动物细胞克隆技术研究进展及应用

动物细胞克隆技术研究进展及应用 摘要: 动物克隆即指通过无性繁殖方式由单个动物细胞产生的遗传性状相同的 个体。其制作过程主要是利用细胞核移植技术来完成的。本文介绍了动物克隆技 术的研究历史和发展现状,简要概括了细胞核移植技术以及它的应用,并对其应 用前景作一展望。 关键词:动物克隆 无性繁殖 动物细胞 核移植 Animal cells cloned technology research and application Animal cloning which through the asexual reproduction by a single Abstract: animal way of cells to produce genetic traits were the same individual. The production process is basically used the nuclear transfer technique to finish. This paper introduces the animal cloning technology the research history and current developing situation, this article has summarized the nuclear transfer technique and its application, and its potential application prospect. animal cloning asexual reproduction animal cell nuclear transfer Key words: 1.前言 克隆是英文"clone"或"cloning"的音译，而英文"clone"则起源于希腊文"Klone"，原意是指幼苗或嫩枝，以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，如扦插和嫁接。中文也有更加确切的词达克隆，“无性繁殖”、“无性系化”以及“纯系化”。 克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织后代的过程。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。 同一克隆的所有成员的遗传构成是完全相同的，例外仅见于有突变发生时。自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆，例如:同卵双胞胎实际上就是一种克隆。然而，天然的哺乳动物克隆的发生率极低，成员数目太少(一般为两个)，且缺乏目的性，所以很少能够被用来为人类造福，因此，人们开始探索用人工的来生产高等动物克隆。 2.生产克隆动物的方法 第一种方法是用人工方法将 2~ 16 细胞胚胎或桑椹胚、 囊胚分割为两部分生产孪生动物。利用该技术已经获 得 了 小 鼠、 山 羊、绵 羊、牛 和马 的 孪 生 后 代 (Willadson, 1982) , 但用此方法生产的克隆动物的数量有限,一般仅能得到二个孪生后代。 第二种方法是利用胚胎干细胞( ES细胞)。ES细胞在体外具有发育的全能性, 并且当将它导入早期胚胎时能够形成嵌合体( Evans 和 Kaufman, 1981)。种系嵌合体成熟以后, 人们可获得由 ES细胞繁育来的动物(Bradley等, 1984)。在小鼠的研究中, 小鼠的 ES细胞和基因打靶技术已经成为常规技术,用此技术人们可将所希望的基因变化导入基因组( Hooper, 1992)。也有其它动物 ES 细胞的研究报道, 例如金黄地鼠 ( Doetshman等, 1988)、 美洲水貂( Sukoyan 等, 1992)、兔( Graves 和 Moreadith, 1993)、 大鼠( Iannaccone 等, 1994)、动物 ( Wheeler, 1994 )、恒 河 猴 ( Thomson 等, 1995)、 牛 ( Strelchenko, 1996 ) 和 人 类 ( Thomson 等, 1998)。