5亿活孢子／克木霉菌可湿性粉剂的研制

5亿活孢子／克木霉菌可湿性粉剂的研制 5亿活孢子,克木霉菌可湿性粉剂的研制 2008年21卷3期 V0L21Nn3 西南农业 SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences675 文章编号:1001—4829(2008)03—0675—05 5亿活孢子/克木霉菌可湿性粉剂的研制 ,邓新平h,马超,胡国胜 张敏,彭化贤 (1.西南大学植物保护学院,重庆400716;2.四川省农业科学院植物保护研究所,四 川成都610066) 摘要:通过木霉菌(Trichodermaspp.)可湿性粉荆配方研究,确定配方为:润湿剂 B54%,分散荆C46%,保护剂UV一10.3%,稳 定剂E0.2%,载体Al补足100%.质量检测结果表明产品中孢子萌发率75%以上, 悬浮率75%以上,润湿时间<1min,产品 各项指标符合可湿性粉剂的要求.田间药效试验结果表明,5亿活孢子/克木霉菌可 湿性粉剂800—1000倍液防治田间番茄灰霉 病(BotrytiscinereaPem)的防治效果与50%腐霉利WP1200倍液和20%百-霉威 WP1300倍液防效相当. 关键词:木霉菌;分生孢子;生物相容性;可湿性粉剂 中图分类号:s482.28文献标识码:A ResearchonthewettablepowderofTrichodermaspp.with eachgram500millionlivingconidia ZHANGMin,PENGHua—xian,DENGXin—ping',MAChao,HUGuo.sheng (1.CollegeofPlantProtection,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China;2.TheInsti tuteofPlantProtection,SiehuanAcademyofAg- rieulturalSciences,SiehuanChertIgdu610066,China) Abstract:ThroushresearchingontheformulationofthewettablepowderofTrichoderma.the optimalformulationwereconfirmedasfollows. ThecontentofwettingagentB5,dispersingagentC4,protectantagentUV一1,andstabilizerEweTe4%,6%,0.3%and0.2%respective— ly.Synchronously,addingpackingA1upto100%wasneed.Thequalitydetectionshowedtha tbothgerminationrateofconidiaandsuspen- sionrateoftheproductionwereover75%,andthedispersiontimeWa$lessthan1minwhichwe reuptotheformulationstandard.Theeffect ofwettablepowderofTHchodermatocontroltomatoBotrytiscir~reawassimilartothecontr olpesticideswhenappliedTr/chodermaWP800to 1O0otimesinfield. Keywords:Tr/choderma;eonidia;bioeompatibility;wettablepowder 木霉菌(Trichodespp.)属于半知菌亚门丝 孢纲丝孢目粘孢菌类,是一类常见于土壤中,植物残 体,植物根围,植物叶片及种子,球茎表面及动物粪 便上,具有对其它真菌有拮抗作用的丝状真菌…. 在发展可持续性农业呼声越来越高的今天,它作为 一 类资源丰富的拮抗微生物,在植物病害生防中具 有越来越重要的作用.目前,应用最多的是绿色木 霉和哈茨木霉,主要用于防治蔬菜灰霉病,小麦纹枯 病,红豆根腐病和棉花立枯病.