HPLC法测定虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的含量

HPLC法测定虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的含量 HPLC法测定降酶片虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的含量 降酶片由虎杖、白花舌蛇草等中药组成。虎杖为蓼科属多年生草本植物，药用部位为根及根茎。虎杖始载于《名医别录》，列为中品，具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰等功效;用于关节痹痛，湿热黄疸，经闲，徵瘕，水火烫伤，跌扑损伤，痈肿疮毒，咳嗽痰多。虎杖中主要含蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类等多酚性化合物。我们采用HPLC法测定虎杖中白藜芦醇和虎杖苷，为降酶片的质量的制定提供了实验依据。本法专属性强，操作简便，精密度高，重现性好，能更好的控制降酶片的质量，保障临床应用的有效性及稳定性。 1.仪器与试剂 UV2000高效液相色谱仪;SP8800ternary HPLC pump(Spectra-Physics);虎杖苷对照品(批号 1)，白藜芦醇对照品(批号 11)由中国药品生物制品检定所提供。降酶片由本院制剂室提供，批号060820、060821、060822。 2.方法与结果 2.1色谱分析条件:Irregular C柱 (4.6×250mm 5μ);流动相:乙腈:水(25:18 -175);流速:1.0ml?min;柱温:35?;检测波长:306nm;进样量:20μl;理论塔板数以虎杖苷峰计不低于3000，以白藜芦醇峰计不低于3000。 2.2溶液的制备 2.2.1对照品溶液的制备 精密称取虎杖苷对照品8.04mg置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻 -1度，摇匀得浓度为0.0804mg?ml虎杖苷对照品溶液。 精密称取白藜芦醇6.12mg置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度， -1摇匀，得浓度为0.0612mg?ml的白藜芦醇对照品溶液。 2.2.2供试品溶液的制备 取自制降酶片20片，研匀，取50mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加甲醇适量，超声30分钟，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，续滤液备用。 2.3标准曲线的制备: -1精密量取浓度为0.0804mg?ml虎杖苷对照品溶液0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、 4.0ml、5.0ml于10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，按上述色谱条件测定。以虎杖苷的浓度为横坐标(X)，其峰面积为1纵坐标(Y)，绘制标准曲线。计算得其回归方程Y=38364300X—5194.1，111 -1r=0.9999。虎杖苷在0,0.04020mg?ml与峰面积呈良好的线性关系。 -1精密量取浓度为0.0612mg?ml的白藜芦醇对照品溶液0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml于10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，按上述色谱条件测定。以白藜芦醇的浓度为横坐标(X)，其2峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。计算得其回归方程Y=85777166 X—222 -1,0.03060mg?ml与峰面积呈良好的线性关系。 2272.48，r=0.9999。白藜芦醇在0 2.4空白实验 精密称取按制备工艺制备的却虎杖的阴性样品16.7mg按2.2.2供试品溶液的制备方法制备。阴性样品HPLC色谱中，在虎杖苷、白藜芦醇峰处无峰，明阴性样品不干扰测定。 2.5精密度试验 -1取虎杖苷标准曲线项下浓度为0.02412mg?ml对照品溶液，按上述色谱条件，重复进样6次，计算RSD=0.36%。 -1取白藜芦醇标准曲线项下浓度为0.01836mg?ml的对照品溶液，按上述色谱条件，重复进样6次，计算RSD=0.87%。 2.6稳定性试验 取批号为060820样品，按2.2.2项下供试品溶液的制备方法，按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8小时进样，测定。测得虎杖苷峰面积的RSD=0.07%;白藜芦醇峰面积的RSD=0.56%，表明本品在8小时内测得的结果是稳定的。 2.7重现性试验 取批号为060820样品，按2.2.2项下供试品溶液的制备方法制备，按上述色谱条件测定，测得虎杖苷、白藜芦醇含量。测得虎杖苷平均含量为24.22%，RSD=1.05%。白藜芦醇平均含量为18.61%，RSD=1.42%。 2.8加样回收率试验 取批号为060821样品，精密称取25mg，重复5份，分别加虎杖苷对照品 6.05mg，白藜芦醇对照品4.65mg，按2.2.2项下供试品溶液的制备方法制备，按 上述色谱条件测定，计算回收率。测得虎杖苷平均回收率为100.44%， RSD=1.67%;白藜芦醇平均回收率为101.02%，RSD=1.86%。 2.9样品含量测定 取批号060820、060821、060822的3批样品(每批平行3份)，按2.2.2项 下供试品溶液的制备方法制备，按上述色谱条件测定。 表1 降酶片中虎杖苷含量测定的结果(n=3) Table1 Analysis of content of Peceid in Jiangmei Tablet (n=3) -1批号 虎杖苷的含量(mg?g) RSD(%) 060820 24.25 0.49 060821 24.48 0.32 060822 24.23 0.30 表2 降酶片中白藜芦醇含量测定的结果(n=3) Table 2 Analysis of content of Resveratol in Jiangmei Tablet (n=3) -1批号 白藜芦醇的含量(mg?g) RSD(%) 060820 18.62 1.18 060821 18.57 0.54 060822 19.08 0.36 A B C D 图1 虎杖苷对照品(A)、白藜芦醇对照品(B)、供试品(C)和阴性对照(D)的色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of Peceid reference substance (A), Resveratol reference substance (B),Sample(C)and Sample without Polygonum cuspidatum Sieb (D) 3.讨论 3(1一般白藜芦醇和虎杖苷都能同时存在于植物中，二者在一定外界条件下会 相互转化。目前的研究表明反式异构体是其活性成分，现一般测定反式的白藜芦 醇和虎杖苷的总量作为评价标准。在葡萄及葡萄酒中同时发现了四种异构体，而 目前虎杖中的顺式白藜芦醇及其苷鲜见报道。因此用反式白藜芦醇及虎杖苷为指 标性评价虎杖质量是很有必要且合理的。 3(2本文建立了用HPLC法测定虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的分析方法。选用甲 醇超声提取30min为最佳提取方式，流动相为乙腈,水(25:75，V/V)，检测 ，-1波长306nm，流速1.0ml?min，柱温35?，同时测定虎杖中白藜芦醇和虎杖 苷，分离度好，杂质峰干扰少，完全出峰时间在25min内。该方法快速、准确、 可靠。