有关大鼠( Iannaccone等, 1994)、 动物(Wheeler, 1994)和兔(Schonjans 等, 1996) ES细胞产生嵌合体得到确证的报道很少, 而且所得的嵌合体并非是种系嵌合体。因此,目前只有小鼠 ES细胞产生了真正的克隆动物或者获得目标突变。 第三种方法尽管利用 ES细胞进行核移植但不通过嵌合体步骤而完全通过细胞培养获得动物, 可是用这种方法人们还没有得到克隆动物。然而,最近通过诱导细胞离开正常分裂周期而进入静止状态或 G0 状态的方法, 从已经建立的胚胎细胞系的细胞中产生出一头羔羊( Campbell 等, 1996)。这个结果非常出乎人们的意料, 因为所用 的培养细胞不是 ES细胞,而是已分化的上皮细胞, 这就提高了其它细胞核移植以后细胞核重排并产生后代的可能性。在后来一项研究中,人们从胎儿成腺胃细胞和成年动物乳腺细胞得到了克隆羊(Wilmut等, 1997)。 3.克隆技术的发展 克隆技术已经历了三个发展时期:第一个时期是微生物克隆，即由一个细菌复制出成千上万个和它一模一样的细菌而变成一个细菌群。第二个时期是生物技术克隆，如DNA克隆。第三个时期就是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。 4.生产克隆的必需技术 克隆的生产依赖于以下几项基本的技术,但是迄今尚没有一项技术发展到非常完善的地步, 这就阻碍了克隆生产体系的发展。各项技术的发展现状如下所述。 4.1卵母细胞的体外成熟、 受精和培养 到目前为止未成熟的动物卵母细胞通过体外成熟、受精和培养而发育到囊胚期是非常困难的。最大的障碍之一是体外受精很少能得到正常的受精卵。几乎所有从卵巢卵泡中释放出的卵母细胞都能够在培养液中恢复减数分裂到达 M?期。虽然体外受精时精子能穿透成熟卵母细胞, 但是在培养液中人们能够观测到雄原核的形成率较低而多精入卵率较高。 精子穿透卵但不能形成雄原核是因为卵母细胞细胞质的成熟不完全,因此对成熟培养的条件进行了改善。动物卵母细胞的成熟培养 液中一般添加血清, 例如胎牛血清( Mattioli 等, 1998a, b; Yoshida等, 1990; Galeati 等, 1991;Wang等, 1991)、 新生犊牛血 清( Nagai 和 Moor, 1990 ) 和动物血 清( Eng, 1986; Zheng和 Sirard, 1992)。然而, 据报道, 在含 FSH的改良 Krebs- Ringer 碳酸氢盐溶液中添加胎牛血清,能抑制动物卵母细胞的成熟, 并且不能增高体外受精时精子穿透后雄原核的形成率( Naito 等, 1988)。相反,当卵母细胞在添加有 FSH 的动物卵泡液中体外成熟受精时, 被精子穿透的卵母细胞有 81%形成了雄原核。Funahashi 和 Day( 1993a)也报道, 在组织培养液mTCM- 199 中添加 10%胎牛血清或者新生仔动物血清,看来对胞质的成熟有害, 因为雄原核的形成率低于在含 10%动物卵泡液或 0 . 4%聚乙烯醇的培养液中雄原核的形成率。在小鼠( Calvin 等, 1986) 和金黄地鼠 ( Perreault等, 1988; Perreault, 1990) 卵母细胞的研究表明, 卵母细胞成熟时谷胱苷肽的合成是雄原核形成的前提条件。一系列试验( Yoshida 等, 1992, 1993a, b; Yoshida, 1993)清楚地表明, 用半胱氨酸作为谷胱苷肽的底物添加到成熟培养液中,对于精子穿透卵母细胞以后动物雄原核的形成有重要作用。人们将动物卵母细胞培养于含有促性腺激素和雌二醇不同组合的成熟培养液中, 因为有研究报道这些组分有益于动物卵母细胞的核 成 熟 ( Meinecke 和 Meinecke - Tillman, 1979; Racowsky 和 McGaughey, 1982 )。 Funahashi 和 Day ( 1993b)报道, 当卵丘卵母细胞的复合体培养在含有孕马血清促性腺激素、 人绒毛膜促性腺激素和雌二醇的培养液中培养 20 小时后转移到不含激素的培养液中再培养 20 小时,雄原核 的形成率大大提高。 