 中 于 鉴 定 脑 损 伤 区 域 分 泌 的 不 同 的 炎 症 趋 化因子或生长因子在诱导 NSCs 迁移过程中的作用, 但是 NSCs 在迁移过程中分化 状态 的改变 对 其 趋 化 性 迁 移 行 为 的 影 响 还 鲜 有 报 道 。 本 实 验 主 要 从 新 生 大 鼠 侧 脑 室下区 (the subventricular zone, SVZ ) 来源的 原 代神经干细胞和神经干细胞系 C17.2 两个方面 对 NSCs 的分化状态与其趋化性迁移行为的关系这一问题进行了研究。 本研究首先从新生远交群 (Sprague Dawley, SD ) 大鼠 SVZ 区域中分 离并纯化 出 NSCs ,发现纯化的 NSCs 呈 nestin 阳性, 并且表现出很强的增殖能力 。同时, 用含 1% 胎牛血清fatal calf serum, FCS 的 H-DMEM 对 SVZ 来源的 NSCs 进行诱 导分化(48 h ) ,通过细胞表面特异性抗原标记(GFAP 和 β-III tubulin )对分化后 + 的细胞进行鉴定 , 发现 SVZ 区域来源的 NSCs 能分化成神经元 (β-III tubulin ) 和 + 星形胶质细胞 (GFAP ) ,为后期的实验提供了稳定的细胞来源。 肝细胞因子 (hepatocyte growth factor, HGF )是脑损伤区域 (胶质瘤 等) 分泌 的重要因子之一, 并且在体内外实验中均被证明能够诱导 NSCs 的趋化性迁移。 为 了研究 NSCs 的分化状态与趋化性迁移 的关系,我们首先利用延时动态视频 (time-lapse video )研 究了 SVZ 来源的 NSCs 在诱导分化 0-48 h 的不同阶段下对 不同浓度 HGF 的刺激 所做出应答时其迁移行为发生了哪些变化 。 实验结果发现,与对照组(没有 HGF 存在的 情况下,NSCs 分化 0-48 h 的不 同阶段下的趋化性迁移行为) 相比,5 ng/ml 的 HGF 显著提高了 分 化最早期 (4 h ) 的 NSCs 的迁移速度, 未能改变 NSCs 分化 4-48 h 内其它分化阶段细胞 的迁移速度。 I 中文摘要神经 干细胞分化影响其对肝细胞因子的趋化性迁移 而 25 ng/ml 的 HGF 显 著增加了 NSCs 在未分化和分化 4 h, 12 h, 20 h 和 44 h 的细胞 的迁移速度 但未能对分化 28 h 和分化 36 h 的 NSCs 的迁移速度产生影响,并且在 NSCs 分化 4 h, 20 h 和 44 h 内的迁移速度显著高于 5 ng/ml HGF 诱导 的迁移速度。 与此同时, 我们发现, 与对照组相比,5 ng/ml HGF 未能对分化 0-48 h 内的 NSCs 的迁移效率 (forward migration index, FMI )产 生显著性差异,而 25 ng/ml HGF 显 著性的提高了 NSCs 分化 12 h, 20 h, 28 h 和 36 h 内的 FMI , 并且在分 化 12 h,20 h 和 36 h 内显著高于 5 ng/ml HGF 实验组。 这些 现象表明,NSCs 对不 同浓度的 HGF 刺激做出的不同应答反应 与细胞的分化状态有着密切的关系。 为了研究 NSCs 的分化状态与 其迁移行为 的相互关系, 我们选择了神经干细胞 系 C17.2 来进一步研究细胞的分化状态对其 迁移行为产生的影响以 及可能的分子 机制 ,为后期的体内移植研究实验进行准备。首先,我们利用 Boyden chamber 及 Dunn chamber 研究了 神经干细胞系 C17.2 在 不同分化阶段的的群体迁移和个体迁 移行为的变化。Boyden chamber 结果发现, 下 室 加入 HGF 后, 不同 分 化状态下的 C17.2 细胞迁移 至膜下的数目和能够诱导 细胞迁移数目最多 的 HGF 浓度都是不同 的。分化 12 h 和 1 d 的 C17.2 细胞与未分化和分化 3 d 的 细胞相比表现出对 HGF 更强的趋化性迁移, 随 着分化时间的延长, 细 胞的趋化性迁移能力 下降, 到分化 3 d 时细胞的趋化性迁移能力已显著低于未分化状态 。Dunn chamber 结 果表明, 细胞 在特定的分化状态表现出更强的定向迁移能力。 仅在外槽中加入 HGF 时, 与对照 组和其它分化状态的细胞相比,C17.2 细胞在分化 12 h 和 1 d 时的 FMI 表现出显 著性的提高 , 而 迁 移 速 度 则 随 着 分 化 的 开 始 表 现 出 显 著 性 的 下 降 , 分 化 状 态 之 间 没有显著性的差异 。 先前的研究结果表明 PI3K/Akt phosphatidylinositol 3-kinase/Akt 和 ERK1/2 extracellular signal-regulated kinase-1/2 , SAPK/JNK stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase , p38MAPK 能 够参与调节细胞的迁移行为。 因此, 我们检测了不同分化状态下 C17.2 细胞内 Akt 和 MAPKs mitogen-activated protein kinases 蛋白的表达变 化 , 发现在不同分化状态下,Akt 和 MAPKs 蛋白的磷酸化 水 平 和 变 化 趋 势 都 是 不 同 的 并 且 与 细 胞 的 分 化 状 态 有 着 紧 密 的 联 系 。 最 后 , 我 们 通 过抑制不同的信号通路研究发现:当抑制 ERK1/2 信号通路后,HGF 刺激诱导的 分化 0 h, 12 h 和 1d 的 C17.2 细胞的迁移数目表现出显著性下降,但是对分化 3 d II 神经干细胞分化影响其对肝细胞因子的趋化性迁移中文摘要 的细胞迁移数目没有显著性影响。 而当干扰掉 PI3K/Akt, p38MAPK 或者 SAPK/JNK 信号通路时则只能分别抑制分化 12 h, 0 h 和 1 d 的特定分化状态下的 C17.2 细胞 的 迁移数目 , 并 且这 种下降 的 程 度与 细 胞的 分 化状 态 有 着紧 密 的关 联。 同时,Dunn chamber 结果发现 , 当 PI3K/Akt 或者 MAPKs 信号通路被抑制后所引起的细胞在特 定 分 化 状 态 下 细 胞 迁 移 数 目 的 显 著 性 下 降 主 要 是 由 于 细 胞 在 特 定 分 化 状 态 下 的 迁 移速度和(或者)FMI 的显著性下降,并且这种迁移速度和 FMI 的 显著性下 降的 程度与细胞的分化状态之间也存在着 紧密的关联。 