木霉在其生长周期 内可以产生3种繁殖体,即菌丝体,厚垣孢子和分生 收稿日期:2007—12—28 基金项目:农业部科教司948项目"四川木霉菌种改良及微生 物农药试验示范"[2006?G54(A)] 作者简介:张敏(1979),女,西南大学硕士研究生,从事农药剂 型加工与应用技术研究,为通讯作者. 孢子l2].目前生产上常用的木霉菌剂多为活分生 孢子制剂.从木霉菌分生孢子的性质来看,可以加 工成固体制剂,只是作为活体农药,与各种助剂的相 容性一般比化学农药差,某些助剂可能完全不能使 用,因此选择助剂时除选择其物理相容性外,还应该 注意与孢子的生物相容性.本试验以木霉菌分生孢 子为原药,筛选出适合的载体,润湿分散剂,稳定剂, 保护剂等助剂,加工成合格的可湿性粉剂,为工业化 生产提供理论依据. 1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1木霉菌分生孢子粉四川省农科院植保所 农业部科教司948项目"四川木霉菌种改良及微生 物农药试验示范"研究小组提供,含孢量1.46X10加 676西南农业21卷 个/g,活孢率82.19%,含水量2.28%,细度99% 过325目筛,外观为浅绿色粉末. 1.1.2载体硅藻土,凹凸棒土,白炭黑,A,A, 细度均过400目筛. 1.1.3润湿分散剂皂角粉,十二烷基硫酸钠 (K12),拉开粉BX,羧甲基纤维素钠(CMC—Na),木 质素磺酸钠(M-9),脂肪醇聚氧乙烯基醚(JFC),分 散剂s,十二烷基苯磺酸钠(DBSNa),渗透剂T,萘 或烷基萘甲醛缩合物磺酸盐(MF,NNO,CNF),农乳 700号系列,宁乳33号系列,宁乳34号系列,OP系 列. 1.1,4保护剂UV.1,UV2,抗坏血酸(VC),甲基 纤维素(MC). 1.2试验方法 1.2.1生物相容性测定孢子萌发率测定:将载体 以5mg/mL(润湿分散剂以1000,500Ixg/mL)的浓 度与融化的PDA培养基混合,灭菌后制成平板.取 0.1mL浓度为1000个孢子/mL的孢子悬浮液均匀 涂布在混合培养基平板上,以普通PDA平板作为对 照,每个处理重复4次,放置于28?人工气候箱内 12h黑暗12h光照培养,48h后计算菌落数. 菌丝生长速率测定:混合培养基制作方法同 上,用直径为4.5mm的打孔器取生长旺盛,菌龄相 同的木霉菌丝块,接种在混合培养基平板中心,对照 为普通的PDA平板,每个处理重复4次,每隔24h 测一次菌落直径. 1.2.2助剂筛选载体筛选:可湿性粉剂中的载 体,对制剂的性能影响很大.选择对孢子萌发和菌 落生长没有影响或者影响很小的载体,根据载体的 吸附容量,流动性,价格等方面的因素确定最佳载 体. 润湿剂筛选:采用尝试法,将润湿剂,载体和孢 子粉加工成可湿性粉剂测定润湿时间,筛选出润湿 时间小于1min的润湿剂.润湿时间按照GB/T 5451—2001测定J. 分散剂筛选:分散剂的选择是可湿性粉剂的关 键,尤其是像分生孢子粉这样难分散的原药.本实 验对分散剂采用粗筛和细筛两个过程.粗筛是将载 体与润湿分散剂,孢子粉加工成可湿性粉剂,目测分 散情况.分3个等级,优:在水中呈云雾状自动分 散,无可见颗粒下沉;良:在水中自动分散,有颗粒下 沉,下沉颗粒可慢慢分散或轻摇后分散;劣:在水中 不能自动分散,呈颗粒状下沉或絮状下沉,经强烈摇 动后才能分散J.细筛是将经过粗筛得到的优良 的分散剂按照GB/T148254006测定其悬浮率L5J, 确定最佳分散剂. 保护剂筛选:将保护剂添加到孢子悬浮液中 (对照不加保护剂),涂布在PDA平板上,每个处理 重复4次,在254nm紫外灯照射后,放置于28?人 工气候箱内12h黑暗12h光照培养,48h后计算菌 落数.按下式计算保护效能指数. 保护效能指数=(照射后活孢率一残存活孢 率)/(理论活孢率一残存活孢率). 1.2.3产品性能测定孢子萌发率测定,将孢子悬 浮液涂布在WA平板上,设4个重复,28?1oC12h 光照12h黑暗RH95%培养.24h后镜检,每个平 板所计孢子总数约500个. 润湿时间按GB/T5451-2001测定,?1min. 悬浮率按GB/T14825-2006测定,?75%.水分按 照GB/T1600-2001中共沸法测定J,<2%.pH值 按GB/T1600-93测定J.细度通过325目标准筛 >95%Is] .