有的学者认为, 控制精子处理液的条件和卵母细胞受精培养的条件, 能够降低多精入卵率。Nagai 和Moor( 1990)研究表明,精子和输卵管细胞一起预先孵育 2. 5 小时能够降低多精入卵现象, 同时精子的穿透率并没有明显降低。该试验的结果还表明,在精子预孵育期间, 在含 0 . 4%的牛血清白蛋白的 mTCM- 199培养液中加入动物卵泡液能降低多精入卵率( Funahashi和 Day, 1993c)。最近报道,不用改进的 Tris 缓冲液作为受精培养液对精子进行预培养, 多精入卵现象被抑制( Abeydeera等, 1997)。 动物体外囊胚生产的另一个问题是受精的卵母细胞发育到 4 细胞期时发生阻滞(Davis 和 Day, 1978)。为了克服这种发育阻滞,人们研究了能够对动物体内受精卵母细胞体外发育产生影响的各种因素。草酰乙酸、磷酸烯醇丙酮酸、 丙酮酸或乳酸可作为小鼠胚胎早期卵裂时期唯一的能量来源( Brinster, 1965)。培养液中一般都加有乳酸和丙酮酸, 并且据认为乳酸对于正常发育是必需的( Bigger, 1987)。然而,对于动物来说, 乳酸会抑制 胚胎 的 发育 ( Davis 和 Day, 1978; Stone 等, 1984;Davis, 1985) ,并且胚胎发育既不需要乳酸,也不需要丙酮酸( Petters 等, 1990; Petters 和 Reed, 1991)。在缺少乳酸和丙酮酸的情况下, 葡萄糖和谷氨酰胺支持胚胎发育到桑椹胚和囊胚阶段( Petters 等, 1990)。亚牛黄酸和牛黄酸各自单独加入或一起加入能够显著促进胚胎的体外发育(Petters 和 Reed, 1991)。根据这些研究结果, 现已设计出一种被称为 NCSU- 23 的培养液, 用于将动物的体内受 精卵母细胞发育到囊胚(Pet-ters和 Reed, 1991; Reed等, 1992)。NCSU- 23 不仅可用于培养体外产生胚胎的培养, 而且可用于未成熟卵母细胞的体外成熟培养(Wang等, 1997)。添加透明质酸可刺激体内受精胚胎( Miyano等, 1994)和电激活卵母细胞(Kurebayashi等, 1995)的囊胚形成或者已在体外成熟的受精胚胎的囊胚形成。据最近的研究报道,牛血清白蛋白的一些组分对动物胚胎发育有重要影响:基本上,无脂肪酸的牛血清白蛋白有利于动物胚胎发育,而牛血清白蛋白- V组分则有害于动物胚胎发育( Do -brinsky 等, 1996)。在晚期桑椹胚或早期囊胚期添加胎牛血清能促进囊胚的孵化, 尽管在此之前加入胎牛血清对胚胎发育是有害的。 4.2核移植 与胚胎基因组激活后的核重组所得的动物核重组胚胎,其体外发育能力很有限, 并且到目前作为核移植的结果而产生的仔动物只有一头(注) ( Prather等, 1989)。这头仔动物来源于 4 细胞卵裂球和 M2 期卵母细胞的融合胚,是已经移植的 88 个重组胚之一。据认为, 8~ 16细胞期胚胎的核与成熟去核卵母细胞重组的动物核移植胚胎在体外的分裂率为 36%43%, 但发育到桑椹胚以后的比率仅为 4 . 5~ 7%( Saito 等, 1992; Terlouw 等, 1992)。最近据 Nagashima等( 1997)报道, 通过利用预激活的卵母细胞作为受体胞质,电激活 6小时后, 诱导卵裂球和胞质融合, 28%重组核移植胚胎(核供体来源于桑椹期)能发育到桑椹胚期, 15%发育到囊胚。 4.3胚胎的冷冻 重组胚胎必须移植到受体母动物体内才能获得克隆后代,但是并非任何时间都有合适的受体, 因为这要求胚胎的发育阶段和受体的妊娠阶段同步。因此, 很有必要发明一种能使胚胎保存到移植时期而不影响其生活力的技术。动物孵化囊胚的冷冻保存已获成功, 并获 产仔( Kashiwazaki 等, 1991; Fujino 等, 1993)。但时至今日具有完整透明带的动物胚胎仍然不能成功地进行冷冻。早先的研究表明, 当温度降到 5~ 10 & 时动物胚胎会发生变性(Wilmut, 1972; Polge等, 1974) , 因而 15?