以上的结果表明, NSCs 的分化状态对 HGF 诱 导的 NSCs 的趋化性迁移行为 产 生重要的影响, 在不同分化状态下的 NSCs 具有不同的趋化性迁移能力, 这种迁移 能力的不同受到 PI3K/Akt 和 MAPKs 的调节 并依赖于细胞的分化状态。以上结论 说明 NSCs 的趋化性迁移能力与其分化状态之间存在着紧密的联系, 在细胞分化的 过程中可能存在一个特殊的时期, 处于这一时期的细胞对诱导因子 HGF 表现出更 强的定向迁移能力。NSCs 分化状态影响其对诱导因子的趋化性迁移是一个普遍的 现象, 实验室关于血管内皮生长因子vascular endothelial growth factor, VEGF ,干 细胞因子(stem cell factor, SCF ) ,血小板衍生因子(platelet derived growth factor, PDGF )的研究同样证 明了这种现象的存在, 虽然进一步的分子机制仍待于探索, 但是我们 的研究 结果为 临床移植 NSCs 来治疗脑损伤 和 中枢 神经系 统疾病提 供了 更加丰富的 理论基础 。 关键词:神经干细胞; 细胞分化; 细胞迁移;肝细胞因子作 者:魏友华 指导老师: 张焕相 教授 III AbstractChemotactic Responses of Neural Stem Cells to HGF Correlate Closely with Their Differentiation Status Chemotactic Responses of Neural Stem Cells to HGF Correlate Closely with Their Differentiation Status Abstract A precise migration of neural stem cells NSCs is a prerequisite during development for the formation of the nervous system and plays a pivotal role in avariety of pathological events. Increasing numbers of studies have demonstrated that NSCs, either endogenous or transplanted NSCs, would be guided to migrate over considerable distance to sites of injury in the brain, where they contribute to recorve the impaired brain zone by differentiating into the special cell to replace the injury ones in the impaired zone or secreting tropic factors to improve the microenvironment. The discovery of the ability of chemotaxis of NSCs under physiological and pathological conditions has raised hopes for the brain repair after injury, but the chemotaxis of NSCs in vivo is a complex procress, both the changing microenvironment and the differentiation status of NSCs or other factors during migration will affect the migratory ability. While much effort has focused on the delineation of factors that involved in the migration of NSCs, the relationship between the chemotactic response and different status of these cells, however, remains elusive. In the present study, we used SVZ-derived NSCs and neural stem cell line C17.2 cells to analyze the chemotactic response of NSCs to concentration gradients of HGF in relation to their differentiation statesWe dissected and purified NSCs from the subventricular zone SVZ of newborn Sprague Dawley rats. The SVZ-derived NSCs were cultured in the presence of bFGF-2 in defined medium as described previously, then changed into induction medium H-DMEM containing 1% FCS when cells reached approximately 50% confluence and evaluated for 48 h throught the course of differentiation. In the presence of bFGF-2, by day 3, the cells had an immature, round or bipolar morphology and the vast majority of cells were stained nestin-positive cells, indicating that they are undifferentiated neuralIV Chemotactic Responses of Neural Stem Cells to HGF Correlate Closely with Their Differentiation StatusAbstract