贮存期测定,将木霉菌可湿性粉剂制成 品在室温(1O,20)下贮存,每隔15d测定活孢 率,共测定150d. 1.2.4田间药效测定田间药效试验设在重庆璧 山县番茄灰霉病发生的蔬菜基地,防治对象为番茄 叶片灰霉病,对照药剂为5O%腐霉利可湿性粉剂 (Et本住友化学株式会社)和2O%百?霉威可湿性 粉剂(四川成都惠普生物工程有限公司).试验设 置8个处理,每个处理3次重复,随机排列,共24个 小区,每个小区面积13nl.每隔7d喷1次药,连 喷3次.于药前,每次喷药后7d调查,调查方法为 每个处理固定1O株,每株上中下调查1O张叶片,按 照以下分级标准记录病叶数和级值,计算病情指数 和防治效果. 分级标准(以叶片为单位): 0级:无病斑;1级:病斑面积占整个叶面积的5 %以下;3级:病斑面积占整个叶面积的6%,10 %;5级:病斑面积占整个叶面积的11%,25%;7 级:病斑面积占整个叶面积的26%,5O%;9级:病 斑面积占整个叶面积的5O%以上. 2结果与分析 2.1载体的筛选 实验结果表明,除载体白炭黑,凹凸棒土对孢子 活性有影响以外,其它载体与对照没有显着性差异 (表1).因此,硅藻土,A可以作为木霉菌分生孢 子制剂的载体. 2.2润湿剂的筛选 按照GB/T5451-2001J,筛选出5种润湿时间 小于1min的润湿剂.对5种润湿剂进行相容性检 测,其对木霉菌分生孢子萌发及生长速率的影响结 3期张敏等:5亿活孢子/克木霉菌可湿性粉剂的研制 表1载体对木霉菌分生孢子萌发及生长速率的影响 Table1GerminationandgrowthspeedofTr/chodermaconidiawith differentcarriers 注:数字后边小写字母相同表不在95%水平上无显着性差异. Note..Thesameletterbesidenumberindicatedtherearenosignifi— cantdifferenceson95%leve1. 果显示(表2),B,B与对照无显着性差异. 2.3分散剂的筛选 通过目测分散情况,筛选出较好的分散剂.分 散剂定性评价结果见表3. 将经过粗筛得到的6种分散剂C,C,NNO, CC.与孢子进行相容性检测,对木霉菌分生孢子 萌发及菌落生长速率影响结果见表g. 从上述结果可以看出C,NNO,C.与对照没有 显着性差异. 将载体,润湿剂B和经过粗筛得到的3种分散 剂及孢子粉,各加工成可湿性粉剂,测定其悬浮率. 分散剂筛选结果见表5. 2.4保护剂的筛选 从实验结果看出(表6),在被紫外线照射1min 后,uV一1表现出了良好的保护作用,其余3个的保 护作用不明显,2min后uV.1仍具有保护作用,UV-2 表2润湿剂对木霉菌分生孢子萌发及生长速率的影响 Table2GerminationandgrowthspeedofTr/chodermaconidiawith differentwettingagents (p,g/mL)C olony ?】 表3分散剂粗筛定性评价结果 Table3Qualitativeevaluationresultsofdispersingagentsafter roughscreening 注:优:在水中呈云雾状自动分散,无可见颗粒下沉,用"+"表 示.良:在水中自动分散,有颗粒下沉.下沉颗粒可慢慢分散或 轻摇后分散.用"+一"表示.劣:在水中不能自动分散,呈颗粒 状下沉或絮状下沉,经强烈摇动后才能分散,用"一"表示. Note:Inthetable.'+'standsforthedispersingagentsin cloudinessstateandnosubsidenceparticleshown.Inthetable,'+ 一 ' standsforthedispersingagentsamautomaticdiffusionandthere aresomesubsidenceparticlesinwaterwhichcanbediffusedby shook.Inthetable,'一'standsfordispersingagentsCannotdif- fusedautomaticallyandinflocculationwhichCanbediffusedby shookstrongly. 失去保护作用,抗坏血酸和甲基纤维素保护作用不 明显,3min后uV.1仍持续其保护作用,甲基纤维 素保护作用不明显. 