曾被认为是损害的临界温度( Polge, 1977)。胚胎脂质膜的损害被认为是动物胚胎降温和冷冻后不能存活的主要原因( Polge 和 Willadson, 1978; Wilmut, 1986)。此外,据认为, 动物胚胎中高浓度的脂类可能导致细胞内冰晶形成不均匀,这被认为是动物胚胎冷冻和冻融后发生变性的主要原因( Toner等, 1986)。最近的研究显示,早期卵裂阶段的动物胚胎去除细胞质中的脂质后能耐受冷冻保存(Nagashima, 1995)。 4.4胚胎移植 到目前为止,将体外未成熟卵母细胞所获得的囊胚进行胚胎移植, 还没有得到动物的移植后代。体外或体内受精的卵母细胞在体外发育到囊胚后,移植到受体母畜中, 体内受精卵母细胞的胚胎能够产生后代, 但是来源于体外受精的卵母细胞移植后没有妊娠( Rath等, 1995)。另一方面的研究结果表明, 来源于体外成熟和受精卵母细胞的胚胎在 2细胞期移植到受体母畜体内能够产生后代( Funahashi 等, 1997)。这些研究结果表明, 如果体外成熟、 受精和培养体系中任何 一个体系不完备, 卵母细胞或胚胎的发育能力在各个时期都将受到影响。 5.动物克隆技术在生产上的应用 5.1动物克隆技术在畜牧业生产上的应用 利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可大大缩短育种年限，加速动物育种进程。在动物杂种优势利用方面，可增强选育种畜的性状稳定性，提高育种效率。 5.2动物克隆技术用于拯救濒危动物 克隆技术在抢救濒危珍稀物种、保护生物多样性方面可发挥重要作用。以濒危稀有动物的体细胞为供核细胞进行种间核移植，可以解决对濒危稀有动物卵母细胞成熟不够、卵母细胞数量不足等问题。陈大元等、Lanza等和Vogel在这些领域做出了艰苦卓绝的工作，受到广泛关注。 5.3克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道,是否合法,经济是否合算, 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒 感染的干挠素，等等。 5.4克隆技术与遗传育种 克隆技术能够快速复制出优良的动物品种. 例如,一头高产奶牛, 正常情况下, 一生所能生产的母牛头数是很有限的, 而且后代不纯, 不能保证是高产母牛. 一般说来, 要培育出一个纯度达 98% 的品系, 需要进行 20 代的兄妹间交配. 在牛, 这就意味着需要100 年的时间. 而且, 长时间的近亲交配会导致动物生育能力的明显降低. 但是, 利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物,就可以避免在自然条件下选种受动物育种周期和生育效率的限制, 从而大大缩短育种年限, 提高育种效率.通过核移植产生的重构胚能否完成整个发育过程的问题解决此问题的关键在于移入的细胞核能否在受体细胞质的作用下进行正确的重新编程, 使重构胚成为全能性细胞, 在适宜的环境条件下如正常胚胎那样分裂、 分化、 发育形成个体. 5.5减少或避免供体线粒体的带入 在核移植过程中,供体核会把一部分细胞质连同带入, 于是, 移核胚胎的线粒体就成为杂合型, 既有供核细胞来的, 也有受体细胞质来的, 因此, 核移植的克隆动物实际上是一种遗传嵌合体. 为此, 应亟待解决动物克隆中的这一方面的问题, 尽量减少或避免供体线粒体的带入。 结束语 哺乳动物克隆技术近几年取得了一些突破性进展, 它在发育生物学、 遗传学及医药卫生、 畜牧、 食品等相关学科方面均显示出广阔的发展前景. 但存在的问题不能忽视. 相信在各国科学家的不懈努力下, 哺乳动物克隆的研究会走向一个新的台阶, 取得更加辉煌的成绩, 以造福于社会, 造福于人类. 参考文献 [1] .谭景和. 动物克隆技术研究的历史、 现状与展望[ J] . 动物医学进展, 2003, 24(2) : 1~ 6. 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