progenitors. After 48 h in inducation medium, the GFAP-postive astroyctes or β-III-tubulin-positive neurons was observed, supplying sufficient cells to invegst the relationship between the differentiation status of NSCs and chemotaxis of these cellsMany factors, including hepatocyte growth factor HGF, which is expressed in SVZ, rostral migratory stream, olfactory bulb and the dentate gyrus of hippocampus in brain, are involved in the navigation of NSCs to their final destination. HGF, via downstream signaling molecules, such as extracellular signal-regulated kinase-1/2 ERK1/2, stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase SAPK/JNK, p38MAPK, and phosphatidylinositol 3-kinase/Akt PI3K/Akt, is involved in cell survival, differentiation and migration. In response to external stimuli, activation of these mitogen-activated protein kinases MAPKs and PI3K/Akt cascade, in turn, activates intracellular signaling molecules and/or induces crucial alterations in several cytoskeleton-related proteins that are essential for cell migration. So we used HGF as a chemottractant to analyze the effect of differentiation status of NSCs on HGF-induced chemotaxisThe migratory capability of SVZ-derived NSCs at different differentiation states was analyzed by time-lapse video analysis. Our results indicated that treatment with HGF at 5 ng/ml did not influence the migration speed of NSCs of 4-48 h differentiation, but significantly increased it in the early differentiation stage 0-4 h. Higher concentration 25 ng/ml led to a significant increase in migration speed in cells of 0 h, 4 h, 12 h, 20 h and 44 h differentiation. Importantly, cells of 4 h, 20 h and 44 h differentiation displayed a pronounced increase in migration speed in the presence of 25 ng/ml HGF compared with 5 ng/ml HGF. Meanwhile, the forward migration index FMI of NSCs of 12 h, 20 h, 28 h and 36 h differentiation was significantly increased by 25 ng/ml HGF, but no signifant difference was observed in the presence of 5 ng/ml HGFThese data suggest a close relationship between the HGF-induced chemotaxis and the differentiation status of NSCsIn oreder to further analyszed the chemotactic responses of NSCs to concentration gradients of HGF in relation to their differentiation states, using the well-characterized murine neural stem cell line C17.2, which was derived from the external germinal layer of the postnatal cerebellum, to analyze the molecular mechanism that parcipate in regulate the different chemotaxis upon differentiation. Firstly, the number of V AbstractChemotactic Responses of Neural Stem Cells to HGF Correlate Closely with Their Differentiation Status chemotaxing cells as well as the optimum concentrations of HGF that induced the peak transfilter migration varies greatly in a microchemotaxis Boyden chamber, cells of 12-h