2.5pH值调节 资料表明木霉菌在pH值5—6时其菌丝生长 最快,孢子萌发率最高?.本配方中用柠檬酸,将 pH值调节到5—6. 2.6产品性能指标测定 根据上述研究结果配制成5亿活孢子/克木霉 表4分散剂对木霉菌分生孢子萌发及生长速率的影响 Table4GerminationandgrowthspeedofTr/chodermaconidiawith differentdispersingagents 678西南农业21卷 表5分散剂细筛试验结果 Table5Evaluationresultsofdispersingagentsafterdetailedscreening 菌可湿性粉剂样品,并进行各项性能指标测定.萌 发率I>75.26%,润湿性<1min,悬浮率76.73%, 水分?1.78%,细度(通过325目标准筛)>199%, pH值为5—6.室温(10—20?)下贮存,每15d测 定活孢率,150d后活孢率与贮前没有显着性差异. 检测结果表明,所配制的可湿性粉剂的性能指标符 合农药制剂商品要求. 2.7药效试验 用上述试验得到的5亿活孢子/克木霉菌可湿 性粉剂进行田间药效试验,各次调查的平均防效结 果见表7. 从上表可以看出,由于生物农药作用速度慢,第 1次和第2次施药后5亿活孢子/克木霉菌WP的平 均防效都低于对照药剂,第3次施药后5亿活孢子/ 克木霉菌WP600,800,1000倍的平均防效与对照 没有显着性差异,且5亿活孢子/克木霉菌WP600 倍防效最好. 表6保护剂对木霉菌分生孢子的保护效果 Table6EffectofdifferentprotectantsonsurvivalofTr/chodermaeonidia 保护效能指数Protectionperformanceindex 保护剂Protectant—— 1min2min3min 3讨论 在供筛选的5种载体中,硅藻土和载体A与孢 子的生物相容性最好,考虑载体的物理性质,本配方 采用A作为载体.在润湿剂的筛选中,润湿剂B, B与对照没有显着性差异,经过进一步筛选,选用 B作为润湿剂,且在比例为4%时润湿时间最短. 分散剂经粗筛后,筛选出4种与孢子相容性比较好 且分散效果良好的分散剂,经过测定其悬浮率,分散 剂c的悬浮率最高,在比例为6%时达70%以上, 添加0.2%稳定剂E后悬浮率可达到75%以上.4 种保护剂中,uV一1持续保护效果最好,确定uV一1为 本配方的保护剂,比例为0.3%.因此,5亿孢子/ 克木霉菌WP最佳配方确定为:润湿剂B4%,分 散剂C6%,保护剂uV一10.3%,稳定剂E0.2%, 载体A补足100%. 5亿活孢子/克木霉菌WP防治番茄灰霉病的 田间药效中,木霉菌600,800,1000倍的平均防效与 对照没有显着性差异,考虑成本因素,用于田间防治 番茄灰霉病时可使用800,1000倍液. 表75亿活孢子/克木霉菌WP对番茄灰霉病的田问防治结果 Table7EffectofTr/chodermawettablepowderwitheachgram500millionlivingconidiainco ntrolofBotrytiscinereaPersinfield 3期张敏等:5亿活孢子/克木霉菌可湿性粉剂的研制679 木霉菌活分生孢子与化学农药相比,其制剂加 工更复杂.其一,分生孢子是颗粒物质,是不溶于水 的生物体,它的颗粒性和疏水性直接影响制剂的润 湿性,分散性和悬浮性等物理性能.其二,分生孢子 对外界环境因素如温度,湿度和光照等比较敏感,制 剂贮存稳定性差,田间持效期短,作用速度慢.所以 在选择助剂时还要考虑选择一些特殊助剂,如保护 剂,稳定剂等.其三,活分生孢子与各种助剂的相容 性一般比化学农药都差,某些助剂可能完全不能使 用,因此选择助剂时要考虑与分生孢子的生物相容 性?.其四,分生孢子活性会受气流粉碎机粉碎压 力的影响,因此,在加工过程中须先将各助剂经气流 粉碎后,再与分生孢子粉充分混合. 参考文献: [1]李作森,何月秋,夏贤仁.5个木霉菌株的抑菌谱及部分生物学特 性[J].云南农业大,2004,19(3):267—271. 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