and 1-d differentiation displayed a stronger chemotaxis toward HGF than cells of 0-h and 3-d differentiation. Secondly, time-lapse video analysis using the direct viewing Dunn chamber shows that cells at certain differentiation states cells of 12-h and 1-d differentiation migrate more efficiently towards HGF. However, the migration speed of cells showed a significant decrease upon differentiation, while no difference was detected in migration speed among differentiating cells. Thirdly, the phosphorylation status of Akt, ERK1/2, SAPK/JNK and p38MAPK is closely related to the differentiation levels of cells subject to HGF stimulation, being sustained or increased transiently at different times, and finally, inhibition of ERK1/2 significantly attenuate HGF-stimulated transfilter migration of cells of 0-h, 12-h and 1-d differentiation, but not NSCs of 3-d differentiation. Meanwhile, interference of PI3K/Akt, p38MAPK or SAPK/JNK only significantly attenuated HGF-induced migration in cells of 12-h, 0-h and 1-d differentiation respectively. Moreover, blocking of PI3K/Akt or MAPKs signaling led to a deficit chemotaxis of NSCs with decreased migration efficiency and/or migration speed of cells at certain differentiation stages, the extent of which depends on the cell differentiation status. Collectively, these results demonstrate that differentiation of NSCs influences their chemotactic responses to HGF: NSCs in varying differentiation states have different migratory capacities, thereby shedding light on optimization of the therapeutic potential of NSCs to be employed for neural regeneration after injuryKey words: neural stem cells NSCs, cell differentiation, cell migration, hepatocyte growth factor HGFWrittenby: Youhua Wei Supervised by: Huanxiang Zhang VI 目 录 序 言 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? 1 第一部分 HGF 对不 同分化状态下原代 NSCs 趋化迁移能力的影 响 ????????????????? 8 1. 实验材 料 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ???????????????????? 9 1.1 实验动 物 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ????????????? 9 1.2 主要试 剂 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ????????????? 9 1.3 主要实验仪 器 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ????? 10 2实验方 法 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ???????????????? 11 2.1 新生大鼠 SVZ 区域 NSCs 的分离培养与鉴 定 ????????????????????????????? 11 2.2. 不同浓度 HGF 对 不同分化状态下 NSCs 迁移行为的影 响 ????????????? 12 2.3 NSCs 迁移行为分 析 ???????????????????????????????? ?????????????????????????????? 13 2.3 数据处理与统计分 析 ???????????????????????????????? ???????????????????????????? 14 3. 结 果 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ???????????????????????? 14 3.1 NSCs 体外单层贴壁培养和鉴 定 ???????????????????????????????? ??????????????? 14 3.2 HGF 对不同分化状 态下 NSCs 迁移速度的影 响 ?????????????????????????? 16 3.3 HGF 对不同分化状 态下 NSCs 迁移效率的影 响 ??????????????????????????? 16 参考文 献 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ?????????????????????? 20 第二部分 HGF 对不同 分化状态下 C17.2 细胞迁移能力的影 响 ?????????????????????? 24 1. 实验材 料 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ?????????????????? 25 1.1 主要试剂及配置方 法 ???????????????????????????????? ???????????????????????????? 25 1.2 主要实验仪 器 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ????? 26 2. 实验方 法 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ?????????????????? 26 2.1 C17.2 细胞的培养和诱导分 化 ???????????????????????????????? ????????????????? 26 2.2 C17.2 细胞迁移实 验 ???????????????????????????????? ?????????????????????????????? 26 2.3 蛋白免疫印记(western blot )分 析 ???????????????????????????????? ?????????? 28 2.4 统计学分 析 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ???????? 29 3. 结 果 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ???????????????????????? 29 3.1 不同分化状态下 C17.2 细胞的培养和鉴 定 ???????????????????????????????? ? 29 3.2 不同分化状态下 C17.2 细胞对不同浓度 HGF 的群体定向迁移能力 ? 30 3.3 分化 12 h 和分化 1 d 的 NSCs 与其它分化状态的细胞相比具有更强 的 群体定向迁移能 力 ???????????????????????????????? ?????????????????????????????? 32 3.4 分化 12 h 和分化 1 d 的 NSCs 与其它分化状态的细胞相比具有更有 效 的迁移效 率 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ??????? 33 3.5 不同分化状态下 NSCs 受到 HGF 刺激前后 Met 蛋白的表达变化 ????? 35 3.6 不同分化状态下的 NSCs 在受到 HGF 刺激后 Akt 和 MAPKs 蛋白 磷 酸 化水平的变 化 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ???? 36 3.7 不同分化状态下 NSCs 对 HGF 的趋化性迁移受到 PI3K/Akt 和 MAPKs 信号通路的调 节 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ? 38 4. 讨 论 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ???????????????????????? 41 参考文 献 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ?????????????????????? 45 结 论 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ?????????????????????????????? 50 综述:成体神经干细胞在哺乳动物中的研究进 展 ???????????????????????????????? ??????? 51 攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论 文 ???????????????????????????????? ??????? 64 本研究所获基金资 助 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ???????????? 65 缩略词表 Abbreviation ???????????????????????????????? ??????????????????????? ????????? ????????? 66 致 谢 ???????????????????????????????? ???????????????????????????????? ?????????????????????????????? 68神经干细胞分化影响其对肝细胞因子的趋化性迁移 序 言 序 言 神经干细胞neural stem cells, NSCs 在退行性神经系统疾病 的治疗和神经系统 损 伤 后 修 复 过 程 中 的 重要 作 用 是 当 今 神 经 生 物 医 学 研究 的 重 要 内 容 之 一 ,然而 NSCs 的发现及其 与神经系统发育之间的关系 的阐明却经历 了很长一段时间。 最早 期 的 研 究 者 通 过 解 剖 学 和 组 织 学 的 方 法 证 明 , 哺 乳 动 物 大脑 结构 在 出 生 后 维持 不 [1-2] 变并且不 会再有新 的神 经元的产 生 ,这种观点使得 人们对神 经系 统疾病和 损伤 的治疗一直难以找到适合的 方法。 后来,BrdU 等高科技手段在动物体内的 运用使 得研究者们 发现 , 出 生 后 的 哺乳动物 在 大 脑 内 始 终 存 在 一 种 干 细 胞 样 细胞 [3-6] stem-like cells , 这 种细胞显著的特征是 增殖非常缓慢, 并且 大多数由这种细胞 [7-8] 新分裂产 生的细胞 能够 分化成为 有功能 的 神经 元 。在这之后研究 者又在 胚 胎和 [9-15] 成体神经系统的多个部位 均发现了这种具备干细胞 特征的细胞 , 说明此类细胞 在 哺乳动物 神 经 系 统 里 存 在 的 稳 定 性 与 普 遍 性 , 但 研 究 发 现 这 种 类 型 的 细 胞 主要 存 在 于 侧 脑 室 壁 的 脑 室 下 区the subventricular zone 和 海 马 齿 状 回 的 亚 颗 粒 区the[12,16-21] [22-23] subgranular zone, SGZ 。随着体外培养 条件的成熟 ,人们 对 NSCs 的认 [12] 识有了不断的丰富与发展。2000 年,Gage 对 NSCs 的特性进行了比较完整 的概 括 , 主 要 表 现 在 可 生 成 神 经 组 织 或 来 源 于 神 经 系 统 ; 具 有 自 我 更 新 能 力 ; 可 通 过 对称或不对称细胞分裂 产生新的细胞。 NSCs 的发现 彻底改变了人们对 中枢神经系统 在出生后结构上维持不变, 功能 上损伤后无法修复的错误观念, 为神经系统 疾病的治疗和损伤 的修复带来了希望 。 人们相信 NSCs 存在部位的特殊小生境能够使得体内的 NSCs 分化成为有功能的神 经 元 来 治 疗 和 修 复 在 神 经 系 统 疾 病 和 损 伤 中 所 引 起 的 神 经 元 和 胶 质 细 胞 之 间 的 不 [16-17] 可逆丢失和退化 。 研究表明,NSCs 不仅具有很强的增殖 与分化能力, 而且具 [24] 有潜在的 趋化性 迁移能力 ,这种 趋化性 迁 移能 力 在 神 经 系 统 发 育 和 神 经 损 伤修 [25-28] 复过程中起着更为关键的作用 。 很多 退行 性神经系统疾病 都是由于 NSCs 在迁 [29] 移过程中的缺陷所引起的 。 在 正 常 生 理 条 件下 , 神经系统的正常发育和功能的 发挥依赖 于 存在 特殊部 位的 NSCs 经过长 距 离定向迁 移至 大脑的 特 定部位分 化成 [18,30-31] 特定部位所需要的 神经细胞来完成的 。 1序 言 神经 干细胞分化影响其对肝细胞因子的趋化性迁移 更 重 要 的 是 , 人 们 发 现 在 脑 损 伤 和 恶 性 胶 质 瘤 等 病 理 条 件 下 , 内 源 的 或 外源 [18,32-35] 移植的 NSCs 可以 定向迁移至神经胶质瘤和 脑损伤区域 。 由于 NSCs 能够对 损伤区域发生定向迁移, 使得作为稳定 细胞群体的 NSCs 可以成为外源基因的良好 [36] 载体 来进行靶向追踪神经胶质瘤 或通 过 定 向迁 移 至 脑 损 伤 区 域 分 泌 多 种 营 养因 子来改变脑损伤区域的微环境来促进损伤区域的修复 , 使得人们越来越关注 NSCs [37-38] 的这种趋化性迁移的内在机制 。 然而由于体内 迁移环境的复杂性 ,NSCs 在体 内 对 胶 质 瘤 等 神 经 系 统 疾 病 和 损 伤 的 趋 化 性 迁 移 机 制 还 不 是 很 清 楚 。 越来越多的 研究 表明胶质瘤等神经 损伤区域释放 的 多 种 炎 症 趋 化 因 子 和 生 长 因 子 会对 NSCs [39-42] 的趋化性迁移起着关键的作用 。HGF 作为从胶质瘤等脑损伤区域分离鉴定出 的众多生长因子中的一员,体内外试验 均表明 HGF 对 NSCs 的迁移具有很强的 定 [43-49] 向 诱 导 作 用 。 然 而 , 体 内 移 植 实 验 进一步 发现, 移 植 在 脑 损 伤 区 域 的 同侧或 对侧的 NSCs 并未全部迁移至损伤区域, 很大 一部分移植的 NSCs 还是停留在注 射 点 原 地 或 是 迁 移 的 中 途 , 只 有 很 少 部 分 移 植 的 细 胞 迁 移 至 脑 损 伤 区 域 并且迁移至 [50-52] 损 伤 区 域 的 细 胞 只 有 很 少 一 部 分 发 生 分 化 取 代 损 伤 的 细 胞 。 利用组织免疫染 色的方法对移植的 NSCs 在迁移过程中停留在各个部位的细胞进行染色鉴定发现, 表达 Sox-2, SSEA-1, EAAT1/EAAT2 的细胞均 停留在注射位点附近, 而迁移至脑损 [53] 伤区域周围的表达 GFAP 。所以,NSCs 在 迁移过程中的分化状态可能对 NSCs 趋化性迁移的能力有着重要的影响。 然而, 关 于 NSCs 的分化状态对 NSCs 趋化性 迁移行为影响的研究却鲜有报道。 为此,本课题从 SVZ 区来源的原代 NSCs 和 神经干细胞系 C17.2 两个方面, 通过 利用不同来源的 NSCs 的体外 分化模型 诱 导分化, 来研究 NSCs 的分化状态如 何对 HGF 刺激产生的 趋化性迁移产生影响并初步探讨了 PI3K 和 MAPKs 信号通路 在这个过 程中所 起的作 用,以探 究 NSCs 在 分化的过 程中是 否存在 一个关键 的时 期。 在这一关键时期,NSCs 的迁移能力表现出显著性的提高, 从而为进一步揭开 NSCs 分化迁移机制奠定基础,为以后利用 NSCs 进行临床 治疗提供稳定高效的细 胞来源和 重要的理论基础。 参考文献 1. Colucci-D'Amato, L., V. Bonavita, and U. di Porzio, The end of the central 2神经干细胞分化影响其对肝细胞因子的趋化性迁移 序 言 dogma of neurobiology: stem cells and neurogenesis in adult CNS. Neurol Sci, 2006. 274: p. 266-702. Gross, C.G., Neurogenesis in the adult brain: death of a dogma. Nat Rev Neurosci, 2000. 11: p. 67-733. Reynolds, B.A., W. Tetzlaff, and S. Weiss, A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J Neurosci, 1992. 1211: p. 4565-744. Temple, S., Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature, 1989. 3406233: p. 471-35. Cattaneo, E. and R. McKay, Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature, 1990. 3476295: p. 762-56. Kilpatrick, T.J. and P.F. Bartlett, Cloning and growth o